La preparazione e la cultura di fette di pollo uditive tronco

Riepilogo

Il tronco cerebrale uditivo pollo è costituita da nuclei responsabile per l'elaborazione del suono binaurale. Una preparazione singola fetta coronale mantiene l'intero circuito mentre l'approccio colto fornisce una preparazione unica di studiare lo sviluppo della struttura neuronale e della funzione uditiva a livello molecolare, cellulare e di rete.

Abstract

Il tronco cerebrale uditivo pollo è un collaudato sistema di modello che è stato ampiamente usato per studiare l'anatomia e la fisiologia del processo uditivo in periodi di discreto sviluppo ^04/01 nonché meccanismi per la codifica temporale nel sistema nervoso centrale ^5-7.

Qui vi presentiamo un metodo per preparare le fette di pollo uditivi del tronco encefalico, che può essere utilizzato per acuti procedure sperimentali o di fette cultura organotipica per le manipolazioni sperimentali a lungo termine.

Il tronco cerebrale uditivo pollo è composto da angularis nucleo, magnocellularis, oliva laminaris e superiore. Questi nuclei sono responsabili per l'elaborazione del suono binaurale e singole preparazioni fetta coronale preservare l'intero circuito. In definitiva, le culture fetta organotipica in grado di fornire l'opportunità di manipolare vari parametri di sviluppo come l'attività sinaptica, espressione di componenti pre e post-sinaptici, espressione di eccitabilità aspetti di controllo e di espressione genica differenziale

Questo approccio può essere utilizzato per ampliare la conoscenza generale sullo sviluppo del circuito neurale, affinamento e maturazione.

Protocollo

1. Preparazione di dissezione Area

1. Continuamente bolla artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF) con una miscela di 95% O ₂ / 5% di CO ₂ (pH compreso tra 7,2-7,4, osmolarità 295-310 mOsm / l).
2. Mentre ACSF è spumeggiante, pulire l'area di lavoro con il 70% EtOH. Pulire anche il vibratome e lama di taglio. Risciacquare con acqua distillata lama (dH ₂ O).
3. Luogo pulito pad assorbimento di liquidi sulla dissezione area con adeguati strumenti di dissezione.
4. Colla blocco agar (40 mg agarosio / ml, cioè 4%, in dH ₂ O) alla fase di un vibratome-slicing camera *.
   * Suggerimento: preparare agar prima dissezione. Conservare pre-agar fatto all'interno di una capsula di Petri coperta in frigorifero. Agarosio acquistato da sostanze chimiche o EMD Invitrogen.

2. Preparato di 6-pozzetti con terreno di coltura

1. Sotto una cappa sterile, riempire 1 vasca per animale di un 6-pozzetti con 1 ml di terreno di coltura e incubare a 35 ° C e 5% di CO _2.
2. Preparare come molti inserti membrana cultura come necessaria e metterli in cappuccio per un uso successivo.

3. Isolamento del tronco di pollo uditive

1. Uovo posto sotto una fonte luminosa di luce per determinare la piena vuoto dello spazio aereo dell'embrione (tipicamente grande lato dell'uovo).
2. Rompere grande lato di uovo esporre sacco membrana. Fai la fetta nella membrana sacco con bisturi e rimuovere delicatamente la testa di un embrione di pollo.
3. Rapidamente decapitare la testa con le forbici.
4. Mettete la punta della lama di rasoio leggermente al posteriore e tra gli occhi. Fare un rostrale-to-caudale incisione linea mediana attraverso il cranio applicando solo una leggera pressione *.
   * Suggerimento: pressione applicata dipende dall'età dell'embrione (cioè, più giovane = meno = più vecchi)
5. Premere delicatamente da parte della pelle e piume di esporre cranio e verificare taglio della linea mediana.
6. Blocco porzione rostrale del cranio da affettare con una lametta. Lama posizione posteriore per gli occhi e rapidamente tagliare intero cranio e tessuto cerebrale *.
   * Suggerimento: è necessaria una forte pressione per rimuovere completamente sezione rostrale.
7. Fai la linea mediana a incisioni laterali con piccole forbici nella regione caudale del cranio, leggermente anteriore ai muscoli del collo visibile su entrambi i lati della testa. Tirare fuori cranio ei tessuti per esporre cervelletto e al cervello.
8. Rimuovere delicatamente dalla base del tronco cerebrale del cranio, tagliando il tessuto fissato con piccole forbici. Una volta che tutto il tessuto viene tagliato, tronco cerebrale dovrebbe muoversi liberamente fuori dal cranio *.
   * Suggerimento: potrebbe essere necessario capovolgere il cranio (in basso cervello) per tagliare i tessuti attaccati.

