Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır

Özet

Zebra balığı embriyolar alkin etiketli glukanlardır hızlı, noninvaziv ve sağlam etiketleme için izin veren bir tıkla-kimya temelli yöntem açıklanmıştır. Bu çalışmada geç gastrulasyon aşamasında zebrafish embriyoların saran tabaka Fucosylated glukanlardır görüntülenmiştir.

Özet

In vivo Görüntüleme glukanlardır azid veya alkin etiketli Monosakkaritler ^{1, 2} ya da organizma hücreleri tedavi ederek son zamanlarda bir bioorthogonal kimyasal muhabiri stratejisi kullanılarak etkin olmuştur. Glukanıdır biyosentetik makine tarafından işlenen değiştirilmiş Monosakkaritler, hücre yüzeyinde glycoconjugates içine dahil edilmiştir. Bioorthogonal azid veya alkin etiketleri sonra görünüm için floresan problar ile kovalent konjugasyon, izin veya zenginleştirme ve glycoproteomic analiz afinite probları. Saran tabaka fucosylated glukanlardır etiketleme 1) GSYİH-5-alkynylfucose (GSYİH FucAl), 2 ile tek hücreli aşamada embriyo mikroenjeksiyon): Bu protokol da dahil olmak üzere genellikle zebrafish embriyolar fucosylated glukanlardır noninvaziv görüntüleme için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır biyouyumlu konfokal mikroskopi ³ Cu (I) katalize azid-alkin Siklokatılma (CuAAC), ve 3) görüntüleme ile azid-konjuge fluorophores zebrafish embriyolar. Burada açıklanan yöntem glukanlardır diğer sınıflar, örneğin glukanlardır içeren sialik asit ⁴ ve N-acetylgalactosamine ^{5, 6,} gelişmekte olan Zebra balığı ve diğer canlı organizmaların kolayca görselleştirmek için uzatılabilir.

Protokol

1. Yumurta Toplama ve Dechorionation

1. 35mm petri Zebra balığı yumurtaları toplamak ve aktarmak mümkün olduğu kadar su olarak kaldırmak ve sonra 1 mg / ml E3 embriyo orta Pronease D (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl ₂ · 2H ₂ O, 0.33 mM MgSO eklemek koryon sindirmek için _4, pH = 7,4).
2. 3-5 dakika sonra, balık suyu (litre başına 60 mg "anında Ocean" damıtılmış H ₂ O) ile dolu bir behere çanak birleştirme ve beher hafifçe yumurta ve yumurta suya "düşmek" için izin.
3. Yumurta balık üç kez su ile durulayın. En yumurta koryon piyasaya sürülecek.
4. Bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak, E3 embriyo orta ile dolu agaroz kaplı petri kaplarına dechorionated yumurta transferi.

2. GSYİH-FucAl ile Mikroenjeksiyon

1. Rapor protokol ⁷ enjeksiyon yemekleri hazırlayın.
2. E3 embriyo orta ile dolu enjeksiyon yemekleri içine dechorionated yumurta transferi.
3. Iğne hazırlayın ve 2 mcL enjeksiyon çözüm yük. Bu çözüm, bir izleme veya 0.2 M KCl fenol kırmızısı yükleme boyası (% 0.1 w / v) olarak 20 mM ve GSYİH-FucAl chemoenzymatically sentezlenmiş ⁸ ya Alexa Fluor 594-dekstran (% 5 w / v) içerir. Negatif kontrol olarak, enjeksiyon çözüm GSYİH fucose ile GDP-FucAl değiştirin.
4. Break iğne ve enjeksiyon basıncı ve süresi 1 nL damla ⁹ verim ayarlayın.
5. Ya çözüm 1 nL yumurta enjekte edilir.
6. E3 embriyo orta ile dolu agaroz kaplı petri kutularının içine yumurta transferi.
7. Yumurta 28 ° C'de inkübe ve döllenme sonrası 3-4 saat içinde döllenmemiş yumurta kaldırmak.

3. BTTES-Cu (I) katalize tıklayın Kimya Reaksiyon

1. Embriyoların gelişim evreleri (örneğin geç gastrula, doku segmentasyonu ve erken larva), agaroz ile 96-plaka taban kat istenilen ulaştığınızda.
2. Her bir kuyu için 92 mcL E3 embriyo orta, (H ₂ O bir 2.5 mM stok) 4 mcL Alexa Fluor-488 azid ek 2 mcL BTTES CuSO ₄ 06:01 karmaşık ve karıştırmak için hafifçe sallayın.
3. Tıklayarak kimya reaktif içeren bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak içine embriyolar transfer. Her iyi beş embriyolar daha az içermelidir.
4. Tıklama reaksiyon başlatmak için ³ 2.5 mcL taze hazırlanmış sodyum askorbat (H ₂ O, 100 mM stok) ekleyin . Her reaktifin Final konsantrasyon: Alexa Fluor-488 azid: 100 mcM; CuSO _4: 50 mcM; BTTES: 300 mcM, sodyum askorbat: 2.5 mM.
5. 3 dakika sonra, sonra tepki gidermek için 100 mcL E3 embriyo orta ile hemen sulandırmak, 2 mcL bathocuproine sülfonat (H ₂ O 50 mM hisse senedi), biyouyumlu bir bakır şelasyon ekleyin.
6. Bir cam petri embriyoların transferi ve 15 ml E3 embriyo orta ile tedavi edilen embriyoların 2 kez yıkayın.

