マルチカラーで神経回路の地形を明らかにし

要約

我々は、トレーサーを提供するための実用的なガイドを提供 in vivoでとマウスで成功神経回路の解析に不可欠な手順を示すために、モデル系として脊髄小脳路を使用してください。我々は詳細にAlexaの蛍光物質に結合した小麦胚芽レクチン（WGA）を悪用私たちの多彩なトレースプロトコルについて説明します。

要約

神経回路は、機能的な地形図にまとめられています。複雑な回路のアーキテクチャを視覚化するために我々は、複数の地形予測のグローバルなパターン形成を確実にラベルを付けるためにアプローチを開発した。小脳は、神経回路の整然とした配置を研究する理想的なモデルです。例えば、脊髄小脳苔状繊維のコンパートメントの組織は、苔状線維のパターン形成を研究するための不可欠なシステムであることが実証されています。我々は最近、アレクサ555と488コンジュゲート小麦胚芽レクチン（WGA）が開発し、成体マウスの脊髄小脳苔状線維の投射をトレースするために使用できることを示した（Reeberら2011）。我々は、神経突起を標識するためWGA -アレクサトレーサー望ましいツールを作る三大特性を発見した。最初に、Alexaの蛍光色素は強烈であり、その明るさは、直接トレースした後wholemountイメージングが可能になります。第二に、WGA -アレクサトレーサーは、開発の全体軌跡と大人の神経projectioにラベルを付けるNS。第三に、WGA - Alexaのトレーサーは、急速に逆行し、順行性の両方の方向に輸送される。ここでは、トレーサーと他の必要なツール、脊髄小脳トレースのための手術を実行する方法とどのように最高の三次元の画像トレースされた突起を準備する方法について詳細に説明します。要約すると、我々だけでなく小脳のでなく、皮質、脳幹、及び脊髄における機能地図の組織との接続を解読するのに有用となるステップバイステップのトレースプロトコルを提供しています。

プロトコル

1。無菌手術を用いた in vivo でのトレーサーを提供する（セクション1.1から1.16まで）

手続きを通じて、我々は標準的な無菌手術法を使用することをお勧めします。これは、滅菌手袋、ガウン、およびフェイスマスクの使用が含まれます。ツールのいずれか使用前にオートクレーブや水、次いでエタノールで十分に洗浄してください。手術中、及び動物、特にホットビーズ滅菌器（Steri 250カタログ番号18000から45、ファイン科学のツール）を持つツールと乾燥殺菌楽器オフクリーンな組織片の間に。さらに、それはあなたが動物の準備（シェービングなど）、手術、そして動物が容易に、監視暖め、そして必要に応じて鎮痛薬を供給することができるリカバリ領域に指定された領域を持っていることをあなたのワークスペースがこのような編成することが重要です。成功した生存手術の鍵は、感染のリスクを軽減し、積極的な術後ケアの戦略を維持することです。あなたがフィン可能表を参照してくださいDこのプロトコルに必要なすべての機器および試薬。

