Misurare la tensione indotta a membrana con Di-8-ANEPPS

Riepilogo

Campo elettrico esterno induce una tensione sulla membrana di una cellula, chiamata potenziale di membrana indotta (ΔΦ). Usando il potenziometrica tintura di-8-ANEPPS, è possibile misurare la ΔΦ modo non invasivo. Questo video mostra il protocollo per la misurazione ΔΦ utilizzo di-8-ANEPPS.

Abstract

Posizionamento di una cella in un campo elettrico esterno provoca un locale all'interno di ridistribuzione della carica e al di fuori della cellula in prossimità della membrana cellulare, con una conseguente tensione attraverso la membrana. Questa tensione, chiamata tensione indotta membrana (tensione transmembrana anche indotta, o indotto differenza di potenziale transmembrana) e indicato con ΔΦ, esiste solo fino a quando il campo esterno. Se la tensione a riposo è presente sulla membrana, la tensione indotta sovrappone (aggiunge) su di esso. Usando uno dei coloranti fluorescenti potenziometrico, come di-8-ANEPPS, è possibile osservare le variazioni della ΔΦ sulla membrana cellulare e di misurare il suo valore non invasivo. di-8-ANEPPS diventa fluorescente quando fortemente legato al doppio strato lipidico della membrana cellulare, con il cambiamento delle intensità di fluorescenza proporzionale alla variazione di ΔΦ. Questo video mostra il protocollo per la misurazione ΔΦ utilizzo di-8-ANEPPS e dimostra anche l'influenza della forma cella l'ampiezza e la distribuzione spaziale della ΔΦ.

Protocollo

Parte I: passi preliminari

1. In questo esperimento cinese linea di cellule ovariche di criceto (CHO-K1) è usato. Le cellule sono placcati in Lab-Tek II camere (2 pozzi, 4 cm ² ciascuno) (Nalge Nunc, Germania) a ~ 0.7x10 ⁵ cellule / ml in HAM-F12 terreno di coltura integrata con l'8% di siero fetale bovino, 0,15 mg / ml L-glutamina, 16 mg / ml di gentamicina (tutti da Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania), e 200 unità / ml Crystacillin (Pliva, Zagabria, Croazia), e incubate nel 5% CO ₂ a 37 ° C. In alternativa, le cellule possono anche essere placcato in vetro scivola # 1 coperchio (0,13-0,16 mm di spessore), spalmato con un adesivo cellulari come polilisina.
2. Incubare le cellule nel loro terreno di coltura. L'incubazione della durata di 2-4 ore le cellule che le rese sono ancora meno sferica, ma fermamente attaccato alla superficie con una piccola parte della loro membrana. In alternativa, dopo 16 a 20 ore di incubazione, le cellule sono completamente attaccati alla superficie e avere forme più complesse, ma la maggior parte di loro non sono ancora dividere.
3. Preparare una soluzione stock 10 mM di di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) con l'aggiunta di 843 ml di DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania) a 5 mg del colorante nel flacone Invitrogen originale. La soluzione madre può essere conservato in frigorifero a 4 ° C per diversi mesi. Prima di iniziare gli esperimenti, scaldare la soluzione fino a quando i cristalli di DMSO sciogliere.
4. Alcune linee cellulari possono richiedere l'uso di Pluronic per facilitare l'inserimento colorante nella membrana cellulare. Pluronic possono essere acquistati nella soluzione madre al 20% in DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, USA), o una soluzione madre della stessa concentrazione può essere preparata sciogliendo Pluronic in DMSO. Soluzione madre di Pluronic può essere conservato a temperatura ambiente.

Parte II: Caricare le cellule con di-8-ANEPPS

1. Mescolare 3 ml di 10 mM di-8-ANEPPS e 2,5 ml di 20% Pluronic in 1 ml della modifica Spinner (calcio-impoverito versione) del smem Medium minimo (medio M8167 o M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania ) in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Questo produce una "soluzione di caricamento" contenente circa 30 micron di-8-ANEPPS e 0,05% del Pluronic. Per altri tipi di cellule, i loro terreni di coltura nativa può essere usato al posto di smem.
2. Sostituire il terreno di coltura nel laboratorio-Tek da camera con la soluzione di carico. Trasferimento della camera al frigorifero per 10 minuti a 4 ° C. A questa temperatura, l'interiorizzazione del colorante attraverso la membrana plasmatica è in gran parte inibita.
3. Dopo la colorazione, lavare delicatamente il colorante in eccesso due o tre volte con smem puro.
4. Lascia 1,5 ml di smem nella camera.

Parte III: Esperimento e acquisizione delle immagini

1. Le cellule sono osservati utilizzando un microscopio a fluorescenza (nel nostro caso Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Germania) dotato di un obiettivo ad immersione olio (x63, NA 1,4), un monocromatore (policroma IV, Visitron, Germania) ed una camera CCD raffreddata (VISICAM 1280, Visitron, Germania). Le immagini sono acquisite con MetaFluor 7.1.1 e trattati in MetaMorph 7.1.1 (sia Molecular Devices, Downingtown, PA, USA), ma altri software di acquisizione simili possono anche essere utilizzati. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione nel software di acquisizione a 490 nm e scegliere un filtro adatto emissione per ANEPPS, per esempio, un filtro passa-banda centrata a 605 nm (605/55m, dicroiche 565 DCXR, Chroma, Rockingham, VT, USA). Se un monocromatore non è disponibile, un filtro di eccitazione centrato a 490 nm può essere utilizzato.
2. Posizionare la camera con le cellule sul palco microscopio, posizionare gli elettrodi sul fondo della camera e collegarli al generatore di impulsi. Il mezzo dovrebbe coprire gli elettrodi.
3. Per mantenere la vitalità cellulare e ridurre il riscaldamento, l'impulso dovrebbe essere di ampiezza sufficientemente basso e breve durata. In questo esperimento un impulso quadrato con ampiezza 35 V e 50 ms di durata (sufficientemente basso per evitare elettroporazione) è generato con una tensione continua e una misura microprocessore dispositivo switcher. In alternativa, un generatore di impulsi commerciale, come 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, USA) collegato ad un amplificatore o uno stimolatore commerciale, come S88 (Erba, West Warwick, Rhode Island, USA), può essere utilizzato. L'impulso viene consegnato a due parallele Pt / Ir elettrodi a filo da 0,8 mm di diametro e 4 mm di distanza tra loro, creando un campo elettrico di circa 88 V / cm tra gli elettrodi e ΔΦ indurre. La distribuzione di campo esatta tra gli elettrodi utilizzati in questo esperimento è descritto altrove [1].
4. Trova le cellule di interesse. Applicare un singolo impulso elettrico o una sequenza di impulsi. Per ogni impulso, di acquisire due immagini a fluorescenza: uno immediatamente prima dell'impulso (l'immagine di controllo), e uno durante l'impulso (l'immagine del polso). A causa della scarsa risposta di di-8-ANEPPS, i cambiamenti nella fluorescenza sono difficili da distinguere ad occhio nudo e diventano evidenti only dopo l'elaborazione. La consegna degli impulsi deve essere sincronizzato con l'acquisizione delle immagini, che è una caratteristica del software di acquisizione. Per evitare possibili fotodecolorazione e riscaldamento, l'illuminazione può essere limitata alla durata dell'impulso.

Parte IV: L'elaborazione delle immagini e analisi

1. Aprire le immagini nel software MetaMorph. Per ogni impulso, sottrarre lo sfondo sia il controllo e l'immagine di impulsi.
2. Scegliere una cella e impostare la regione di interesse in modo che corrisponda alla membrana. Misurare la fluorescenza lungo questa regione a immagine e di controllo degli impulsi e trasferire i valori di un foglio di calcolo.
3. Per ogni impulso, sottrarre i dati di controllo a partire dai dati di impulsi, e dividere il risultato per i dati di controllo per ottenere le relative variazioni di fluorescenza. Se una sequenza di impulsi viene applicata, i valori di fluorescenza relativi cambiamenti determinati per ciascun impulso può essere media per ottenere una misurazione più affidabile.
4. Trasformare le variazioni relative fluorescenza in ΔΦ utilizzando una curva di calibrazione. Una stima approssimativa di questa curva possono essere ottenute dalla letteratura, ma per una maggiore precisione, deve essere misurato per ciascuna configurazione particolare. Per le cellule e la configurazione utilizzata in questo esperimento una riduzione del 6% in fluorescenza corrisponde ad un aumento del 100 mV in ΔΦ [2].
5. Infine, la trama la tensione in funzione della lunghezza dell'arco relativo in un pacchetto di software grafici come Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA), Terreno Sigma (SYSTAT Software Inc., San Jose, CA, USA), o origine (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA). La curva può anche essere lisciate con un filtro adatto, come ad esempio il filtro media mobile.

Discussione

Misure della membrana indotta (transmembrana) tensione, ΔΦ, può essere importante in varie impostazioni sperimentali, come studi di canali voltaggio-dipendenti della membrana, la propagazione del potenziale d'azione, la stimolazione delle cellule cardiache, o membrana elettroporazione di cellule [3, 4, 5, 6 , 7]. Con forme semplici cellule, ΔΦ può essere calcolato analiticamente. Ad esempio, per una cellula sferica, ΔΦ è data dalla equazione della Schwan s, in cui si afferma che la tensione è proporzionale alla forza del campo e le dimensioni delle cellule e segue la funzione coseno lungo la membrana [8, 9]. Per ulteriori forme cellulari complicati, ΔΦ possono discostarsi notevolmente dal coseno e deve essere determinato o in forma numerica, utilizzando un computer [2, 10, 11], o sperimentale, utilizzando un colorante potenziometrica [12, 13, 14, 15].

Uno dei coloranti potenziometrico ampiamente utilizzato per questo scopo è di-8-ANEPPS (di-8-butil-amino-naftil-etilene-piridinio-propil-solfonato), un colorante veloce con eccitazione e spettri di emissione dipende dal potenziale di membrana, non invasivo che permette osservazioni delle variazioni delle ΔΦ sulla membrana cellulare e di misurare il suo valore. In questo video, ci mostrano un approccio sperimentale per la determinazione di ΔΦ utilizzando di-8-ANEPPS.

Il colorante è stato sviluppato dal professor Leslie Loew e colleghi [13, 14] presso l'Università del Connecticut e appartiene alla classe di risposta rapida coloranti. di-8-ANEPPS è nonfluorescent in acqua e diventa fortemente fluorescenti quando si incorpora nel doppio strato lipidico della membrana cellulare. Un cambiamento nei risultati ΔΦ in un cambiamento della distribuzione di carica intramolecolare e corrispondenti cambiamenti nel profilo spettrale e l'intensità di fluorescenza del colorante è. L'intensità della fluorescenza di di-8-ANEPPS varia proporzionalmente alla variazione del ΔΦ, la risposta del colorante è lineare per tensioni che vanno da -280 mV a +250 mV [4, 16]. Cambiamenti relativamente piccoli nella fluorescenza del colorante, colorazione irregolare della membrana, e interiorizzazione colorante fare di-8-ANEPPS meno adatti per la misura assoluta del potenziale di membrana, ad esempio, la sua componente di riposo, anche se tali sforzi sono stati segnalati anche [17]. E ', tuttavia, adatto per misurare grandi variazioni di tensione della membrana, come l'insorgenza di potenziale di membrana indotta in cellule nonexcitable esposti a campi elettrici esterni [12, 13], o potenziali d'azione nelle cellule eccitabili [4, 5]. Anche se non è qui applicata, di-8-ANEPPS permette anche la determinazione del ΔΦ da misurazioni raziometrico di eccitazione di fluorescenza [18] o di emissione [19], che aumenta la sensibilità della risposta e riduce gli effetti di cui sopra. Come di-8-ANEPPS macchie la membrana, che può essere utilizzato anche chiaramente come marker di membrana [2].

Uno degli svantaggi del colorante è che è incline a photobleaching, in modo che l'esposizione prolungata alla luce forte dovrebbe essere evitato. Calibrazione del colorante viene eseguita con o (i) valinomicina ionoforo di potassio e un insieme di diverse concentrazioni di potassio in mezzo esterno [2,18], o (ii) patch-clamp in modalità morsetto di tensione [17].

Infine, con le misure di ΔΦ sulle cellule sferiche e le cellule di forme più complesse, il video dimostra l'influenza della forma delle cellule sulla distribuzione spaziale di ampiezza e ΔΦ. Così per le cellule sferiche ΔΦ è vicino ad una coseno, in accordo con l'equazione Schwan, mentre per ulteriori forme di cellule complicata la distribuzione spaziale della ΔΦ è più complessa [20] ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
di-8-ANEPPS	Invitrogen	D-3167	potentiometric fluorescent dye
pluronic	Invitrogen	P3000MP	potassium ionophore
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
SMEM	Sigma-Aldrich	M8167 or M4767	Spinner modification of the Minimum Essential Medium
Ham-F12	Sigma-Aldrich	N4888	culture medium
fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Lab-Tek II	Nalge Nunc international	155379	chamber
DC voltage supply	Elektro-Automatik
microprocessor-controlled switcher	Custom Made
electrodes	Custom Made		Pt/Ir