Préparation et de la culture de tranches de poulet auditive du tronc

Résumé

Le tronc cérébral du poulet est composé de noyaux responsable du traitement des sons binauraux. Une préparation seule tranche coronale maintient tout le circuit alors que l'approche de culture fournit une préparation unique pour étudier le développement de la structure neuronale et de la fonction auditive au niveau moléculaire, cellulaire et réseau.

Résumé

Le tronc cérébral du poulet est un système modèle bien établi qui a été largement utilisée pour étudier l'anatomie et la physiologie du système auditif à des périodes discrètes du développement de ^1-4 ainsi que les mécanismes de codage temporel dans le système nerveux central ^5-7.

Nous présentons ici une méthode pour préparer les tranches de poulet auditifs du tronc cérébral qui peut être utilisé pour des procédures expérimentales aiguës ou de tranches de culture organotypique à long terme des manipulations expérimentales.

Le tronc cérébral est composé de poulet angularis noyau, magnocellularis, olive laminaris et supérieures. Ces noyaux sont responsables du traitement des sons binauraux et unique préparation tranche coronale de préserver tout le circuit. Finalement, les cultures organotypique peut fournir l'occasion de manipuler plusieurs paramètres du développement tels que l'activité synaptique, l'expression de composants pré-et post-synaptiques, l'expression de l'excitabilité des aspects de contrôle et de l'expression différentielle des gènes

Cette approche peut être utilisée pour élargir les connaissances générales sur le développement des circuits neuronaux, de raffinement et de la maturation.

Protocole

1. Préparation de la dissection Zone

1. Continuellement bulle artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF), avec un mélange de 95% d'O ₂ / 5% de CO ₂ (pH entre 7.2 à 7.4, l'osmolarité de 295 à 310 mOsm / l).
2. Alors que l'ACSF est en ébullition, nettoyer la zone de travail avec de l'EtOH 70%. Aussi nettoyer les vibratome et lame de tranchage. Rincer la lame à l'eau distillée (dH ₂ O).
3. Endroit propre tampon d'absorption de liquide à disséquer zone avec des outils appropriés de dissection.
4. Bloc de gélose Glue (40 mg d'agarose / mL, soit 4%, en DH ₂ O) à l'étape d'une chambre de vibratome-slicing *.
   * Astuce: préparer agar avant la dissection. Magasin de pré-faites agar dans une boîte de Pétri couverte au réfrigérateur. Agarose achetés auprès de EMD Chemicals ou Invitrogen.

2. Préparation des plaques de 6 puits de milieu de culture

1. Sous une hotte stérile, remplissez 1 puits par animal d'une plaque à 6 puits avec 1 ml de milieu de culture et incuber à 35 ° C et 5% de CO _2.
2. Préparer autant insère la membrane de la culture, au besoin et les placer dans le capot pour une utilisation ultérieure.

3. Isolement du évoquée auditive poulet

1. Placer l'œuf sous une source de lumière vive afin de déterminer le vide de l'espace aérien remplis de l'embryon (généralement le grand côté de l'œuf).
2. Cassez l'œuf grand côté du sac d'exposer la membrane. Faire tranche dans la membrane du sac avec un scalpel et retirez délicatement la tête de l'embryon de poulet.
3. Rapidement décapiter la tête avec des ciseaux.
4. Placez la pointe de la lame de rasoir légèrement derrière et entre les yeux. Faire une incision rostrale à caudale médiane à travers le crâne appliquant une légère pression *.
   * Astuce: pression appliquée est dépendante de l'âge de l'embryon (c'est à dire, plus jeune = moins = plus anciens et plus)
5. Poussez délicatement la peau et les plumes de côté pour exposer le crâne et vérifier coupé la ligne médiane.
6. Bloc partie rostrale du crâne par tranchage avec une lame de rasoir. Lame de position postérieure aux yeux et rapidement couper ensemble du crâne et les tissus du cerveau *.
   * Astuce: forte pression est nécessaire pour éliminer complètement la section rostrale.
7. Faire médiane-à-incisions latérales avec de petits ciseaux dans la région caudale du crâne, légèrement antérieure aux muscles du cou visible des deux côtés de la tête. Détacher du crâne et du tissu pour exposer le cervelet et le cerveau.
8. Retirer délicatement le tronc cérébral de la base du crâne en coupant le tissu attaché avec de petits ciseaux. Une fois que tout le tissu est coupé, le tronc doit se déplacer librement loin du crâne *.
   * Astuce: vous pouvez avoir besoin de retourner le crâne (le bas du cerveau) pour couper le tissu attaché.