1. 0.2ml/10gramsの体重の用量で腹腔内（ip）注射により、作りたてのAVERTIN（カタログ番号T48402。2,2,2 - トリブロムエタノール、シグマ、セントルイスMO）で成体マウスを麻酔。このようなイソフルランまたはケタミン/キシラジンのような他の麻酔薬は同等に有効ですが、あなたの研究室では使用する前に、必要な制度や連邦政府の承認を得ていることを確認してください。あなたが子犬を（P0 - P10）を使用している場合は10〜15分間砕いた氷の上に麻酔ができます。冷たい水がすぐに低体温症の致死レベルを誘導するので、各子犬の皮膚が氷（例えば、ラテックスの手袋の指に置いて）との直接接触ではないことを確認してください。動物は動物の後肢に鉗子や指を使ってつま先のピンチを実行することにより麻酔の許容平野下にあることを確認してください。ペダルの反射がある場合は、動物が深いの指標として、この刺激に応答しなくなるまで、待って麻酔の平原。
2. 動物は完全に麻酔されると、その頭は離れて、あなたとあなたに向かって直面してその尾から直面していると滅菌ガーゼのパッドにその背側にそれを置く。自分自身に中枢神経系へのアクセスを得るのに十分な明確な手術野を与えるためにバリカンで毛を剃る。アルコール綿の二組、その後70％アルコール/ betadineで剃毛領域をワイプしてから、アルコール綿で一回以上の清掃。外科領域を清掃するときは、外部の円形パターンに内部を使用しています。あなたがはっきりと滅菌ガーゼパッドに小さな穴を切削して、坊主ときれいな手術部位を介して開口部を配置することで、手術野を画定することもできます。小動物で動作するときに無菌手術野の維持が難しいことができますが、そうすると感染のリスクを減らすのに役立ちます。
3. 鉗子を使って肌を持ち上げて、直接下部胸部大文字腰椎rの上記の正中線でハサミで切開を加えるegion。胸郭下部 - 腰上部は脊柱（図1）にこぶのために感じるように脊椎に沿って指を実行することによって識別することができます。
4. 筋膜と表面的な脊髄の筋肉を切り取ります。必要に応じて、血管（;カタログ番号18000から00。ファイン科学ツール、フォスターシティ、カリフォルニア州）を焼灼によって、任意の出血を止める。子犬では、綿棒と切開の周りに穏やかな圧力を適用すると、出血を止めるのに十分です。
5. 下部胸部の1つまたは2つのセグメントの棘突起を除去することによって背側椎弓切除を行います - 脊柱の両側に板を切断した後、上部腰椎脊髄、関節突起と背棘突起（図2）の中間。あなたのはさみで脊髄を損傷し、彼らは脊髄を傷つける可能性があるため常に小さな骨片を除去しないように注意してください。骨が非常にあることを意味する初期の出生後の仔ラットにおけるせき柱が完全に骨化されていないことに注意して、柔らかく、非常に簡単にカットすることができます。したがって、脊髄に損傷を与える可能性があるので、あまり深く切らないように注意してください。
6. あなたが成体マウスの背側椎弓切除を実行したくない場合は、我々はあなたがいずれの骨を切断せずに脊髄の小さな領域を露出する椎体の間に軟組織を切断できることを見出した。両方の方法は、脊髄への参入の効果的なルートであるが、背側椎弓切除を避けることが脊髄が損傷していないままであることを確認することができます。
7. Gilmontインスツルメンツ猫、マイクロシリンジを使用して、トレーサー（0.2mlのと（ナリシゲモデル001 - PC - 10からデュアルステージガラスマイクロピペットプラー;カタログ番号300056、ハーバード装置、ホリストン、MA。ホウケイ酸ガラス毛細管）プルガラス電極を埋める。＃GS - 1100）または同等のデリバリー装置。
8. マイクロマニピュレータの所定の位置にガラス微小電極を締めて、途中で半ばの間に脊髄の下部胸部、腰上部に電極0.1〜0.5ミリメートルを挿入ラインおよび脊髄の外側エッジ。動物は、注入の遺伝子座の正確な同定のため、動物を安定させるための定位固定装置（小動物定位固定装置のモデル940 -とKopfは計装から電極マニピュレータのモデル960）で開催されることがあります。また、あなたの麻酔体制がそっと動物をテーピング、深い呼吸に起因する重要な動きのない安定した平面を達成するために調整することができるかどうすれば充分です。