4. Preparazione del tronco per affettare

1. Una volta tolto dal cranio, perno tronco cerebrale giù attraverso l'ottica Tecta.
2. Rimuovere completamente il cervelletto con delicatezza il taglio con le forbici i peduncoli piccoli, esponendo il pavimento del quarto ventricolo.
3. Rimuovere qualsiasi tessuto membranoso e dei vasi sanguigni dalla superficie del tronco encefalico con una pinzetta e fare dei tagli laterali attraverso l'ottica Tecta per isolare il tronco cerebrale.
4. Mettete una piccola quantità di colla super-vibratome sul palco di fronte al blocco di agar (verso la lama vibratome).
5. Utilizzando una pinzetta, delicatamente e rapidamente sollevare il tronco cerebrale al midollo spinale e del tessuto posto sulla super-colla con la parte rostrale verso il basso e verso la parte dorsale a lama vibratome *.
   * Suggerimento: colla in eccesso dovrebbe essere assorbito con un Kim-wipe o filtro di carta prima fase successiva.
6. Delicatamente versare ACSF ossigenata in fase vibratome *.
   * Nota: questo ACSF possono essere continuamente bolle con O ₂ / CO _2. Tuttavia, bolle di ACSF in un piccolo volume di soluzione risultati in movimento indesiderato (e possibili danni) a fette tronco cerebrale. Se eseguita rapidamente, già ossigenato ACSF dalla dissezione è sufficiente.
7. Lama Vibratome dovrebbe essere ad un angolo di 20-22 °. Inizio vibratome (oscillazione dovrebbe essere fissato a massima ampiezza) e spostare stadio verso la lama in modo che la parte superiore del tessuto è parallelo con la lama prima di tagliare.
8. Spostare rapidamente lama verso il tessuto cerebrale. Rallentare notevolmente appena prima del contatto della lama con il tessuto.
9. Iniziare taglio dei tessuti con più bassa possibile movimento in avanti. Una volta attraverso l'intera sezione coronale del tessuto, spostare delicatamente fetta di distanza dalla lama con una spazzola o un bicchiere rotto, licenziato pipetta lucido, adatta ad una estremità con un bulbo di gomma.
10. Inferiore fase 300-500 micron passi e fetta di nuovo. Ripetere l'operazione fino firme anatomiche sono visibili nel tessuto cerebrale. A questo punto, il tessuto cerebrale fetta contenenti strutture uditive a 200-1000 micron spessori, a seconda dell'età dei bisogni del tessuto e sperimentale.
11. Attentamente mantenere fette utilizzabile in ordine di taglio, cioè il 1 fetta ^° rappresenta la regione più caudale del circuito (a bassa frequenza di elaborazione del suono) e l'ultima fetta rappresenta la sezione più rostrale (ad alta frequenza Processing) *.
    * Nota: per il posizionamento di fette per la cultura, vai alla sezione 6. Per in-vitro di stoccaggio fisiologia, vedere la sezione successiva.

5. Stoccaggio fetta di in-vitro Fisiologia

1. A seconda dell'età degli embrioni di pollo e lo spessore della fetta, ogni animale dovrebbe prevedere 1-6 fette.
2. Delicatamente posto singole sezioni in camera con pipetta di vetro lucido fuoco montato ad una estremità con un bulbo di gomma. Camera devono essere numerate. Posto solo una fetta per ogni bene, al fine di mantenere alcune specificità tonotopica (ad esempio, la fetta più caudale nella camera 1 e la fetta più rostrale nella camera scorso). Camera deve essere riempito con ACSF e continuamente bolle con una miscela di 95% O ₂ / 5% di CO ₂ (pH 7,4, osmolarità 295-310 mOsm / l).
3. Lasciare fette per equilibrare mettendo la camera in un bagno caldo (36 ° C) per circa 1 ora.
4. Rimuovere camera da bagno caldo e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per circa mezz'ora.
5. Dopo ore e mezza a temperatura ambiente, fette possono essere trasferiti dalla camera tenendo ad una camera di registrazione ~ 0,5 ml montato su un microscopio per esperimenti di elettrofisiologia.
6. Fette può essere utilizzato per un massimo di ~ 6 ore dopo la rimozione dal bagno caldo.

6. Preparazione delle Culture Slice organotipica ⁸

1. Subito dopo la procedura di taglio (si veda Sezione 6) fette di trasferimento con ~ 500 microlitri ACSF utilizzando una pipetta di vetro lucido fuoco montato ad una estremità con un bulbo di gomma per un piatto ben 48 su ghiaccio. Una fetta per bene *.
   * Suggerimento: Fette devono essere almeno 300 micron e fino a 1000 micron di spessore.
2. Dopo fette sono stati raccolti, trasferire il 48 pozzetti alla cappa.
3. Rimuovere un 6-pozzetti contenenti terreno di coltura fuori dell'incubatore e trasferirlo alla cappa.
4. Appena prima di mettere le fette da un cervello solo su membrane, luogo uno degli inserti membrana preparati (vedi Sezione 2.2) in un pozzo con terreno di coltura. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria in membrana.
5. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire una fetta in una goccia d'ACSF sulla membrana cultura e rimuovere ACSF in eccesso con una micropipetta. Ripetere l'operazione per le fette restanti (max 4 fette per membrana) *.
   * Suggerimento: assicurarsi fette non si toccano e fette posto centralmente sulla membrana in modo da non toccare il bordo della membrana.
6. Ripetere l'operazione per il numero di sezioni di cervello necessario *.
   * Suggerimento: se le culture sono manipolate in un punto secondo momento, potrebbe essere vantaggioso per limitare la quantità di membrane al 3 per 6 pozzetti per ridurre il tempo vengono rimosse le culture dal termostato.
7. Cambia terreno di coltura 3 volte a settimana sotto una cappa: Rimuovere vecchi media con un tubo a vuoto con una punta sterile mentre inserire membrana viene sollevato dal pozzo con un paio di pinze. Aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco bene mentre inserire membrana viene sollevato dal pozzo. Quando tutti i media è cambiato, messo piastra posteriore nell'incubatore.

7. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Circuiti binaurale del tronco cerebrale uditivo pollo. (A) Schema di una sezione coronale e (BF) in vitro immagini fetta di tronco cerebrale uditivo pollo. Il circuito in (A) mostra afferente gli ingressi eccitatori dal nervo uditivo (AN) per nucleo magnocellularis (NM) e nucleo angularis (NA). NM progetti bilaterali ingressi eccitatori al nucleo laminaris (NL) su entrambi i lati del tronco encefalico. Un input inibitorio dal nucleo olivare superiore (SON) progetti di NA, NM e NL. In vitro a fette (BF) sono immagini sequenziali (200 micron ciascuno) andando da caudale (B) per rostrale (F) del tronco cerebrale uditivo pollo, che rappresenta il basso ad alta frequenza regioni, rispettivamente. Circuiteria è responsabile per la codifica proprietà temporali del suono utilizzato principalmente per la localizzazione del suono. Barra di scala a (B) = 500 micron e si applica per le immagini in (CF). Frecce (D) puntare al singolo strato corpo cellulare di NL.

Figura 2. Neuroni coltivati ​​sviluppare normale risposta fisiologica proprietà. Sovrapposte variazioni di tensione della membrana in risposta a iperpolarizzante e depolarizzanti passi corrente da acuta (A & C) e della massa colta a 4 (B) e 7 (D) giorni di cultura (DIC). Nota di variazioni iperpolarizzante tensione "sag", forte riduzione della corrente verso l'esterno, e monocottura AP che si sviluppano in modo simile nell'approccio cultura fetta rispetto all'età tessuto equivalente acuta. Iniezioni di corrente sono stati 200 ms, a pochi passi di 50-100 pA. RMP sono stati tra -55 e -60 mV.

Figura 3. Struttura anatomica in sli culturaCES. metà sinistra del tronco cerebrale uditivo di un pollo E11 dopo 7 giorni di cultura (DIC). Un anticorpo contro la proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2), che si verifica nel soma e dendriti, è etichettato in verde. Un gruppo di nucleo magnocellularis (NM), i neuroni e le sue assoni sono etichettati in rosso tramite elettroporazione di un destrano Alexa colorante. Sia NM e la linea cellulare NL sono visibili. Ipsilaterale terminali degli assoni NM può essere visto proiettare al dendriti dorsale NL (punte di freccia bianca).

Discussione

Per diversi decenni, la preparazione fetta acuta del tronco cerebrale pollo è stato usato per studiare l'elaborazione uditiva ^{9, 10.} Questo approccio ha fornito una quantità enorme di dati in vitro fisiologici sul trattamento binaurale da entrambi gli stati di sviluppo e maturare ^{4, 11, 12.} Si sa molto su questo circuito ad alta specializzazione e il ruolo di ogni nucleo svolge nella lavorazione temporale dei suoni ^{13, 14.} In realtà, manipolazioni sperimentali a breve ter...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken ACSF
NaCl		Fisher Scientific	M-11624	130 mM
NaHCO3		Fisher Scientific	M-10576	26 mM
KCl		Sigma-Aldrich	P-9333	3 mM
NaH2PO4		Sigma-Aldrich	S-8282	1.25 mM
Glucose		Sigma-Aldrich	G-7528	10 mM
MgCl2		Fisher Scientific	M33-500	1 mM
CaCl2		Acros Organics	423525000	2 mM
Chicken culture medium (store at 4°C)
advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)		GIBCO, by Life Technologies	12492-013	48.00%
Earl’s balanced salt solution		Sigma-Aldrich	E-2888	24.00%
L-glutamine (200 mM)		Sigma-Aldrich	G-7513	1.00%
Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	G-7528	2.75%
horse serum (heat inactivated, sterile filtered)		Sigma-Aldrich	H-1138	24.00%
Penicillin-streptomycin*		Sigma-Aldrich	P-0781	1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination
Specific equipment
Millicell-CM cell culture inserts	PICMORG50	EMD Millipore
6-well plate	6 Well Cell Culture Cluster	Corning
Incubator	Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific