Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Резюме

Мы сообщаем о способе выделения наивным мультипотентны, полученных из кожи предшественника (SKP) клеток из первичной культуры фибробластов человека. Покажем, что эти SKPs, полученных из культур фибробластов имеют сходные свойства стволовых клеток, чтобы те, выводится непосредственно из биопсии человеческой кожи. Эти клетки экспрессируют нервной маркер гребень, нестин, в дополнение к мультипотентных маркеры, такие как OCT4 и Nanog.

Аннотация

За последнее десятилетие в ряде популяций взрослые стволовые клетки были идентифицированы в коже человека ^1-4. Выделение кожного мультипотентны взрослых прекурсоров был впервые сообщил Миллер F. D лаборатории ^{5, 6.} Эти ранние исследования, описанные мультипотентны популяции клеток предшественников от взрослых млекопитающих дермы ^5. Эти клетки - называют SKPs, для кожи полученных предшественников - были выделены и расширена от грызунов и человека кожи и дифференцировались в обоих нервных и мезодермального потомство, в том числе типов клеток не найден в коже, такие как нейроны ^5. Иммуноцитохимическая исследованиях на культуре SKPs показали, что клетки экспрессируют нестин и виментин, промежуточный белок нити выражены в нервной и предшественников скелетных мышц, в дополнение к фибронектин и мультипотентных стволовых клеток маркеры ^6. До сих пор взрослые стволовые клетки SKPs населения не были выделены из свежесобранных млекопитающих биопсии кожи. ve_content "> В последнее время мы создали и сообщил, что население шкуру, полученную клетки-предшественники могли остаться присутствует в первичных культурах фибробластов устанавливается с биопсии кожи ^7. предположение, что несколько стволовых соматические клетки могут находиться в первичных культурах фибробластов на ранних удвоения населения был основанных на следующие замечания: (1) SKPs и первичных культурах фибробластов являются производными от дермы, и, следовательно, небольшое количество клеток SKP могли остаться присутствует в первичных культурах фибробластов кожных и (2) первичных культурах фибробластов, выращенных из замороженного аликвоты, которые были подвергается неблагоприятным температура во время хранения или передачи содержал небольшое количество клеток, которые остаются жизнеспособными ^7. Эти редкие клетки смогли расширить и может быть пассировать несколько раз. Это наблюдение предположить, что небольшое число клеток с высокой активностью пролиферации и устойчивость к стрессу присутствовали в человеческих культурах фибробластов ^7.

Мы воспользовались этими выводами установить протокол для быстрого выделения взрослых стволовых клеток из первичных культурах фибробластов, которые легко доступны из ткани банков по всему миру (рис. 1). Этот метод имеет важное значение, поскольку она позволяет изолировать клетки-предшественники, когда образцы кожи не доступны в то время культур фибробластов могут быть получены от банков тканей, тем самым, открывая новые возможности для того чтобы рассечь молекулярные механизмы, лежащие в основе редких генетических заболеваний, а также заболеваний в моделировании блюдо.

протокол

1. SKP Изоляция от первичных культурах фибробластов

1. Фибробластов культур или из банков клеток или получен непосредственно из биопсии кожи поддерживают в культуре фибробластов ростовой среде DMEM, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 10 мг / мл пенициллина и 10 мкг / мл стрептомицина.

Фибробласты человека GMO3349C и GMO8398A были получены из Coriell института медицинских исследований (Камден, Нью-Джерси) и были использованы в данном исследовании.

2. Культуры из удвоений популяции (ОПП) от 20 до 35 были использованы для SKP культур при слиянии 80%. Один 10 см культуре ткани блюдо (BD Falcon), содержит около 1.5x10 ⁶ клеток.
3. Мытье клеток с PBS и инкубируют с 2 мл раствора трипсина (0,25%, Invitrogen) в течение 1 часа при 37 ° С.
4. Собирают клетки от пластины с 5 мл PBS и передачи клеточной суспензии в 15 мл трубки сокола.
5. Клетки инкубируют при 4 ° С в течение 24 час.
6. Подготовка SKP роста среде, состоящей из DMEM-F12, 3:1 (об / об) и 40 нг / мл FGF2 (BD Biosciences, 20 нг / мл EGF (BD Biosciences), B27 бессывороточной добавка 2% (Invitrogen), 1 мкг / мл Fungizone (Invitrogen) и 25 мкм / мл гентамицина (Invitrogen).
7. Гранул клетки при 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин и ресуспендируют осадок клеток непосредственно в 4 мл среды роста СКП. Передача клеточной суспензии до 25 см ² культуре ткани колбы (BD Сокол).
8. Инкубируют в колбе при 37 ° С и контролировать культуру сферы образование в день в течение от 3 до 4 недель.

2. Условия сфере культуры

1. Культуры клеток в 25 ^см2 колбы (BD Falcon), при 37 ° С, 5% СО _2.
2. Встряхнуть колбу энергично ежедневно, чтобы избежать клеток прикрепляться к нижней части колбы. При необходимости пипетку вверх и вниз с 2 мл стерильной пипетки, чтобы отделить прилипшие клетки и передавать культуру в новую колбу.
3. Первая сферах начать строить в 3 тO 4 дней.
4. Пусть сферы осадок на дно колбы и изменение половины среды каждые 3 дня. Для поддержания же самой конечной концентрации факторов роста добавлять 2X факторов роста в свежеприготовленной ростовой среды СКП.
5. Держите постоянным объемом не более 4 мл.
6. Когда сферах достигают размера ~ 200 мм, то они пассировать счет разрушения сфер меньшего размера энергичным пипетки вверх и вниз с 2 мл пипетки.
7. Культура состоит из двух 25 ^см2 колбах (BD Falcon), и сферы культуры корма, как описано в пункте 2.4).
8. Сферы собираются для маркеров стволовых клеток скрининга днем ​​от 16 до 21.

Процедуру 2.6) и 2.7) описывают распространение сфер (1) позволяет питательные вещества и факторы роста включены в среднесрочный SKP получить доступ ко всем клеткам в каждой сфере и (2), чтобы развернуть SKP сфере культуры перед использованием.

Обычно сфера культуры под нашим у.е.lture условиях поддержания способность расти в течение трех месяцев и пассируют в пределах от 3 до 4 раз.

3. Иммуноцитохимическая для маркеров стволовых клеток

1. Сфера культур собирают в PBS на день 16 до 21. Культуры осаждали при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин.
2. Сферы ресуспендировали в небольшом объеме PBS.
3. Нарисуйте два круга с ручкой ДАКО около 0,5 мкм в диаметре под микроскопом (Fisher бренда).
4. Добавить 50 мкл суспензии в сфере кругах.
5. Проверка с помощью световой микроскопии на наличие сфер в каждой капле.
6. Пусть капли сухого под капотом.
7. Либо заморозить слайды при температуре -80 ° C или переходите к протоколу окрашивания иммунофлюоресцентным.
8. Для окрашивания иммунофлюоресценции, исправить слайды с предварительно охлажденным метанолом (100%) при температуре -20 ° С в течение 10 мин.
9. Вымойте слайды с PBS.
10. Блок слайды с ЗФР/10% эмбриональной телячьей сыворотки / 0,02% Triton X100течение по крайней мере 1 час.
11. Инкубируют с первичным антителом (например, анти-Nestin, анти-Oct4, анти-TG30, анти-антител Nanog, таблица 3) разводили в блокирующем буфере: ЗФР/10% FBS в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
12. Промыть 3 раза блокирующим буфером и инкубировали со вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре.
13. Промыть 3 раза блокирующим буфером и три раза PBS.
14. Горы слайды с Vectashield монтажа среды (Vector Inc.)
15. Анализ образцов на экспрессию маркеров стволовых клеток с помощью иммунофлуоресценции микроскопии.

4. Realtime ПЦР-анализ уровня экспрессии маркеров стволовых клеток

1. Берут примерно 2-3 мл сфере культуры с 18 дня до 21.
2. Гранула сферы на 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин и аспирации всех средних.
3. Изолят РНК из сфер использованием Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA).
4. Оценка чистоты РНК спектрометрии и агарозном геле.
5. Синтезировать кДНК (Omniscript обратной транскриптазы (Qiagen)) с использованием полной клеточной РНК в качестве матрицы.
6. Подтвердить маркеров стволовых клеток путем реальном времени ПЦР с использованием праймеров для маркеров стволовых клеток (см. таблицу 1) в мощность SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) в концентрации 375 нМ каждого праймера и 50 нг матрицы в 20 мкл реакционного объема. GAPDH используется в качестве эндогенного контроля.
7. Для амплификации использовать первоначальной денатурации при 95 ° С в течение 2,5 мин с последующими 40 циклами при 95 ° С в течение 5 сек и при 60 ° С в течение 20 сек.
8. Анализ выполняется с 2 (ΔΔCt) Способ ^8.

5. Направленной дифференцировки в клетках гладкой мускулатуры

1. Сферы с первого дня с 21 по 26 высевали в 6-луночные планшеты для культивирования (BD Falcon), в среду СКП.
2. Клетки позволено придерживаться и перерастают из сферы в среду СКП в течение 72 часов.
3. Клетки гладких мышц (ГМК) differentiatион начала инициированной заменены среде с SMC дифференциации среды, состоящей из высоко-глюкозы Игла, модифицированной Дульбекко среде (Invitrogen), содержащей 5% FBS, 5 нг / мл PDGF-BB (Invitrogen) и 2,5 нг / мл TGF-b1 (Invitrogen) .
4. Среду меняли каждые 3 дня свежеприготовленным SMC среднего дифференциации на срок от 3 до 4 недель в культурах.
5. Скрининг на маркеры SMC проводили через 3 до 4 недель с помощью иммуногистохимии.
6. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом раствора в PBS в течение 10 мин.
7. Клетки были проницаемыми ЗФР, содержащим 0,3% Тритон Х-100 в течение 30 мин.
8. Клетки инкубировали с антителами против αSMA (MO851, Dako, 1:100) или calponin (M3556, Dako, 1:100) в течение 1 часа при комнатной температуре и далее обрабатывают, как описано в 3,12) до 3,15).

Результаты

Мы показали, что популяция клеток, которые селективно расширить для создания СКП сфере при контролируемых условиях роста, состоящие из EGF и FGF2 присутствуют в первичных культурах фибробластов кожные (рис. 1), как мы недавно сообщила ^7.

Фибробластов культур о?...

Обсуждение

С помощью способа, описанного здесь, наивных кожные стволовые клетки могут быть выделены из первичных культур кожных фибробластов. Используя этот подход, мы недавно сообщали выделение и характеристика взрослых стволовых клеток из культуры фибробластов, взятых от пациентов с редким г?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
Table 2. Specific reagents and equipment.