9. 、WGA -アレクサ555、圧力は、WGA -アレクサ488（。カタログ番号W11261、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州小麦胚芽アグルチニン、のAlexa Fluor ® 488コンジュゲート）の2％溶液の約0.5μl〜5分以上の脊髄に注入する（小麦胚芽凝集素、のAlexa Fluor ® 555コンジュゲート;カタログ番号W32464、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）、WGA -アレクサ350（小麦胚芽アグルチニン、のAlexa Fluor ® 350コンジュゲート;カタログ番号W11263、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）、WGA - HRP（小麦胚芽アグルチニン西洋ワサビペルオキシダーゼ、シグマ、セントルイス、ミズーリカタログ番号L7017）または10％の0.5μlBDA（ビオチン化デキストランアミン;カタログ番号D1956、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）リン酸塩では（;シグマ、セントルイス、MO、カタログ番号P4417 PBS）緩衝生理食塩水。繊維の大量のラベル付けにトレーサー結果のこれらのボリュームを注入する。小さいボリュームが小さい原子核を標的とするために注入する必要があります（または個々の原子核の準地域）及び各研究者が経験的に提供するために理想的なボリュームを決定する必要があります。イオントフォレーシスは、正確な注射のための正確なナノリットルの配信のために考慮されるべきである。手術中に注入のスポットを可視化するために、我々は、通常0.5％ファストグリーン（カタログ番号F7252シグマ、セントルイス、MO）ですべてのトレーサーのソリューションを補完する。
10. プルピペットの壁にくっつくの混合を防ぐために注入する前に、BDAのソリューションのすべての10μlのために、我々は（カタログ番号C8267シグマ、セントルイス、MO）コーン油の1μlを加える。あなたがピペットの外取り出しに問題トレーサーを持っていない場合は、再びゆっくり注入してみて組織の小さなポケットを作成するために先端を引っ込める。それは、目詰まりする微小電極の先端は珍しいことではありません。ほとんどの場合、ポケットには、周囲の神経細胞はトレーサーを吸収できるから貯水池を作成するのに役立ちます。常に針の付近で大規模な組織の損傷を避けるために徐々にトレーサーを取り出すことを忘れないでください。
11. ゆっくりと傷のクリップと組織の接着剤で皮膚を閉じます。あるいは、傷を閉じるために縫合糸を使用することができます。
12. 実際に手術で、少なくともこれまでのポイントまで、20分未満で完了できることに注意してください。
13. 回復までの低体温とスピードを避けるために、加熱パッド（暖房パッドのカタログ番号341241ハーバード装置から）上（ハーバード大学の装置からVetcareチャンバーモデル9.16カタログ番号340508）回復室で動物を置きます。代わりに、加熱室の多くの機種やモデルのいずれかを使用できます。呼吸数を監視し、動物が移動しようとしている兆候を調べる。ほとんどの動物は10〜15分後の手術の中で、通常は応答です。
した後、水と食料を自由に摂取し、鎮痛薬を提供してください。それはあなたの術後のケア体制の一環として、動物に目を保つために最も重要である。日常的に繰り返し痛み、不快感、感染症、十分な食べたり飲んだりするなどの徴候がないか調べ、正常に実験を完了し、すべてのあなたのために必要なケアを維持するために最適なプロトコルを開発するためにあなたの機関の動物福祉の役員や獣医師とのニーズを議論してください動物。
14. WGA -アレクサ555、WGA -アレクサ488、およびWGA - HRPは、急速に神経細胞に運ばれ、我々はその両方を出生後早期および成体マウスのアレクサ共役トレーサー24時間以内に確実にラベル長い線維路（Reeberら、2011）を発見した。その可視性は、フィルタセットの品質と感度に大きく依存する他のAlexaの色素に比べものの、WGA -アレクサ350はまた、急速に輸送される（データは示されていない;。Reeberら2011）
15. BDAは、通常より長い生存時間が完全に約11日後に犠牲にする必要がある脊髄小脳突起動物の完全なマッピングのための神経突起とそのためにトレースする必要があります。

2。順行性にトレースされる苔状線維の検出

1. それぞれの生存期間の後AVERTIN（またはお好みの麻酔薬）をマウスに麻酔。
2. 一度血が0.1M PBS（pH7.2）で灌流による心臓を通してフラッシュすべきは反射神経はありません。その後、PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で動物を灌流することによって組織を修正。あなたが分析する地域に加えて、それは常に注射がどれだけ大きいのレトロスペクティブ分析、電極に起因する組織損傷の程度を示すための注射部位から組織を取得する必要がある、と繊維で可能なラベルを識別するための通路の（図3; Mesulam、1982を参照してください。Reeberら2011。）。
3. PostfixのBRその後、4％PFAで24〜48時間灌流したマウスからのAINSとはPBS（〜2時間またはその後、組織の容器の底にシンクし、30％晩まで、または15％に希釈したバッファショ糖溶液中でそれらをcryoprotect組織シンク）。組織はその後、スクロースから削除され、穏やかにペーパータオルで乾燥dabbedして、OCT（最適切断温度、さくらファインテックアメリカ社、CA）を含む組織の金型を浸漬。その準備を切断するまで、組織を、-80℃の冷凍庫を用いて凍結し、同温度で保存されます。
4. Alexaの蛍光物質は、直接ラベリング後に表示され、追加の染色を必要としません。従って、灌流後のWGA -アレクサトレースされた組織をカットすることができ、イメージングのためにマウントされているか、または直接wholemount準備として、4％PFAで画像化。我々は4％の組織は、PFAがイメージングwholemountsでトレースされた突起の地形のための最高の屈折率を与えたその画像を発見した。セクションの場合は、シリアル40μmの厚さのコロンをカットクライオスタットでアルのセクションとPBSのフリーフローティングセクションとして、それらを収集する。 PFAの毒性を考えると、、適切なフェイスマスクが血流やイメージング中に着用されていることを確認し、換気の良い場所に保管し、使用しないときは、直ちに密閉容器に、任意のPFAまたはPFA固定組織を返します。あなたの顕微鏡は、適切なヒュームフードに置かれている場合はそれが理想的です。
5. WGA - HRP標識された繊維は、発色としてテトラメチルベンジジン（TMB）を用いて明らかにすることができる。それ以前に（。。シリトーら2010フォーゲルとPrittie 1994）に詳細に記載されているため、我々はここにHRP染色プロトコールを説明したりはしません。
6. BDAのために標識された繊維は、ストレプトアビジン- CY3（カタログ番号434315、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）またはストレプトアビジンのAlexa Fluor ® 488または555（カタログ番号S11223 488と猫のために2時間のフリーフローティング組織切片をインキュベートする。＃S21381用555、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）は、フルオロ- GELをマウント後、PBSで洗浄し。 DAB、ABC反応緩衝液（カタログ番号＃PK - 4000、V​​で一晩インキュベートして組織切片を用ectorラボラトリーズ社バーリンゲーム、カリフォルニア州）は、PBSで3回洗い、次に10μlの30％H ₂ O ₂を補充した（0.5mg/ml、ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）DABで5-10分間反応すべての50ミリリットルDAB溶液用。

3。免疫組織化学

1. 免疫組織化学（シリトーら2008）、前述のように行った。室温で16〜18時間、0.1％のTween - 20と一次抗体（下記参照）、簡単に言えば、10％NGS（シグマ、セントルイスMO NGS）を含む0.1M PBSで切片をインキュベートする。組織切片をPBSで3回洗浄し、室温で2時間の最大値（下記参照）二次抗体でそれらをインキュベートする。再び組織をすすぎ、下記のように免疫反応性を明らかにする。
2. 我々は二重染色の従来の方法を使用して自由に浮遊組織切片を共同標識プルキンエ細胞と苔状線維の間の関係を決定するために。我々は、WGA -アレクサ555使用トレースとAlexa 488結合ロバ抗マウス二次抗体（Invitrogen社/モレキュラープローブス社、カールスバッド、カリフォルニア州）のためZebrinIIを（;博士リチャードホークス、カルガリー大学、カルガリー、カナダからの厚意1:250）を検出する。 ZebrinIIは、マウスモノクローナル抗体であると過ごしたハイブリドーマの培養液から直接使用されていました。フルオロフォア標識二次抗体は1:1500の希釈で使用した。組織切片を染色した後に充電ガラススライド上にマウントされ、その後、DAPI（カタログ番号＃H - 1200、ベクターラボラトリーズ、バーリンゲームでメディアをマウントするトリス緩衝液（電子顕微鏡学、ハットフィールド、ペンシルバニア州）でまたはVectashield hardsetとフルオロ- GELを封入、CA）3色の蛍光イメージングのための。
3. 私たちは、一次抗体の非存在下で組織切片を処理することにより、二次抗体の特異性をテストした。シグナルは、我々が観察した染色は目からの非特異的なシグナルによるものではなかったことを示す、このような対照実験では検出されなかったEはAlexa標識抗体（データは示さず）。

4。顕微鏡とデータ解析

1. 私たちは、ライカDFC360 FX（蛍光）とDFC490（DABとTMBは、組織切片を反応）ライカDM5500顕微鏡に取り付けられたカメラを用いて組織切片の顕微鏡写真をキャプチャします。
2. 私たちは、ライカアプリケーションスイートとライカアプリケーションスイートFXのソフトウェアパッケージを使用して組織切片の画像を取得し、分析する。
3. wholemountsの顕微鏡写真は、ライカアプリケーションスイートFXソフトウェアを実行しているライカMZ16 FAの実体顕微鏡に取り付けられたライカDFC3000 FXのカメラを使用してキャプチャされます。
4. 私達の顕微鏡の両方がライカCY3（モデル＃11600231）とFITC（モデル＃11513880）フィ​​ルタ、および追加のA4 DAPI / UVフィルター（モデル＃11504162）とDM5500を装備しています。
5. 画像は、ライカのソフトウェアを使用して決定されるように下/露出過度のために最適化した後に取得されています。我々は、Adobe Photoshop CS4および必要に応じてWにすべての生データをインポートする電子シャープネス、明るさ、コントラストやレベルのみのため、各画像の全フィールドを修正します。他の写真編集ソフトを優先として使用することができます。
6. ここで紹介する回路は、AdobeのイラストレーターCS4で描かれた。
7. 私たちのフィルターを使用して赤色として検出されているアレクサ555とCY3ステンドニューロンは、原稿全体の提示画像の擬似カラーのマゼンタでした。

動物

すべての動物実験は医学のアルバートアインシュタイン大学の制度的なガイドラインに従って承認されたIACUC動物のプロトコル下で行った。雄と雌の非近交系スイスウェブスター（タコ、アルバニー、ニューヨーク州）または近交系C57BL6J（JAX、バーハーバー、ME）マウスは、我々のコロニーで維持し、すべての研究に使用された。膣栓が検出された日の正午は、胎生0.5と考えられた。

5。代表的な結果：

脊髄小脳求心性神経はparasagiに終了小脳におけるttalバンド（図3; Voogdら1969;。Grishkatとアイゼンマン1995;フォーゲルとPrittie 1994;ビグら、2005;。Appsとホークス2009;シリトーら2010;。。Reeberら2011）。我々は、実証するために下部胸部、上部腰椎脊髄にWGA -アレクサトレーサーを注入した：1）これらのトレーサーは、一貫して小脳の端末（図3の特定のサブセットを標識するために使用することができます。Reeberら2011）、2）。 WGA - Alexaのトレーサーは激しく明るく、全体小脳の苔状線維の地形の全体的なパターン（図3; Reeberら2011。）視覚化するために使用することができることWGA -アレクサ488と555を組み合わせて使用​​することができること、3） WGA - Alexaのトレーサーは、免疫組織化学染色（図5）との互換性があることを同じ動物（図4）、および4）で、複数の区域をトレースするため。最近の研究では、WGA -アレクサトレーサーのラベルの脊髄にトレーサーを提供する6時間後、早ければ小脳内の端末とはarchitecturをトレースするための優れた選択肢であることを示した開発経路の電子（Reeberら、2011）。

図1 生体 。A.私たちの外科領域の画像をトレーサーを提供するための機器のセットアップ。B.下部胸部、腰上部は脊柱のこぶのために感じるように脊椎に沿って指を実行することによって識別することができます。背側椎弓切除は、黄色の矢印で示されている"こぶ"、の真ん中にほぼ実行する必要があります。

図2下部胸部のイラスト- 。。。マウスの脊柱の下の胸部大文字木材の地域から無傷の脊椎分節の背側椎弓切除前後A.回路図の上部腰椎セグメントB. dorsumの複数形lの椎弓切除は、関節突起と背側の棘突起の間に板を途中で切断した後、1つまたは2つの椎体の棘突起を除去することによって行われます。

図3。WGA - Alexaのトレーサーは激しく明るく、高解像度での求心性投射の地形を視覚化するために使用することができます。 A.は、回路図には、WGA -アレクサの起源と終了555標識した脊髄小脳ニューロンを示しています。成人脊髄の下部胸部腰上部にWGA -アレクサ555提供後に注射部位のB.イメージ 。のC. Wholemount画像共同で見られるように脊髄の下部胸部、腰上部にWGA -アレクサ555の注入に続く前葉。脊髄小脳路のトレースD. WGA -アレクサ555順行性は、苔状線維のバンドを明らかにronal組織切片。小葉は、ローマ数字と数字のラベル正中線の両側に苔状線維のバンド（すべてのイメージに適用される）によって定義されます。スケールバー：B、500μmのC、500μmのD、200μmの。

図4。WGA - Alexaのトレーサーは、同じ動物に複数の神経経路を標識するために効率的です。脊髄小脳苔状線維のバンドの全体的なパターンを要約したマウスの小脳のA. Wholemount概略図。 WGA -アレクサ555は左側の同じセグメントに腰部脊髄とWGA -アレクサ488の右側に注入した。B.はとして後方小葉を切って冠状切片に見られる、両方のWGA -アレクサトレーサーだった小脳に運ばれ、正常に端末の別個のサブセットを（またReeberらを参照してください。2011）のラベル。略語：モル心血層（ML）、プルキンエ細胞層（PCL）、顆粒細胞層（GCL）、白質（WM）。スケールバー：B、100μmである。

図5。WGA -アレクサトレーサーは、ニューロンと突起の三重標識するための免疫組織化学および組織学と組み合わせて使用することができます。 A. WGA -アレクサ555は小葉IIIの苔状線維に付着される。B. ZebrinIIの染色は、神経細胞とグリア細胞核の。C. DAPI染色小葉IIIにおけるプルキンエ細胞のストライプの配列を明らかにする。D.は、パネルの画像をマージ、B 、および求心性バンド、プルキンエ細胞のストライプ、および一般的な細胞構築のトリプルラベルを示すC。EH。パネルのADに示されている箱入りの地域の高倍率画像。プルキンエ細胞のストライプは、（前述のように番号が見直されるで（アプリとホークス2009））。略語：分子層（ML）、プルキンエ細胞層（PCL）、顆粒細胞層（GCL）。スケールバー：D、500μm以下（AC用）、H、500μm以下（EG用）。

ディスカッション

我々は急速に発展し、成体マウスでは神経突起を標識するための新規蛍光ベースのアプローチを使用してトレースする軸索に成功し、樹状突起に必要な外科的および技術的な詳細を記載している。 WGA -アレクサを使用して、我々は、トレーサーとマーカーが高解像度で三次元のパターン化された回路の地形を分析するために使用することができる方法を示します。

多く?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
機器/試薬	モデル/カタログ番号	会社
ビーズ滅菌器	モデルは250猫をSteri。 ＃18000から45	ファイン科学ツール
Cauterizer	ネコ。 ＃18000から00	ファイン科学ツール
ホウケイ酸ガラス毛細管	ネコ。 ＃300056	ハーバード装置
デュアルステージガラスマイクロピペットプラー	モデル001 - PC - 10	ナリシゲ
マイクロメータの注射器	ネコ。 ＃GS - 1100	Gilmontインスツルメンツ
小動物の定位音源	モデル940 -	Kopfは計装
電極マニピュレータ	モデル960	Kopfは計装
Vetcare室	ネコ。 ＃340508	ハーバード装置
暖房パッド	ネコ。 ＃341241	ハーバード装置
ライカDFC360 FXカメラ	DFC360 FX	ライカ
ライカDFC490カメラ	DFC490	ライカ
ライカDM5500顕微鏡	DM5500	ライカ
ライカDFC3000 FXカメラ	DFC3000 FX	ライカ
ライカMZ16 FA顕微鏡	MZ16 FA	ライカ
CY3フィルター	モデル＃11600231	ライカ
FITCフィルター	モデル＃11513880	ライカ
A4 DAPI / UVフィルター	モデル＃11504162	ライカ
小麦胚芽アグルチニン、のAlexa Fluor ® 488コンジュゲート	ネコ。 ＃W11261	インビトロジェン
小麦ドイツメートル凝集素、のAlexa Fluor ® 555コンジュゲート	ネコ。 ＃W32464	インビトロジェン