代謝標識とBioorthogonalクリックケミストリーによるゼブラフィッシュ胚でのイメージンググリカン

要約

ゼブラフィッシュ胚におけるアルキンタグ付き糖鎖の迅速、非侵襲的、および堅牢なラベリングを可能にするクリックケミストリーベースの方法が記載されている。後期原腸形成の段階におけるゼブラフィッシュ胚の包絡層におけるフコシル化糖鎖は、本研究では画像化した。

要約

in vivoでのイメージングの糖鎖は、最近、アジドまたはアルキンタグ付き単^1、2細胞または生物を処理することにより、bioorthogonal化学レポーターの戦略を使用して有効になっている。糖鎖生合成機構によって処理される変更された単糖類は、細胞表面の複合糖質に組み込まれています。 bioorthogonalアジドまたはアルキンタグは、可視化用蛍光プローブと共有結合を許可する、または濃縮およびglycoproteomic分析のための親和性プローブ​​と。のエンベロープ層のフコシル化糖鎖を標識する）GDP - 5 - alkynylfucose（GDP - FucAl）、2と1細胞期胚の1）マイクロインジェクション：このプロトコルは、一般的に含むゼブラフィッシュ胚におけるフコシル化糖鎖の非侵襲的イメージングに使用する手順について説明します。共焦点顕微鏡³で生体適合性銅（I）触媒によるアジド-アルキン付加環（CuAAC）、及び3）イメージングを経由してアジド共役フルオロフォアとゼブラフィッシュ胚。方法は、ここで説明容易にゼブラフィッシュを開発する際に、他の生物において、糖鎖、シアル酸⁴とN -アセチルガラクトサミン^5を含むなどの糖鎖^、6の他のクラスを可視化するために拡張することができます。

プロトコル

1。卵の回収とDechorionation

1. 収集と35mmのペトリ皿にゼブラフィッシュ卵を転送、できるだけ多くの水のように削除してから、E3胚の培地で1 mg / mlのProneaseのE（5 mMのNaCl、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMの塩化カルシウム_{2 ·} 2H ₂ O、0.33 mMのマグネシウムを追加する絨毛膜を消化するために_4、pH = 7.4）で。
2. 3-5分後、魚の水（1リットル当たり60mgの"インスタントオーシャン"蒸留H ₂ O）で満たされたビーカーに皿をマージし、穏やかにビーカーに卵を移すと、卵が水の中に"落ちる"ことができます。
3. 魚の水と卵を3回すすいでください。ほとんどの卵は、それらの絨毛膜から解放されます。
4. ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて、E3胚の媒体が充填さアガロースコートしたペトリ皿にdechorionated卵を移す。

2。 GDP - FucAlとマイクロインジェクション

1. 報告されたプロトコル⁷次の注入の料理を準備します。
2. E3胚の媒体が充填注入皿にdechorionated卵を移す。
3. 針を準備し、2μL注入液で読み込みます。このソリューションでは、トレーサーまたは0.2 M KClの中のフェノールレッドローディング色素（0.1％w / v）のようchemoenzymatically ⁸とのAlexa Fluor ® 594 -デキストラン（5％w / v）のいずれかを合成したGDP - FucAl 20mMのが含まれています。ネガティブコントロールとして、注射液のGDP -フコースとGDP - FucAlを交換してください。
4. 針を破ると1 NL降下^9を得るために射出圧力および持続時間を調整する。
5. どちらのソリューションの1 NLと卵を注入する。
6. E3胚の媒体が充填さアガロースコートしたペトリ皿に卵を移す。
7. 28 ° Cで卵をインキュベートし、受精後3〜4時間以内に未受精卵を削除します。

3。 BTTES - Cu系（I）触媒をクリックして化学反応

1. 胚は発達段階（例えば後期原腸胚、組織のセグメンテーションと早期の幼虫）、コート、アガロースと96ウェルプレートの基盤を求め達した時点で。
2. 4μLのAlexa Fluor ® 488アジド（H ₂ O、2.5 mMストックから）、2μLBTTES - _{4 ·} 6時01分、複雑な、そしてミックスに軽く振る加え、次いで、各ウェルに92μLE3胚の培地を追加。
3. よくファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いてクリックケミストリー試薬を含むに胚を移す。各ウェルは、5つの胚よりも少ないが含まれている必要があります。
4. クリック反応^3を開始するには2.5μL、新たに調製したアスコルビン酸ナトリウムを（H ₂ O中の100mMのストックから）を追加します。各試薬の終濃度：のAlexa Fluor - 488アジ：100μM;のCuSO _4：50μM; BTTES：300μM、アスコルビン酸ナトリウム：2.5 mMの。
5. 3分後、100μLE3の胚の培地で直ちに希釈して反応をクエンチするために、2μLバソクプロインスルホン酸（H ₂ Oに50 mMストック）、生体適合性の銅キレート剤を加える。
6. ガラスシャーレに胚を移し、15 mLのE3胚の培地で処理胚を2回洗浄する。

4。イメージング

1. マテックのガラス底マイクロウェル皿に超低融点アガロース（E3胚の培地では1.2％（w / v）の）の低下を置き、アガロースドロップに胚を置く。
2. 背側または横方向に胚を置き、アガロースドロップを固化するために氷上で5分間皿を置きます。それはアガロースドロップをカバーするまで、皿にそっとE3胚の培地を追加。
3. 蛍光と明視野の画像を順次共焦点顕微鏡を用いて取得されます。すべての胚の画像は、5μmのステップ間隔を使用して取得されます。複合数値は、ImageJのソフトウェアを用いて調製されています。

5。代表的な結果

図1は、私たちの二段階ラベリング戦略のワークフローを示しています。図2は、9.5時間後に受精（HPF）でBTTES介したCuAAC経由のゼブラフィッシュ胚のラベルを示しています。 BTTESは、トリス（トリアゾリルメチル）アミン系配位子です。それはその場生成される銅（I）との調整をするときに劇的にCuAAC加速、と明らかに毒性のな​​い生活システムで急速に付加環化反応を促進する。すぐに3分のクリック反応を以下、我々は、GDP - FucAl治療胚（図2、左のパネル）の堅牢なラベルを検出することができます。唯一のバックグラウンド蛍光は、GDP -フコース（図2、右側のパネル）にマイクロインジェクション制御の胚のために検出されます。

図1ゼブラフィッシュ胚の包絡層にフコシル化糖鎖を標識する戦略。

図2。BTTES - Cu系（I）触媒クリックケミストリーを介してゼブラフィッシュ胚発生におけるフコシル化糖鎖のin vivoイメージング 。 1細胞期のゼブラフィッシュの胚は、GDP - FucAlの単回投与でマイクロインジェクションし、開発を許可されます9.5 HPFのop。胚はその後BTTES - Cu系（I）でのAlexa Fluor ® 488アジドの触媒と反応させる。反応胚は、共焦点顕微鏡を用いて画像化している。のAlexa Fluor ®蛍光488（上部パネル）の最大強度のz -投影画像、ブライトフィールド（下のパネル）。スケールバー：100μmである。

トラブルシューティング

問題が	原因と	救済策
胚は不健康に見える	マイクロインジェクションのソリューションは、汚染物質が含まれています	ヌクレオチド糖の純度は85％以上でなければなりません。あなたのソースを確認してください。
反応の後に表示は特にない	銅濃度は、以下の30μmである	銅の濃度が30μMのときに反応速度が著しく低下するとして、胚を追加する際に過剰E3胚の培地を加えることにより反応液を希釈しないように注意してください。
胚は、反応後に死ぬ	胚の不適切な取り扱い	ピペットは、ファイアーポリッシュであり、反応容器を0.5％アガロースの非常に薄い層でコーティングされていることを確認します。
画像がむらに見える	試薬は適切に胚を追加する前に混合されていません	試薬のほかの推奨順序に従ってください、とクリックケミストリー試薬が適切に胚を追加する前に混合されていることを確認してください。
画像は、胚が損傷を受けている表示	反応中に激しく振盪損害胚	胚が溶液では1回、ゆっくりと10秒未満のために振る。

ディスカッション

イメージング生体分子 in vivoで母国の環境でそれらの生物活性の重要な洞察を提供する。このビデオでは、我々はゼブラフィッシュ胚の包絡層におけるフコシル化糖鎖の標識がGDP - FucAlとBTTESを介した生体適合性CuAACを介して第二段階の蛍光団の共役による1細胞期胚をマイクロインジェクションすることによって実現される方法を示しています ³。堅牢な標識は、2〜3?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
硫酸銅（II）五水和物	シグマアルドリッチ	203165
のAlexa Fluor ® 488アジド	インビトロジェン	A10266
デキストラン、Alexa Fluor 594の	インビトロジェン	D - 22913
（+）- L -アスコルビン酸ナトリウム	シグマアルドリッチ	A7631
Bathocuproinedisulfonic酸	アクロスオーガニック	164060010
ガラス底マイクロウェル皿	マテック	P35G - 1.5 - 14 - C