STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

要約

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4 mlから人間性IPSCの生成のためのシンプルで効果的なプロトコルを示しています。容易に入手可能な血液細胞の再プログラミングすることは、より広い研究コミュニティがアクセスすることによって、IPSCの技術の利用を促進することを約束します。

要約

4つの転写因子の異所性発現は、あるOct4、Klf4の、Sox2、およびCMYCを通して、人間の体細胞は、いわゆる人工多能性幹細胞（性^{IPSC）1-4を}生成^し 、多能性状態に変換することができます。患者固有性IPSCは、胚性幹細胞（ESC）を囲む、可能な免疫拒絶を回避したい倫理的な問題を欠いている。したがって、性IPSCは疾患モデル研究、薬理学的化合物のスクリーニング、及び再生治療⁵のためのかなりの注目を集めている。

私たちは、山中因子^6をコード^する単一^のポリシストロン切除可能レンチ幹細胞カセット（STEMCCA）を使用して異なる肺疾患の患者から導入遺伝子を含まない人間性IPSCの発生を示している。これらIPSC行は皮膚線維芽細胞、再プログラムのために使用される最も一般的な細胞型から生成された。通常は、線維芽細胞を得ることがパンチ生検、細胞の膨張が続く肌を必要とするいくつかの通路のための文化の中での。重要なのは、グループの数は性IPSC ^7月9日にヒト末梢血細胞の再プログラム化を報告している。ある研究では、STEMCCAベクトルのTet誘導性バージョンが血液細胞を同時にリバーステトラサイクリントランスアクチベーターをコードして恒常的に活性なレンチウイルスに感染していることが必要とされ^、9を採用した。線維芽細胞とは対照的に、末梢血細胞が大幅に患者の不快感や苦痛を減らし、低侵襲の手順を介して収集することができます。構成単切除可能ベクターを用いて血液細胞を再プログラミングするためのシンプルで効果的なプロトコルは、より広範な研究コミュニティがアクセスすることによって、IPSC技術の応用を促進することがあります。さらに、末梢血細胞の再プログラミングすることは皮膚生検を回避すべきで個人からの性IPSCの生成ができるようになります（ すなわち 。瘢痕異常）または起因する既存の疾患状態preventiにパンチ生検にngのアクセス。

ここでは、構成的に4因子を発現する単一フロックス化、切除可能レンチウイルスベクターを用いた末梢血単核細胞（PBMC）から人間性IPSCの世代のためのプロトコルを示しています。 STEMCCAレンチウイルスで形質導入される前を含む培地アスコルビン酸、SCFは、IGF-1、IL-3およびEPOの^10,11に記載され^ているよう^に採取直後または解凍PBMCは9日間に展開されます。次いで、細胞をMEFの上にプレーティングとESCのようなコロニーが2週間後に感染可視化することができる。最後に、選択されたクローンを増殖させ、多能性マーカーSSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81の発現のためにテストされています。このプロトコルは、血液の容易にアクセス可能な4ミリリットルから人間性IPSCの生成のための信頼性のある方法論を提供し、シンプル、堅牢で非常に一貫しています。

プロトコル

1。末梢血単核細胞（PBMC）の単離と拡大

0日目

1. クエン酸ナトリウムのBDバキュテイナーCPTの細胞調製チューブに末梢血4mlを描く。チューブ8〜10回転倒し、室温で30分間1800×gで遠心分離します。理想的には、このステップは、採取後2時間以内に行う必要があります。
2. 滅菌15mlコニカル遠心管に軟膜（ゲルバリアーとプラズマとの間の細胞層）をピペッティングにより単核細胞（MCS）を収集します。 15分間、300×gで数回、遠心反転、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で10mlに総量を持参してください。
3. 滅菌した10mlのPBSに細胞を再懸濁し、細胞数を実行します。 10分間、300×gで滅菌15mlコニカル遠心管と遠心分離機に1〜2×10 ^6個の細胞を移す。
4. 拡張培地2ml（EM）（50μg/ mlのASCOを含むQBSF-60幹細胞培地で細胞を再懸濁rbic酸、50 ng / mlで、SCF、10 ng / mlのIL-3、2 U / mlのEPOは、40 ng / mlで、IGF-1、1μMのデキサメタゾンおよび100μg/ mlのprimocinまたは1％ペニシリン/ストレプトマイシン）とに転送12ウェルプレートのウェル1。 5％CO ₂インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。
5. 300×で残った細胞を遠心 10％DMSOを含有FBS中で10分間凍結〜2×10 ⁶細胞/バイアル用グラム。
6. 凍結PBMCを使用して、プロトコルを起動するには、10分間、300×gでQBSF媒体および遠心分離機10mlに細胞の1バイアルを解凍します。 EMの2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、12ウェルプレートの1ウェルに移す。 5％CO ₂インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。

3日目、6日目

17. 滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し、付着細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。
18. 10分間300 xgで細胞を遠心分離します。
19. EMの2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、12の1つのウェルに移すウェルプレート。 5％CO ₂インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。

2。 STEMCCAレンチウイルスによる末梢血単核細胞の形質導入

DAY 9

1. 滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し、付着細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。
2. 10分間300 xgで細胞を遠心分離します。
3. 5ポリブレンとSTEMCCAレンチウイルスのμg/ mlの（MOI = 1から10）、12ウェルプレートのウェル1への転送を含む新鮮なEMの1ml中に細胞を再懸濁する。 （レンチウイルス粒子の産生を記述するプロトコルがで見つけることができますhttp://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ ）
4. 90分間25℃で2250 rpmで皿回しをする。
5. スピンした後、新鮮なEMの追加の1ミリリットルを追加 、2mlの培地の合計ポリブレンの5μg/ mlを含有し、37℃でプレートをインキュベート5％CO ₂インキュベーター。

10日目

16. 滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し、付着細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。
17. 10分間300 xgで細胞を遠心分離します。
18. EMの2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、12ウェルプレートの1ウェルに移す。 5％CO ₂インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。

3。メッキのMEFに形質導入​​細胞

11日目

1. コート^{2×10 5}細胞で0.1％のゼラチンと板不活性化されたマウス胚性線維芽細胞（MEF）を持つ/ウェルのMEF培地（IMDMを10％FBS、1％非必須アミノ酸を含む、100μMのβ-6ウェルプレートのウェルメルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、100μg/ mlのprimocinまたは1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。感染当たり3ウェルを準備します。

12日目

2. 滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し接着した細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。
3. EM培地（50μg/ mlのアスコルビン酸、50 ng / mlのSCF、10 ng / mlのILで使用したのと同じ濃度で10 ng / mlのbFGFは、アスコルビン酸および成長因子を含むMEF培地3mlに細胞を再懸濁-3、2 U / mlのEPOは、40 ng / mlで、IGF-1、1μMデキサメタゾン）。
4. MEFを含む6ウェルプレートのウェルあたりの細胞のプレート1ミリリットル。 /ウェルの培地を2.5mlの合計のためのbFGF、アスコルビン酸、および増殖因子とMEF培地の1.5 mlを加える。
5. 25℃で500rpmで皿回しをする℃で30分間。 37℃、5％CO ₂インキュベーター中で静置します。

14日目

6. 10 ng / mlのbFGFおよび50μg/ mlのアスコルビン酸（無成長因子）を含むのMEF培地2.5 mlで一日おきに細​​胞を養う。各フィードで浮遊細胞を吸引して廃棄します。
7. （通常週1回）、必要に応じて追加のMEFを追加します。

P ">〜20日目

8. かつて小さなコロニーが送り細胞がヒト胚性幹細胞（hESCの）培地（DMEM/F12含む20％ノックアウト血清代替、1％非必須アミノ酸、100μMのβ-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミンの2ミリリットルとの毎日、現れる、100μg/ mlのprimocinまたは1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10 ng / mlのbFGF）の。

4。ピッキングとIPSCクローンの拡大

〜DAY 30から40

1. 12ウェルプレート不活性化されたMEFを含む1ml /ウェルのhESCの培地プラスStemolecule Y27632の1​​0μM（ROCK阻害剤）との事前作成の個々のウェルに各コロニーを拾う。
2. 唯一のhESC培地1ml（NO ROCK阻害剤）で、その後毎日の細胞を養う。

5。多能性マーカーのための免疫蛍光染色

1. 染色はミリポアキット "ES細胞マーカーサンプルキット"を使用し、製造業者のプロトコールに従って行った。

6。 INTEGの切除格STEMCCAベクトル

1. カセットを再プログラミングの切除は、Cre-IRES-Puroの発現ベクターをトランスフェクション後および^6に記載され^ているよう^に簡単なピューロマイシンによる選択を利用して達成されています。

結果

我々は、単一のレンチウイルスベクターを用いた末梢血単核細胞から人間性IPSCの生成のためのシンプルで効果的なプロトコルを示しています。 図1Aは、プロトコルの略図を示す。血液はクエン酸ナトリウムとBDバキュテイナーCPTの細胞調製チューブに採取し、遠心分離後、単核細胞はポリエステルゲルと血漿（バフィーコート）（ 図1B）との間のインターフェースか...

ディスカッション

我々は、ここたて​​採取した末梢血数ミリリットルから単離された単核細胞から人間性IPSCを生成するためにSTEMCCAレンチウイルスベクターの使用を記載している。遠い場所から取得されたドナー細胞を利用する際のプロトコルはまた、重要な実用的な含意の詳細（バフィーコートから直接取得した）凍結PBMCを再プログラムするために使用することができます。プログラミングの誘導前に、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
クエン酸ナトリウムのBDバキュテイナーCPTの細胞調製チューブ	BD Biosciences社	362760
QBSF-60幹細胞培地	生物学的な質	160-204-101
IMDM	インビトロジェン	12440
DMEM/F12	インビトロジェン	11330
FBS	アトランタバイオ	S10250
ノックアウト血清代替	インビトロジェン	10828
Primocin	Invivogen	ANT-PM-2
ペニシリン/ストレプトマイシン	インビトロジェン	15140
L-グルタミン	インビトロジェン	25030
非必須アミノ酸	インビトロジェン	11140
β-メルカプトエタノール	MPバイオメディカル	190242
アスコルビン酸	シグマ	A4544
IGF-1の	R＆Dシステムズ	291-G1
IL-3	R＆Dシステムズ	203-IL
SCF	R＆Dシステムズ	255-SC
EPO	R＆Dシステムズ	286-EP
デキサメタゾン	シグマ	D4902
ポリブレン	シグマ	H-9268
bFGFの	R＆Dシステムズ	233-FB
Stemolecule Y27632	ステムジェント社	04から0012
ES細胞マーカーサンプルキット	ミリポア	SCR002