標的ウイルスタンパク質の分析はHER2 +腫瘍に配信ナノ粒子

要約

この記事の詳細腫瘍標的ナノ粒子、HerDoxの光学イメージング解析のための手続き。特に、ターゲティングおよび腫瘍浸透性を評価する腫瘍を検出するためのマルチモードの撮像装置の詳細な使用がここで記載されている。

要約

HER2 +腫瘍標的ナノ粒子、HerDoxは、HER2 +癌の動物モデルにおいて腫瘍優先的な蓄積および腫瘍増殖アブレーションを示す。 HerDoxは、小さな核酸リンカーを介して、化学療法剤、ドキソルビシン、腫瘍標的細胞透過タンパク質の非共有結合性の自己集合によって形成される。求電子性、インターカレーション、及びオリゴマーの相互作用の組み合わせは、ラウンド10〜20 nmの粒子に自己組織化を促進する。 HerDoxは異なる温度で血液中と同様、拡張ストレージに安定性を示す。心臓と肝臓（非標的ドキソルビシンによってマークされた被害を受けている）を含む非腫瘍組織には検出副作用、腫瘍細胞死における担癌マウス結果のHerDoxの全身送達。 HER2上昇が上昇したHER2のレベルを表示する腫瘍細胞の発現と比較して、よりHerDox蓄積を示すため、ヒト上皮成長因子受容体を発現する細胞を標的容易インビトロおよびインビボの両方で 、より低いレベルを歌う。 現場共焦点とスペクトル解析にと組み合わせる蛍光強度イメージングは、私たちが標的生体内腫瘍と全身送達後HerDoxの腫瘍細胞の浸透に確認することができました。全身送達後のマルチモードイメージングを介して標的の腫瘍を評価するためここでは詳細私たちの方法を。

概要

腫瘍ターゲティング化学療法の、配信療法のよりは、その目的の宛先に蓄積ではなく、非腫瘍組織に配布することができるので、関連性の低い薬に比べ低用量でがん細胞を排除する可能性を秘めている。後者の状況は、薬物の有効性を希釈し、より高い用量が効果的であることが必要となるので、腫瘍標的は、標準的な非標的治療上の両方の治療と安全性の利点があります。

自己組織化ナノ粒子にカプセル化することにより化学療法を標的とする薬剤が化学的に共有結合する分子を標的にリンクされている薬とは対照的に変更されていないままにすることができます。などの結合は、薬物および標的分子の両方の活性を変化させる可能性を有し、非共有結合アセンブリは、薬物の効力を保持することができる。

我々は以前に新規な三成分、自己組織化錯体、HerDoxは、HER2 +腫瘍を標的とすることが示されている in vivoおよび心臓¹を含む、正常組織を温存しながら腫瘍成長アブレーションを引き出す。 HerDoxは、小さな核酸リンカーを介して結合受容体細胞侵入タンパク質、HerPBK10、及び化学療法剤、ドキソルビシン（ドキシサイクリン）の間の非共有結合性相互作用を介して形成されている。 HerPBK10は、ヒト上皮成長因子受容体（HER）と結合し、エンドソーム膜の浸透は、アデノウイルス由来のペントンベースキャプシドタンパク質^4-6の取り込みを介して行われている間、受容体を介したエンドサイトーシス^2-4をトリガします。タンパク質上の正に帯電したドメインは、DNAインターカレードキシサイクリンを標的送達のために輸送することができるような核酸結合^4,5を可能にする。求電子性、インターカレーション、及びおそらくはオリゴマー化タンパク質の相互作用は、血液や異なる温度¹に長期貯蔵で安定である平均10〜20 nmの粒子に自己組織化を促進する。彼女にターゲティング優遇HER2が上昇したとき2 +腫瘍細胞を増強リガンド親和性によって促進される。

我々の以前の研究では、非腫瘍組織上および非標的Doxを^1、およびin vivo ⁷ 中の腫瘍細胞への浸透と比較して、腫瘍におけるHerDox利回り優遇蓄積のその全身送達を示している。我々は核^​​1にDoxの蓄積を可能にし、腫瘍細胞侵入後HerDoxリリースDoxのことを観察した。腫瘍蓄積は比較的低HER2発現腫瘍は比較的高いHER2レベル¹のものに比べてより少ないHerDox蓄積として、受容体レベルと相関することが表示されます。また、効果的な細胞死濃度が異なる細胞表面のHER2のレベル^1を発現する腫瘍細胞株に対するHER2ディスプレイと逆相関を示す。腫瘍殺害解凍に比べて10倍も低い用量で発生するとHerDoxは、非標的ドックス以上の治療と安全優位性を発揮geted薬とは関連性の低いDoxの¹とは対照的に、心臓（心エコー検査および組織学的染色によって検出された）や肝臓（染色TUNELによって検出された）組織には検出可能な悪影響をもたらしません。ウイルスキャプシドタンパク質からの派生にもかかわらず、HerPBK10は治療レベル²での検出可能な免疫原性を示さない。全体アデノウイルスに既存の抗体がHerPBK10を認識することができる一方で、彼らは^、2細胞結合を防止することができない。

経時的に測定した腫瘍体積は、標的治療の治療効果を評価するための標準的な方法であり、HerDoxの治療効果を評価するために採用されている。 生体とex vivoでの蛍光強度イメージングでこのアプローチを補完する、私たちはより良い効率^7をターゲット^に評価することができました。我々は、特にそのHerDoxないことを確認しないようにDoxを蛍光のスペクトル分析で切り出した腫瘍の in situ共焦点イメージングに統合されているtは唯一のin vivoで腫瘍に蓄積されますが、細胞質と核の⁷への腫瘍細胞と配信ドキシサイクリンに浸透。スペクトル解析はさらに自家⁷からDoxの蛍光を区別することができました。

ここでは、全身送達後にin vivoで HerDoxを評価するための、より詳細に我々のアプローチを実証し、そして最も重要なのは、評価するためのマルチモードイメージング法と分析を通してターゲティング。

プロトコル

1。 生体内で全身送達

1. 6-8週齢NU / NUマウスベアリング皮下二国間のフランク異種移植腫瘍に対する注射当たりHerDoxの0.004 mg / kgで投与量の0.2ミリリットルを同一視するように滅菌生理食塩水で十分にHerDox混ぜる。
2. 優しく泡を避けて、29G針を装着し3/10 ccのインスリン注射器にHerDox混合物を描画します。
3. 0.5〜1リットル/分、イソフルラン濃度：3〜4％（又は低い）麻酔ガスを掃気システム（酸素流量を備えた誘導室にイソフルラン短時間の曝露によって誘導される。
4. 麻酔マウス（注射当たり0.2 ml）を尾静脈内に混合物全体を注入。 IV注入はまた、拘束、無麻酔マウスで行うことができる。
5. 1日1回、6以上の連続日間同じマウスに注射を繰り返します。

2。 インビボ蛍光イメージング

腫瘍におけるHerDox蛍光の蓄積ができマルチイメージャを用いた注射の最終日（7日）によって検出される。以下の手順は、カスタマイズされたマクロ照明および検出システム（ 図^1）8の使用を伴う。

1. 生体内光学イメージャでマルチモードをオンにします。
2. ドキソルビシン蛍光検出に適した排出バンドパスフィルタ（590nmの±30 nm）を選択します。
3. アルゴンクリプトンレーザーをオンにして、レーザー光路の励起バンドパスフィルタ（488nmの±10 nm）を配置します。
4. 麻酔システムの電源を入れた後、麻酔（酸素流量にマウスを置き：0.5 L /分、イソフルラン濃度：3〜4％（以下）ガス掃気システムを装備。
5. 麻酔からマウスが麻酔である生体内光学イメージャでマルチモードの撮影室にマウスを移す。
6. マウスの鼻の上のノーズコーンを置き、連続anestheを管理する流れを開く画像取得時にSIA（酸素流量：0.5〜L /分、イソフルラン濃度：2〜3％（以下）。
7. 5-15秒の露光時間を用いて蛍光画像を取得。
8. バックグラウンド補正、コントラスト調整など​​の画像解析処理を行う。

3。蛍光イメージングエクスビボ

HerDox蛍光はHerDoxの最終（第7日）注射後24時間後に安楽死させたマウスから採取した腫瘍と特定の臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、骨格筋を含む）で撮像することができます。

1. 生体内光学イメージャでマルチモードをオンにします。
2. ドキソルビシン蛍光検出用の放射帯域通過フィルタ（580nmの±20 nm）を選択します。
3. アルゴンクリプトンレーザーをオンにして、レーザー光路の励起バンドパスフィルタ（488nmの±10 nm）を配置します。
4. 場所の腫瘍および特定の臓器は、イメージングチャンバーOにペト​​リ皿上に配置されfの生体光学イメージャでマルチ。
5. 5-15秒の露光時間を使用して組織の蛍光画像を取得。初期蛍光画像取得の一例を図2aに示されている。背景（図2b）となる空のペトリ皿を使用して同じように繰り返します。
6. バックグラウンド補正、コントラスト調整など​​の画像解析処理を行う。補正された画像の例を図2aから図2bの減算に起因する、 図2cに示されている。

（4）腫瘍の in situ共焦点イメージング

現場共焦点イメージングで細胞レベルでHerDox腫瘍蓄積の検出と分析を可能にします。

1. ライカSPE共焦点顕微鏡をオンにします。
2. ドキソルビシンためのドキソルビシン及び発光波長（560から620 nm）での励起のために488nmのレーザ光を選択蛍光検出。
3. 対物レンズ上の40Xまたは63X客観アンドドロップイマージョンオイルを選択します。
4. 手順²で説明したように以前にHerDoxとモックの治療を受けた安楽死させたマウスからの新鮮な腫瘍を抽出します。
5. 氷の上でペトリ皿の上に置いて腫瘍は組織の劣化を避けるために、次に共焦点イメージングのためのデルタT室に腫瘍を転送します。
6. シーケンシャル焦点深度（1ミクロン、厚さ：20μmのステップサイズ）で腫瘍の共焦点画像を取得する。 z軸に沿って順次取得された画像の例を図3、左側のパネルに示されている。
7. 最大強度画像のz投影を実行します。 z軸積層画像の最大強度の投影は、図3、右のパネルに示されている。
8. 最大強度Zの蛍光強度を意味計算- 。投影画像をビューの全体のフィールドの上に画像の蛍光強度の平均値を計算したImageJのを使用します。d。

5。レシオメトリックスペクトルイメージングと解析

レシオメトリックスペクトルイメージングと分析Doxを蛍光と自家蛍光の判別を可能にします。

1. 蛍光共焦点レーザ走査型顕微鏡の電源をオンにします。
2. ステップ10nmのサイズ、およびライカSPE共焦点顕微鏡を用いて488 nmの光で励起で、510から650ナノメートルのスペクトル範囲内で指定された深さでHerDox処理と未処理の腫瘍の15の画像を取得する。
3. ドキソルビシン100μMのソリューションを準備します。
4. Doxを蛍光（：510から650 nmであり、ステップサイズ：10 nmのスペクトル範囲）の純粋なスペクトルの署名を取得するために100μMのドキソルビシンソリューションの分光イメージングを実行します。グラフは、図4に示すように、得られた分光イメージング蛍光スペクトルからの画像取得の典型的な結果をプロットした。
5. 画像Cからの自家蛍光スペクトルの署名を取得未処理の腫瘍の分光イメージングによって得られたUBE（10 nmのスペクトル範囲：510から650 nmであり、ステップサイズ）。グラフは、図5に示すように、得られた分光イメージング蛍光スペクトルからの画像取得の典型的な結果をプロットした。
6. 我々は^9を開発したプログラムを使用して、4つの基準スペクトルシグネチャを（純粋自家蛍光、0.1.doxorubin +0.9。自家、0.2。ドキソルビシン+0.8。自家、0.3.doxorubin +0.7。自家蛍光）を生成します。 4つの基準スペクトル特性を示す典型的な曲線を図6に示す。
7. 我々は以前に^9を開発したプログラムを使用したユークリッド距離尺度を通して基準スペクトルシグネチャで定義されている画像のスペクトル分類を実行します。
8. レシオメトリックスペクトルイメージングと解析との比較のために、我々は^7を開発したスペクトルアンミキシングプログラム（ImageJの中でプラグイン^）、10を使用して、それらの画像の線形スペクトルアンミキシングを行います。電子線形スペクトルアンミキシングすることにより自家蛍光からHerDox蛍光を分離するXAMPLEは、 図7に示されている。

結果

図1は、蛍光強度、スペクトル、寿命、2光子内、重要な焦点、および生物発光イメージングを含む複数のモダリティ、下の画像の取得を目的として建設された生体内光学イメージャプロトタイプに示しています。さらに、このシステムに組み込まれた冷却された高感度カメラと高出力レーザー線は、特にドキソルビシン蛍光のインビボでの検出のための商業?...

ディスカッション

腫瘍は皮下あるときDoxの蛍光はマルチイメージャを用いたin vivoで検出することができます。しかし、HerDoxの治療有効用量（0.004 mg / kg体重）を単回投与した後、検出しきい値を下回っている。対照的に、7毎日注射（7日間1x/day）の後、粒子の蓄積および腫瘍保持はDoxの蛍光の可視化を可能にするのに十分である。

ドキシサイクリンまたはクリーン技術が使用されて?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B