初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離

要約

私たちは、初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ多能皮膚由来の前駆体（SKP）細胞を単離する方法を報告する。我々は、線維芽細胞培養物に由来するこれらのSKPsは、ヒト皮膚生検から直接誘導されるものに類似した幹細胞の特性を共有することを示している。これらの細胞は、そのようなOCT4とNanogのような多能性マーカーに加えて、神経堤マーカー、ネスチンを発現。

要約

過去10年間で、いくつかの成体幹細胞集団はヒトの皮膚^1-4に同定されている。多能成人皮膚前駆体の単離は、最初の⁶ミラーF. D実験室^5、により報告された。これらの初期の研究では成体哺乳類の真皮⁵から多能性前駆細胞集団を記述した。これらの細胞は-と呼ばSKPs、皮膚由来の前駆体のためには、 -単離され、げっ歯類とヒトの皮膚から拡大し、そのようなニューロン⁵などの皮膚に見たことがない種類の細胞を含む神経と中胚葉の両方の子孫へと分化させた。培養SKPs上の免疫細胞化学的研究は、細胞は、フィブロネクチンおよび多能性幹細胞マーカー⁶に加えて、ビメンチンおよびネスチン、神経および骨格筋において発現前駆体中間体フィラメントタンパク質を発現することを明らかにした。今までは、成体幹細胞集団のSKPsを、新たに収集された哺乳動物の皮膚生検から単離されている。 ve_content ">最近、我々は皮膚の人口に由来前駆細胞は、皮膚生検⁷から確立された主要な線維芽細胞培養中に存在し続けたことを確立し、報告している。少数体性幹細胞は、早期の集団倍加一次線維芽細胞培養にある可能性があることは前提だった（1）SKPs及び一次線維芽細胞培養は、真皮から誘導されるので、SKP少数の細胞は、一次皮膚線維芽細胞培養物とされている凍結アリコートから成長した（2）一次線維芽細胞培養物中に存在残る可能性が以下の観測結果に基づいて⁷生残った少数の細胞を含有する貯蔵又は転送時に好ましくない温度にさらさこれらの稀な細胞を数回拡大すると、継代され得ることができた。この観察は示唆高い増殖能やストレスに対する抵抗性を有する細胞の数が少ないヒト線維芽細胞培養⁷に存在していた。

我々は、世界中の組織バンク（ 図1）から容易に入手可能である一次線維芽細胞培養からの成体幹細胞の迅速な分離のためのプロトコルを確立するために、これらの知見を利用した。線維芽細胞培養がで稀な遺伝性疾患と同様にモデリング疾患の根底にある分子機構を分析するための新しい機会を開くため、組織バンクから入手可能かもしれないが皮膚サンプルにアクセスできないときには前駆細胞の単離を可能にするため、この方法では、重要な意義を持っているディッシュ。

プロトコル

1。プライマリ線維芽細胞培養からSKPアイソ

1. 線維芽細胞培養物のいずれか細胞バンクから、または直接、皮膚生検から得られた15％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、10 mg / mlのペニシリン、および10 mg / mlのストレプトマイシンを含有する繊維芽細胞増殖培地DMEMで培養で維持される。

ヒト線維芽細胞GMO3349CとGMO8398Aは、医学研究のための医学研究所（キャムデン、NJ）から得られた結果であり、本研究で使用した。

2. 集団倍加から培養物（PPDファイル）が20〜35は80％の集密度でSKP培養に用いた。 One 10センチ組織培養ディッシュ（BDファルコン）は、約1.5×10 ^6個の細胞が含まれています。
3. ℃で37℃で1時間、2ミリリットルトリプシン溶液（0.25％、Invitrogen社）を含むPBSとインキュベートして細胞を洗浄
4. 5ミリリットルのPBSでプレートから細胞を回収し、15ミリリットルファルコンチューブに細胞懸濁液を移す。
5. 24時間4℃で細胞をインキュベート。
6. DMEM-F12、3:1（V / V）および40 ngの/ mlのFGF2（BD Biosciences社、20 ngの/ mlのEGF（BD Biosciences社）、B27血清フリーサプリメント2％（Invitrogen）を、1μgの成るSKP増殖培地を調製/ mlのファンギゾン（Invitrogen社）および25μmの/ mlのゲンタマイシン（Invitrogen社）。
7. ペレットを5分間1,200 rpmで細胞および4ミリリットルSKP増殖培地中で直接細胞ペレットを再懸濁し。 25cm ^2の組織培養フラスコ（BDファルコン）に細胞懸濁液を移す。
8. 37℃でフラスコをインキュベートすると、3〜4週間毎日球形成のために文化を監視します。

2。球の培養条件

1. 37°C、5％CO ₂で25cm ^2のフラスコ（BDファルコン）における培養細胞。
2. フラスコの底に付着した細胞を回避するために、積極的に毎日のフラスコを振る。必要であれば、接着細胞を切り離し、新しいフラスコに文化を転送するには、2 mlの滅菌ピペットでピペッティングと。
3. 最初の球は3トン以内の構築を開始O 4日。
4. 3日おきにフラスコの底に球が沈殿しましょう​​と培地の半分を変更してください。成長因子の同一の最終濃度を維持するためには、新たに調製したSKP増殖培地に2X成長因子を追加します。
5. 4ミリリットル最大音量を一定に保つ。
6. 球が〜200mmのサイズに達すると、それらは激しく2ミリリットルピペットで上下にピペッティングによって小さいサイズに球を分解することによって継代されるべきである。
7. 文化は）ステップ2.4で説明したようにフィード二つ25cm ^2のフラスコ（BDファルコン）と球培養に分割されます。
8. 球体21日16によってスクリーニング幹細胞マーカーのために収集される。

2.6から手順）と2.7）が（1）〜球の伝播を記述する各球内のすべてのセルにアクセスするために、（2）先使用をSKP球文化を拡大するSKP培地に含まれる栄養分や成長因子を可能にします。

当社CU下通常スフィア培養lture条件は、3ヶ月の期間を上に成長する能力を維持し、3〜4回の間で継代する。

3。幹細胞マーカーのための免疫細胞化学

1. 球培養物を、16日目で21にPBSで収穫される。文化は5分間1,000 rpmでペレット化されています。
2. 球はPBSを少量に再懸濁する。
3. 顕微鏡スライド（フィッシャーブランド）で直径約0.5μmのDAKOペンで二つの円を描画します。
4. サークルに球懸濁液50μLを加える。
5. 各ドロップ球の存在を光学顕微鏡で確認してください。
6. ボンネットの下に滴が乾燥してみましょう。
7. どちら-80℃でスライドを凍結または免疫蛍光染色プロトコルを進める。
8. 免疫蛍光染色のために、10分間-20℃で予冷メタノール（100％）でスライドを固定します。
9. PBSでスライドを洗浄します。
10. PBS/10％ウシ胎児血清/ 0.02％トリトンX100でスライドをブロック少なくとも1時間。
11. PBS/10％4で室温で2時間または一晩のためにFBS℃まで：ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体（ 例えば 、抗ネスチン、抗Oct4の、抗TG30、抗Nanogの抗体を、 表3）とインキュベート
12. ブロッキング緩衝液で3回洗浄し、室温で1時間二次抗体と共にインキュベートする。
13. PBSでバッファと3回をブロックで3回洗浄します。
14. ベクタシールドマウント培地（株式会社ベクター）でスライドをマウントします。
15. 免疫蛍光顕微鏡検査によって幹細胞マーカーの発現のためのサンプルを分析する。

4。幹細胞マーカーの発現レベルのリアルタイムPCR解析

1. 18日目から21日まで約2〜3ミリリットルのスフィアの文化を取る。
2. ペレットを5分間1,200 rpmで球とすべて培地を吸引。
3. をRNeasyミニキット（キアゲン、バレンシア、CA）を使用して、球からRNAを分離します。
4. 分析し、アガロースゲルでのRNA純度を評価する。
5. テンプレートとして全細胞RNAを用いて（オムニスクリプト逆転写酵素（キアゲン））cDNAを合成。
6. 20μlの各プライマーの375 nmおよびテンプレート50ngの濃度のパワーのSYBR Green PCRマスターミックス（Applied Biosystems社）における幹細胞マーカー（ 表1に示されている）のためのリアルタイム-PCRプライマーを用いによって幹細胞マーカーを検証反応容積。 GAPDHは、内在性コントロールとして使用される。
7. 増幅のために95℃で初期変性95℃で40サイクル℃で5秒、20秒のために60°CのためのCに続いて2.5分のためのCを使用しています。
8. 2（ΔΔCT）法⁸と走りを分析します。

5。平滑筋細胞内に向け分化

1. 一日21〜26球はSKP培地中で6ウェル培養皿（BDファルコン）に播種した。
2. 細胞は、72時間付着し、SKP培地中球から脱却させた。
3. 平滑筋細胞（平滑筋細胞）differentiatイオンは、高グルコース5％FBS、5 ngの/ mlのPDGF-BB（Invitrogen社）、および2.5 ng / mlのTGF-B1（Invitrogen）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（Invitrogen）を成るSMC分化培地で培地に交換することによって開始開始。
4. 媒体は文化で、3〜4週間の期間のために新たに調製SMC分化培地で3日ごとに変更されました。
5. SMCマーカーのスクリーニングは、免疫組織化学によって、3〜4週間後に行った。
6. 細胞を10分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。
7. 細胞をPBSで30分間、0.3％トリトンX-100を含有する透過処理した。
8. 細胞は、3.15へ）を室温で1時間αSMA（MO851、ダコ、1:100）、またはカルポニン（M3556、ダコ、1:100）に対する抗体でインキュベートし、3.12で説明したようにさらに処理された）。

結果

我々は、最近^7を報告したように選択的にEGFとFGF2からなる制御された成長条件の下でSKP球を生成するために展開した細胞の集団は、一次皮膚線維芽細胞培養（ 図1）中に存在することを示している。

典型的には、細胞バンクから入手可能な一次線維芽細胞株に対応するPPDは15〜25線維芽細胞培養は、本研究で使用した。この方法で説明した24時間のため...

ディスカッション

本明細書に記載した方法を用いて、ナイーブ皮膚幹細胞は、一次皮膚線維芽細胞培養物から単離することができる。このアプローチを使用して、我々は最近まれな遺伝症候群、ハッチンソン·ギルフォード早老症候群⁷患者由来線維芽細胞培養からの成体幹細胞の単離と特性を報告した。としてそれらの前駆細胞を発現幹細胞マーカーは自己再生が可能であり、（お願いヴェンツェル

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
Table 2. Specific reagents and equipment.