4. Görüntüleme

1. Mattek cam alt kuyu çanak, ultra erime noktası agaroz (E3 embriyo orta% 1,2 (w / v)) bir damla koyun ve agaroz açılan bir embriyo.
2. Dorsal veya yanal embriyoların yerleştirin ve agaroz damla katılaşmaya 5 dakika buz üzerinde çanak. Agaroz açılan kapakları kadar çanak hafifçe E3 embriyo orta ekleyin.
3. Floresan ve parlak alan görüntüleri sırayla konfokal mikroskop kullanılarak elde edilir. Tüm embriyo görüntüleri 5 mikron adım aralığı kullanılarak elde edilir. Kompozit rakamlar ImageJ yazılımı kullanılarak hazırlanmıştır.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1, iki adımlı bir etiketleme stratejisi iş akışı gösterir. Şekil 2, 9.5 saat sonra döllenme (hpf) BTTES aracılı CuAAC ile zebrafish embriyoların etiketleme gösterir. BTTES tris (triazolylmethyl) amin tabanlı ligand. Situ üretilen Cu (I) ile koordine dramatik CuAAC hızlandırır ve belirgin toksisite olmadan yaşayan sistemlerinde hızla Siklokatılma tepki teşvik. 3 dakikalık bir tıklama reaksiyon hemen ardından, GSYİH-FucAl tedavi edilen embriyoların sağlam bir etiket (Şekil 2, sol panel) tespit edebilmektedir. Sadece arka plan floresan GSYİH-fucose (Şekil 2, sağ panel) ile microinjected kontrol embriyolar tespit edilmiştir.

Şekil 1 zebrafish embriyoların saran tabaka fucosylated glukanlardır etiketleme stratejisi.

Şekil 2 BTTES-Cu (I)-katalize tıklayın kimyası ile zebrafish embriyogenez sırasında fucosylated glukanlardır in vivo görüntüleme. Tek hücreli aşamasında zebrafish embriyolar tek bir doz ile GDP-FucAl microinjected ve devel izin9.5 hpf op. Embriyolar daha sonra Alexa Fluor BTTES-Cu (I) 488-azid katalize tepki. Tepki embriyolar konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülü. Aydınlık alan (alt panel); Alexa Fluor 488 floresan (üst panel) maksimum yoğunluğu z-projeksiyon görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 mm.

Sorun Giderme

Sorun	Neden	Çare
Embriyolar sağlıksız görünüm	Microinjected çözüm kirletici içerir	Nükleotid şekerlerin saflığı% 85 daha fazla olmalıdır. Kaynağını kontrol edin.
Etiketleme sonra hiçbir tepki var.	Bakır konsantrasyonu 30 mcM	Embriyoların eklerken bakır konsantrasyonu 30 mcM altında olduğunda reaksiyon hızını önemli ölçüde azalır, aşırı E3 embriyo orta ekleyerek reaksiyon çözümü sulandırmak için dikkatli olun.
Embriyolar reaksiyon sonra ölür	Embriyoların yanlış kullanım	Pipetlemeyin yangın cilalı ve reaksiyon kabı,% 0.5 'lik agaroz bir çok ince bir tabaka ile kaplı olduğundan emin olun.
Görüntüler lekeli görünüm	Reaktifler düzgün embriyoların eklemeden önce karıştırılır.	Reaktiflerin Ayrıca önerilen sırayla izleyin ve tıklama kimya reaktifleri düzgün embriyoların eklemeden önce karışık olduğunu emin olun.
Görüntüleri embriyoların zarar	Reaksiyon sırasında Güçlü zararlardan sallayarak embriyolar	Embriyoların çözüm kez en az 10 saniye süreyle yavaşça sallayın.

Tartışmalar

Görüntüleme biyomoleküllerin In vivo Kendi doğal ortamlarında kendi biyolojik faaliyetleri kritik bilgiler sağlar. Bu video, zebrafish embriyoların saran tabaka fucosylated glukanlardır etiketleme BTTES aracılı biyouyumlu CuAAC ile GSYİH FucAl ile tek hücreli aşamada embriyo ve ikinci bir adım fluorofor konjugasyon microinjecting tarafından gerçekleştirilen nasıl göstermek ³. Sağlam etiketleme 2-3 dakika içinde elde edilebilir ve etiketli glukanlardır 2.5 hpf ola...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
Bakır (II) sülfat pentahidrat	Sigma-Aldrich	203165
Alexa Fluor 488 azid	Invitrogen	A10266
dekstran, Alexa Fluor 594	Invitrogen	D-22.913
(+)-Sodyum L-askorbat	Sigma-Aldrich	A7631
Bathocuproinedisulfonic asit	Acros Organics	164060010
Cam alt kuyu çanak	Mattek	P35G-1.5-14-C