4. Préparation de tronc cérébral pour le tranchage

1. Une fois sorti du crâne, broches tronc cérébral à travers l'optique tecta.
2. Supprimer complètement le cervelet par les pédoncules de coupe délicatement avec de petits ciseaux, exposant le sol du quatrième ventricule.
3. Retirez tout tissu membraneux et des vaisseaux sanguins de la surface du tronc cérébral avec des pincettes et faire des coupes latérales à travers l'optique tecta d'isoler le tronc cérébral.
4. Placer une petite quantité de colle super sur la scène vibratome en face du bloc de gélose (vers la lame vibratome).
5. En utilisant une pince à épiler, doucement et rapidement soulever le tronc cérébral à la moelle épinière et des tissus placer sur la super glue avec le côté rostral vers le bas et vers la face dorsale de la lame vibratome *.
   * Astuce: l'excès de colle doivent être absorbés avec un kim-wipe ou un filtre en papier avant l'étape suivante.
6. Verser délicatement ACSF oxygéné dans le stade vibratome *.
   * Note: cette ACSF peut être continuellement à barboter avec O ₂ / CO _2. Toutefois, dans le bouillonnement de l'ACSF tels un petit volume de solution dans les résultats mouvements indésirables (et de possibles dommages) pour les tranches du tronc cérébral. Si effectuée rapidement, déjà oxygéné ACSF de la dissection est suffisante.
7. Pales Vibratome devrait être à un angle de 20-22 °. Démarrer vibratome (oscillation devrait être fixé à maximum d'amplitude) et se déplacer vers le stade de la lame pour que le haut du tissu est parallèle à la lame avant de trancher.
8. Déplacez rapidement lame vers le tissu cérébral. Ralentir considérablement juste avant la lame de contact avec les tissus.
9. Commencez découpage des tissus avec la marche avant la plus lente possible. Une fois que toute la section coronale des tissus, déplacez doucement tranche de la lame avec un pinceau ou un verre cassé, tiré pipette polie, l'ajustement à une extrémité avec une poire en caoutchouc.
10. Stade inférieur de 300 à 500 um et émincez les étapes à nouveau. Répétez jusqu'à ce que les signatures anatomiques sont visibles dans le tissu cérébral. A cette époque, les tissus du tronc cérébral tranche contenant des structures auditives au 200-1000 um épaisseurs, en fonction de l'âge des besoins du tissu et expérimentales.
11. Soigneusement maintenir tranches utilisable dans l'ordre de tranchage, à savoir, la tranche 1 ^er représente la région la plus caudale du circuit (basse fréquence de traitement du son) et la dernière tranche représente la section la plus rostrale (haute fréquence Processing) *.
    * Remarque: pour le placement de tranches d'utiliser la culture, allez à la section 6. Pour in-vitro de stockage physiologie, voir la section suivante.

5. Stockage Slice in vitro de Physiologie

1. Selon l'âge de l'embryon de poulet et l'épaisseur de la tranche, chaque animal doit fournir 1 à 6 tranches.
2. Placez délicatement les tranches individuelles dans la chambre en utilisant pipette en verre polies au feu installé à une extrémité d'une poire en caoutchouc. Chambre doivent être numérotées. Placez un seul morceau par puits, afin de maintenir une certaine spécificité tonotopique (par exemple, tranche la plus caudale dans la chambre 1 et la tranche la plus rostrale dans la dernière chambre). Chambre doit être rempli avec l'ACSF et continuellement à barboter avec un mélange de 95% d'O ₂ / 5% de CO ₂ (pH 7,4, l'osmolarité de 295 à 310 mOsm / l).
3. Autoriser les tranches de s'équilibrer en plaçant la chambre dans un bain chaud (36 ° C) pendant environ 1 heure.
4. Retirer la chambre d'un bain chaud et laissez reposer à température ambiante pendant une demi-heure environ.
5. Après une heure et demie à la température ambiante, les tranches peuvent être transférés de la chambre de retenue à une chambre d'enregistrement ~ 0,5 ml monté sur un microscope pour des expériences électrophysiologiques.
6. Tranches peut être utilisé pour un maximum de ~ 6 heures après la sortie du bain chaud.

6. Préparation de cultures organotypique ⁸

1. Immédiatement après la procédure de découpage (voir Section 6) tranches de transfert avec ~ 500 uL ACSF aide d'une pipette de verre polies au feu installé à une extrémité avec une poire en caoutchouc sur une plaque de 48 puits sur la glace. Une tranche par puits *.
   * Astuce: Tranches doivent être d'au moins 300 um et jusqu'à 1000 um d'épaisseur.
2. Après tranches ont été recueillies, le transfert de la plaque de 48 puits à la hotte.
3. Supprimer une plaque de 6 puits dans un milieu de culture contenant de l'incubateur et le transférer sur le capot.
4. Juste avant de placer les tranches à partir d'un seul cerveau sur des membranes, placer l'un des inserts membrane préparée (voir section 2.2) dans un puits avec un milieu de culture. Assurez-vous que les bulles d'air sont présentes sous la membrane.
5. En utilisant une pipette en verre, le transfert d'une tranche dans une goutte d'ACSF sur la membrane de la culture et enlever l'excédent avec l'ACSF une micropipette. Répétez l'opération pour les autres tranches (max 4 tranches par membrane) *.
   * Astuce: Assurez-vous que les tranches ne se touchent pas et les tranches de lieu central sur la membrane de sorte qu'ils ne touchent pas la jante membrane.
6. Répétez l'opération pour que des tranches de cerveau que nécessaire *.
   * Astuce: Si les cultures sont manipulés à un stade ultérieur, il pourrait être avantageux de limiter la quantité de membranes à 3 par 6-même plaque que pour réduire le temps les cultures sont retirés de l'incubateur.
7. Changer milieu de culture 3 fois par semaine sous un capot: Suppression ancien milieu avec un tube à vide avec un embout stérile, alors insérer la membrane est soulevée hors du puits avec une paire de pinces. Ajouter 1 mL de milieu de culture frais dans bien pendant insérer la membrane est soulevée hors du puits. Lorsque toutes milieu est changé, mettez la plaque arrière dans l'incubateur.

7. Les résultats représentatifs:

Figure 1. Binaural circuits du tronc cérébral auditif poulet. (A) Schéma d'une coupe coronale et (BF) des images tranche in-vitro de l'auditif du tronc cérébral du poulet. Le circuit en (A) montre afférences excitatrices entrées du nerf auditif (AN) au noyau magnocellularis (NM) et le noyau angularis (NA). NM projets bilatéraux entrées excitatrices au noyau laminaris (NL) sur les deux côtés du tronc cérébral. Une entrée d'inhibition de la olivaire supérieur noyau (SON) des projets à NA, NM et NL. Les tranches in vitro en (BF) sont des images séquentielles (200 um chacun) allant de caudal (B) pour rostrale (F) du tronc cérébral du poulet, qui représente le bas de haute fréquence régions, respectivement. Circuit est responsable pour le codage des propriétés temporelles des sons utilisés principalement pour la localisation des sons. La barre d'échelle en (B) = 500 um et s'applique pour les images en (FC). Les flèches (D) au point de la couche de corps seule cellule de la NL.

Figure 2. Développer des cultures de neurones normaux propriétés réponse physiologique. Superposé variations de tension de membrane en réponse à hyperpolarisante et dépolarisants étapes actuelles du aiguë (A & C) et les tissus cultivés à 4 (B) et 7 (D) jours de culture (CIVD). Prenez note des modifications dans la tension de hyperpolarisante "sag", forte réduction de courant sortant, et seul tir AP qui se développent même, dans l'approche de la culture tranche par rapport à l'âge de tissus aiguë équivalent. Injections de courant ont été de 200 ms, les étapes de 50-100 pA. PGF ont été entre -55 et -60 mV.

Figure 3. Structure anatomique de la culture en SLICES. moitié gauche du tronc cérébral auditif de poulet E11 après 7 jours de culture (CIVD). Un anticorps contre la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2), qui se produit dans le soma et des dendrites, est marquée en vert. Une grappe de noyau magnocellularis (NM) les neurones et les axones sont étiquetés de son en rouge par électroporation d'un colorant Alexa dextrane. Les deux NM et la lignée cellulaire NL sont visibles. Ipsilatérale terminaisons axonales NM peut être vu en saillie pour les dendrites dorsale NL (flèches blanches).

Discussion

Depuis plusieurs décennies, la préparation de tranches aiguë du tronc cérébral du poulet a été utilisée pour étudier le traitement auditif ^{9, 10.} Cette approche a fourni une énorme quantité de données in vitro sur le traitement binaural physiologiques des deux états de développement et de maturité ^{4, 11, 12.} On connaît bien ce circuit très spécialisé et le rôle de chaque noyau joue dans le traitement temporel des sons ^{13, 14.} En fait, à court terme ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken ACSF
NaCl		Fisher Scientific	M-11624	130 mM
NaHCO3		Fisher Scientific	M-10576	26 mM
KCl		Sigma-Aldrich	P-9333	3 mM
NaH2PO4		Sigma-Aldrich	S-8282	1.25 mM
Glucose		Sigma-Aldrich	G-7528	10 mM
MgCl2		Fisher Scientific	M33-500	1 mM
CaCl2		Acros Organics	423525000	2 mM
Chicken culture medium (store at 4°C)
advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)		GIBCO, by Life Technologies	12492-013	48.00%
Earl’s balanced salt solution		Sigma-Aldrich	E-2888	24.00%
L-glutamine (200 mM)		Sigma-Aldrich	G-7513	1.00%
Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	G-7528	2.75%
horse serum (heat inactivated, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	H-1138	24.00%
Penicillin-streptomycin*		Sigma-Aldrich	P-0781	1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination
Specific equipment
Millicell-CM cell culture inserts	PICMORG50	EMD Millipore
6-well plate	6 Well Cell Culture Cluster	Corning
Incubator	Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific