チキンの聴性脳幹スライスの準備と文化

要約

鶏の聴性脳幹は、バイノーラルサウンド処理に責任を核で構成されています。培養のアプローチは、分子、細胞およびネットワークレベルで神経細胞の構造と聴覚機能の発達を研究するユニークな準備を提供しながら、単一冠状スライス標本は、回路全体を維持します。

要約

鶏の聴性脳幹は広く控えめな開発^1-4の期間だけでなく^、5月7日 、中枢神経系における時間コーディングのためのメカニズムで聴覚処理の解剖学と生理学を研究するために使用されている十分に確立されたモデルシステムです。

ここでは、急性実験手順または長期的な実験操作のための文化器官のスライスに使用することができる鶏の聴性脳幹スライスを準備する方法を提示する。

鶏の聴性脳幹は核、グナmagnocellularis、laminarisと優れたオリーブで構成されています。これらの原子核は、バイノーラル音響処理と単冠状スライス標本全体の回路を維持する責任があります。最終的に、器官切片培養では、シナプス活動などのいくつかの発達のパラメータを操作する機会、事前およびシナプス後成分の発現、興奮性および異なる遺伝子発現を制御する側面の表現を提供することができます

このアプローチは、神経回路の開発、改良と熟成に関する一般的な知識を広げるために使用することができます。

プロトコル

1。エリアの解剖の準備

1. 95％O ₂ / 5％CO ₂の混合物（7.2から7.4の間のpH、浸透圧295から310 mOsm / L）で連続的にバブル人工脳脊髄液（ACSF）。
2. ACSFは、70％EtOHでクリーンな作業領域をバブリングしている間。ビブラトームとスライス刃をも清掃してください。蒸留水（のdH ₂ O）で刃をすすぎます。
3. 適切な解剖ツールで領域を解剖にクリーンな液体吸収パッドを配置。
4. ビブラトームスライシングチャンバーの段階に接着剤の寒天ブロック（のdH ₂ O 40 mgのアガロース/ mLの、すなわち4％）*
   *ヒント：解剖する前に寒天を準備。冷蔵庫で覆われたペトリ皿内の既製の寒天を保管してください。アガロースは、EMDケミカルズまたはInvitrogenから購入した。

2。培養液で6ウェルプレートの準備

1. 無菌フードの下、35℃培養液とインキュベート1mlで6ウェルプレートの動物ごとに良く℃、5％のCO _2を 1埋める。
2. 多くの文化膜インサートとして、必要に応じて準備し、後で使用するためのフードの中に置いてください。

3。チキンの聴性脳幹の分離

1. 胚（通常は卵の大側）の空気充填空間の空隙を決定するために明るい光源の下に場所の卵。
2. 膜嚢を露出させる卵の大きな側をこじ開ける。メスと膜嚢のスライスを作成し、静かにニワトリの胚の頭部を取り除く。
3. 急速にはさみで頭を刎ねる。
4. へと目の間にわずかに後方かみそりの刃の代わりに先端。わずかな圧力をかけて頭蓋骨を介して吻側から尾側正中切開を行う*
   *ヒント：適用圧力が胚の年齢に依存している（すなわち、若い=小さい、古い=より）
5. お肌と頭蓋骨を露出し、正中線のカットを確認するために羽を押しのける。
6. かみそりの刃でスライスして頭蓋骨の吻側部をブロックします。目に後方と急速に全体の頭蓋骨と脳の組織を介して切断位置のブレード*
   *ヒント：強い圧力が完全に吻側セクションを削除する必要があります。
7. 頭の両側に見える首の筋肉へ少し前頭骨の尾部領域、の小さなハサミで正中線から外側切開を加えます。頭蓋骨と小脳と脳を公開するために組織を引き離します。
8. そっと小さなはさみで添付された組織を切断して頭蓋底から脳幹を削除します。すべての組織が切断されると、脳幹は頭蓋骨から離れて自由に移動する必要があります*
   *ヒント：添付された組織を切断するために頭蓋骨（脳の下）を反転する必要があります。

4。スライシングのための脳幹の準備

1. 一度頭蓋骨から削除、視蓋を通して脳幹を突き止める。
2. 完全に第4脳室底を露出させる、優しく小さなハサミで花梗をカットして小脳を削除します。
3. ピンセットで脳幹の表面から膜様組織と血管を削除し、脳幹を分離するために視蓋を通して横カットを行います。
4. 寒天ブロックの前でビブラトームステージ（ビブラトームのブレードに向かって）にスーパー接着剤の少量を置きます。
5. ピンセットを使用すると、静かにかつ迅速ビブラトームのブレードに向かって吻側面を下にし、背側にスーパー接着剤上に脊髄と場所の組織で脳幹を持ち上げる*
   *ヒント：余分な接着剤は、次のステップの前に金ワイプまたはろ紙に吸収されるべきである。
6. 優しくビブラトームステージに酸素ACSFを注ぐ*
   *注意：このACSFを連続的にO ₂ / CO ₂でバブリングすることができます。しかし、脳幹スライスに不要な動きのソリューションの結果のような小さな体積（および損傷）にACSFのバブリング。迅速に実行した場合、解剖から既に酸素ACSFで十分です。
7. ビブラトームブレードは、20〜22℃の角度になっているはず。スタートビブラトーム（振動が最大振幅に設定する必要があります）とは、組織のトップは、スライスする前に刃と平行になるようにブレードに向かってステージを移動する。
8. すぐに脳幹の組織に向けてブレードを移動する。かなり組織と刃の接触直前にスローダウン。
9. 最も遅い可能性前進運動と組織をスライス始める。かつて組織の全体冠状セクションを通じて、軽くブラシや割れたガラスでブレードからスライスを離れて移動する、洗練されたピペットはゴム球を一端に合わせ、発射。
10. 再び300から500μmのステップとスライスの下段。解剖学的な署名は脳幹の組織で表示されるまで繰り返します。この時点で、200-1000μmで聴覚構造を含むスライスの脳幹の組織は、組織や実験的なニーズの年齢に応じて、厚さ。
11. 慎重にスライスの順番で使用可能なスライスを維持する、すなわち^、1回目^のスライスは、回路の最も尾部領域（低周波音の処理）を表し、最後のスライスは最も吻側部（高周波processiを表します。NG）*
    *注：文化用のスライスの配置については、セクション6に進みます。 体外生理学ストレージの場合、次のセクションを参照してください。

5。 体外生理学のスライスストレージ

1. ニワトリ胚やスライスの厚さの年齢に応じて、各動物は1〜6のスライスを提供する必要があります。
2. ゆっくりとゴム球を一端に取り付けた火災研磨したガラスピペットを用いてチャンバー内の個々のスライスを配置します。チャンバーには番号がされるべきである。いくつかtonotopic特異性（例えば、チャンバー1内の最も尾側のスライスと最後のチャンバー内の最も尾側のスライスを）維持するために、ウェルあたり1つのスライスを置きます。チャンバーは、ACSFを充填し、連続して95％O ₂ / 5％CO ₂液（pH7.4、浸透圧295から310 mOsm / L）の混合物をバブリングしてください。
3. スライスは約1時間温浴（36℃）に室を置くことによって平衡させる。
4. 温かいお風呂からチャンバーを取り外し、約半時間室温で休ませることができます。
5. 室温で半時間後、スライスは保持室から電気生理学実験のための顕微鏡にマウントされている〜0.5mLの記録室に転送することができます。
6. スライスは、温かいお風呂から取り外した後〜6時間まで使用することができます。

6。器官切片培養⁸の準備

1. すぐにスライス手順は、次の（セクション6を参照）氷上で48ウェルプレートにゴム球を一端に取り付けた火災研磨したガラスピペットを用いて〜500μLのACSFでスライスを転送する。ウェルあたりつのスライス*.
   *ヒント：スライスが少なくとも300μmおよび最大1000μmの厚さにする必要がある。
2. スライスが収集された後、ボンネットに48ウェルプレートに移す。
3. インキュベーターから培養培地を含む6ウェルプレートを取り外し、ボンネットに転送します。
4. 直前に培地とよくに（セクション2.2を参照）膜上に単一の脳、調製した膜挿入の一箇所からのスライスを配置する。に気泡が膜下に存在していないことを確認してください。
5. ガラスピペットを用いて、培養膜上にACSFのドロップでスライスを転送し、マイクロピペットで過剰ACSFを削除します。残りのスライスに対して、この手順を繰り返します（膜あたり最大4スライス）*
   *ヒント：彼らは、膜の縁に接触しないようにスライスが膜上で中央集約的にお互いに触れると場所をスライスしていないことを確認してください。
6. 必要な数の脳切片に対して繰り返します*.
   *ヒント：培養は後で時点で操作される場合、培養はインキュベーターから削除される時間を削減するとして、それは6ウェルプレートあたり3膜の量を制限するために有利かもしれない。
7. ボンネットの下に週3回培養液を変更する：メンブレンインサートをピンセットでうまくから持ち上げている間に無菌の先端に真空管を使用して、古いメディアを削除します。メンブレンインサートをウェルから持ち上げている間にも新鮮な培養培地1mLを追加。すべてのメディアが変更されると、インキュベーター内にプレートを戻す。

7。代表的な結果：

図1。鶏の聴覚脳幹のバイノーラル回路。チキンの聴覚脳幹のスライス画像、体外で （）冠状断面の模式図と（BF）。 （A）の回路では、核magnocellularis（NM）と核グナ（NA）に聴覚神経（）からの求心性興奮性入力を示します。 NMは、脳幹の両側の核laminaris（NL）への二国間の興奮性入力を投影します。上オリーブ核（SON）プロジェクトからNA、NMとNLへの抑制性入力。のインビトロスライス （BF）は、連続した画像の高周波領域の低にして表す尾から（B）鶏の聴覚脳幹の吻側（F）になる（各200μM）は、、それぞれです。回路が音源定位のために主に使用される音の時間的なプロパティをコーディングする責任があります。のスケールバー（B）= 500μmとの画像（CF）に適用されます。 NLの単一の細胞体層に（D）点の矢印。

図2。培養神経細胞は、正常な生理学的応答の特性を開発する。急性（A＆C）と4（B）と7（D）文化の日（DIC）での培養組織からの現在の手順を過分極し、脱分極に応答して膜電位の変化をスーパーインポーズ。年齢同等の急性組織に比べてスライス培養のアプローチで同じように開発する電圧"サグ"、外向き電流の大幅低減、および単一のAPの焼成を過分極の注意の変更。現在の注射は200ミリ秒、50から100 pAのステップだった。 RMPS、-55、-60 mVの間であった。

図3。文化のSLIの解剖学的構造CES。文化の中で7日後のE11の鶏（DIC）の聴覚脳幹の左半分。相馬と樹状突起で発生する微小管関連タンパク質2（MAP2）、に対する抗体は、緑のラベルが貼られています。核magnocellularis（NM）の神経細胞とその軸索のクラスタは、アレクサデキストラン色素のエレクトロポレーションを経由して赤で表示されています。 NMとNLの細胞株の両方が表示されます。同側のNMの軸索末端は、背側NLの樹状突起（白矢頭）に投影見ることができます。

ディスカッション

数十年の間、鶏の脳幹の急性スライス標本は、聴覚処理^9、10の研究に使用されています。このアプローチは、両方の発達および成熟の状態^4、11、12からバイノーラル処理上のin vitro生理データの膨大な量を提供しています。多くは、この高度に専門化された回路と、各核が音^13、14の時間的な処理で果たす役割についてはほとんど知られていない。実際には、こ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken ACSF
NaCl		Fisher Scientific	M-11624	130 mM
NaHCO3		Fisher Scientific	M-10576	26 mM
KCl		Sigma-Aldrich	P-9333	3 mM
NaH2PO4		Sigma-Aldrich	S-8282	1.25 mM
Glucose		Sigma-Aldrich	G-7528	10 mM
MgCl2		Fisher Scientific	M33-500	1 mM
CaCl2		Acros Organics	423525000	2 mM
Chicken culture medium (store at 4°C)
advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)		GIBCO, by Life Technologies	12492-013	48.00%
Earl’s balanced salt solution		Sigma-Aldrich	E-2888	24.00%
L-glutamine (200 mM)		Sigma-Aldrich	G-7513	1.00%
Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	G-7528	2.75%
horse serum (heat inactivated, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	H-1138	24.00%
Penicillin-streptomycin*		Sigma-Aldrich	P-0781	1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination
Specific equipment
Millicell-CM cell culture inserts	PICMORG50	EMD Millipore
6-well plate	6 Well Cell Culture Cluster	Corning
Incubator	Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific