Анализ целевой вирусного белка Наночастицы доставляется в HER2 + опухолей

Резюме

В данной статье подробно процедуры для оптического анализа изображений с опухолью целевой наночастицы, HerDox. В частности, подробную информацию об использовании многомодового изображения устройства для обнаружения нацеливания на опухоль и оценки опухоли проникновение описан здесь.

Аннотация

HER2 + опухолей целевых наночастиц, HerDox, экспонаты опухоли преимущественному накоплению и росту опухоли абляции в животной модели HER2 + рак. HerDox формируется нековалентными самосборки белка-мишени опухоли клетки с проникновением к препаратам, доксорубицин, через небольшой нуклеиновых линкер. Сочетание электрофильного, интеркаляции и олигомеризации облегчения взаимодействия самосборке в круглых частиц 10-20 нм. HerDox демонстрирует стабильность в крови, а также при длительном хранении при различных температурах. Системной доставки HerDox в опухоли мышей приводит к опухоли гибель клеток без заметного негативного воздействия на неопухолевых тканей, в том числе сердца и печени (которые подвергаются заметным повреждения нецелевой доксорубицин). HER2 высоте облегчает нацеливание на клетки, экспрессирующие человеческий рецептор эпидермального фактора роста, следовательно опухолей отображения повышенные уровни HER2 демонстрируют большему накоплению HerDox по сравнению с клетками экспрессиюпеть более низких уровнях, как в пробирке и в естественных условиях. Интенсивность флуоресценции в сочетании с конфокальной на месте и спектрального анализа позволило нам проверить в условиях Опухоль адресности и проникновения в опухоль клетки HerDox после системной доставки. Здесь мы подробно наши методы оценки нацеливания на опухоль с помощью многомодового изображений после системной доставки.

Введение

Опухоль-таргетинга химиотерапии имеет потенциал, чтобы устранить раковые клетки при снижении дозы препарата по сравнению с нецелевым наркотики, потому что больше поставляемого терапия может накапливаться на ее назначению, а не распространять без опухолевой ткани. В последнем случае ослабит из эффективности препарата и, следовательно, требуют более высоких доз чтобы быть эффективным, опухоли-таргетинга имеет как терапевтические и безопасность преимущества по сравнению со стандартными нецелевой лечения.

Таргетинг химиотерапии инкапсуляции в самоорганизующихся наночастиц позволяет наркотиков остается химически не модифицированной в отличие от лекарств, которые ковалентно связаны с ориентацией молекул. В такой связи имеет потенциал, чтобы изменить действие как лекарственное средство, и целевой молекулы; нековалентному сборки позволяет активности лекарственных средств должны быть сохранены.

Ранее нами было показано, что новый трехкомпонентный, самоорганизующиеся комплекс, HerDox, цели HER2 + опухолей В естественных условиях и вызывает рост опухоли абляции при щадящем нормальной ткани, в том числе сердца ^1. HerDox формируется посредством нековалентных взаимодействий между связывания рецептора клеточной проникновение белка, HerPBK10 и химиотерапевтического агента, доксорубицин (доксорубицин), через небольшой нуклеиновых линкер. HerPBK10 связывает человеческий рецептор эпидермального фактора роста (HER) и запускает рецептор-опосредованного эндоцитоза ^2-4, в то время как эндосомного проникновения мембраны осуществляют посредством включения аденовируса полученные Пентон база капсидного белка ^4-6. Положительно заряженных домен белка обеспечивает нуклеиновую кислоту, ^{4 связывания, 5,} через которые ДНК интеркалированного доксорубицин можно транспортировать для целевой доставки. Электрофильного, интеркаляции и, возможно, белковых взаимодействий олигомеризации способствовать самосборке в круглых частиц 10-20 нм, которые являются стабильными в крови и при длительном хранении при различных температурах ^1. Льготные ориентации на HER2 + опухолевых клеток способствует повышенным сродством лиганда при HER2 повышается.

Наши предыдущие исследования показали, что системная доставка HerDox выходы преимущественному накоплению в опухоли по сравнению с не-опухолевой ткани и по сравнению с нецелевой Dox ^1, и проникновение в опухолевые клетки в естественных условиях ^7. Мы заметили, что HerDox релизы Dox после вступления клетки опухоли, что позволяет Dox накопления в ядро ^1. Опухоль-видимому, накопление коррелирует с рецептором уровне, а относительно низкие HER2 опухолей, экспрессирующих HerDox накапливают меньше по сравнению с теми сравнительно высоким уровнем HER2 ^1. Кроме того, эффективная концентрация гибели клеток показывает обратную корреляцию с HER2 дисплей на опухолевые клеточные линии, экспрессирующие различные поверхности клетки HER2 уровня ^1. HerDox обладает терапевтическими и безопасность преимущество перед нецелевой Dox, как опухолевые убийство происходит в более чем в 10 раз более низкой дозе по сравнению с распакуйтеgeted препарата и не дает обнаружить отрицательное воздействие на сердце (обнаружен с помощью эхокардиографии и гистологические пятна) или печени (обнаружен TUNEL пятно) ткани, в отличие от нецелевой доксорубицин ^1. Несмотря на свое происхождение от вирусных белков капсида, HerPBK10 не проявляет иммуногенность обнаруживаемых на терапевтических уровнях ^2. В то время как уже существующие антитела к целому аденовирус может распознать HerPBK10, они не в состоянии предотвратить связывание клеток ^2.

Объем опухоли измеренная в течение долгого времени является стандартным методом оценки терапевтической эффективности целевой терапии, и была использована для оценки терапевтической эффективности HerDox. Дополнение этот подход с в естественных условиях и бывших естественных условиях интенсивность флуоресценции изображение позволило нам лучше оценить эффективность адресности ^7. Мы специально интегрирован на месте конфокальной микроскопии вырезали опухоль со спектральным анализом ДОХ флуоресценции, чтобы убедиться, что нет HerDoxT только накопленная при опухолях в естественных условиях, но проникли в опухолевые клетки и доставлен Dox в цитоплазме и ядре ^7. Спектральный анализ того позволило нам отличить Dox флуоресценции аутофлюоресценция ^7.

Здесь мы показываем, более подробно наш подход к оценке HerDox в естественных условиях после системной доставки, и, самое главное, для оценки ориентации через многомодовых методов визуализации и анализа.

протокол

1. Системной доставки В естественных условиях

1. Смешать достаточно HerDox стерильным физиологическим раствором приравнять 0,2 мл 0,004 мг / кг доза HerDox на инъекцию для возрасте 6-8 недель пи / пи мышь подшипника подкожной двусторонней опухоли ксенотрансплантата бок.
2. Осторожно обратить HerDox смесь в 3/10 мл инсулина шприца, снабженного иглой 29G, избегая пузырьков.
3. Анестезия индуцированный краткое изофлурана воздействия в индукционной камере, оборудованной газовой системы очистки (Oxygen Расход: 0,5-1 л / мин, изофлурана концентрация: 3-4% (или ниже).
4. Введите всю смесь в хвостовую вену мышей анестезировали (0,2 мл на инъекцию). IV инъекций также может быть выполнена в сдержанном, наркозу мыши.
5. Инъекции повторяют на той же мыши на шесть последовательных дней один раз в день.

2. Флуоресценции В естественных условиях

Накопление HerDox флуоресценции в опухоли могутих заметит последний день инъекций (День 7) с помощью многомодового томографа. Описанные ниже процедуры повлечь за собой использование индивидуальных макро-подсветкой и системой обнаружения (рис. 1) ^8.

1. Включите многомодового оптического В естественных изображений.
2. Выберите выбросов полосовой фильтр (590 нм ± 30 нм) подходит для определения доксорубицина флуоресценции.
3. Включите Криптон Аргон-лазерная и поместите полосовой фильтр возбуждения (488 нм ± 10 нм) на лазерный оптический путь.
4. Включите анестезии системы, а затем поместите мышь в обезболивающих камеры (Oxygen Расход: 0,5-1 л / мин, изофлурана концентрация: 3-4% (или ниже) газовой системы очистки.
5. Передача мышь от обезболивающих камеры изображения камеры многомодового оптического В естественных условиях Imager, когда мышь находится под наркозом.
6. Наведите головная за нос мыши и открыть поток для управления непрерывными анестезииSIA во время получения изображения (Oxygen Расход: 0,5-1 л / мин, изофлурана концентрация: 2-3% (или ниже).
7. Приобретать изображения с помощью флуоресценции время экспозиции 5-15 сек.
8. Выполнить анализ и обработки изображений, включая коррекцию фона или настройки контрастности.

3. Флуоресценции Экс естественных

HerDox флуоресценции могут быть отображены в опухолях и конкретных органов (в том числе печень, почки, селезенку, сердце, скелетные мышцы) собирают из мышей умерщвляли через 24 часа после последнего (день 7) введение HerDox.

1. Включите многомодового оптического В естественных изображений.
2. Выберите выбросов полосовой фильтр (580 нм ± 20 нм) для доксорубицина флуоресценции.
3. Включите Криптон Аргон-лазерная и поместите полосовой фильтр возбуждения (488 нм ± 10 нм) на лазерный оптический путь.
4. Место опухолей и конкретных органов, расположенных на чашки Петри в изображения камеры OF многомодового оптического В естественных изображений.
5. Приобретать флуоресцентные изображения тканей с использованием Выдержка 5-15 сек. Пример начальной флуоресценции захвата изображений показано на фиг.2а. Повторите то же самое, используя пустой чашки Петри, который будет служить в качестве фона (рис. 2б).
6. Выполнить анализ и обработки изображений, включая коррекцию фона или настройки контрастности. Пример исправленное изображение показано на рисунке 2, в результате вычитания 2б из фиг.2а.

4. На месте конфокальной микроскопии опухоли

На месте конфокальной микроскопии позволяет обнаружения и анализа накопления в опухоли HerDox на клеточном уровне.

1. Включите микроскоп Leica конфокальной SPE.
2. Выберите 488 нм лазерный свет для возбуждения доксорубицина и длины волн излучения (560-620 нм) для доксорубицинафлуоресценции.
3. Выберите 40X или 63X объективных и падение нефти погружения на линзу объектива.
4. Извлечение свежей опухолей мышей умерщвляли, которые ранее получили HerDox и макет процедуры, как описано в процедуре ^2.
5. Место опухоли на чашки Петри на льду, чтобы избежать деградации тканей, а затем передать опухоли в камеру Delta T для конфокальной микроскопии.
6. Приобретать конфокальной изображения опухоли на последовательном Фокусное глубинах (шаг: 1 мкм, толщина: 20 мкм). Примером последовательного приобретенные изображения вдоль оси показано на рисунке 3, левой панели.
7. Выполнение максимальной интенсивностью г-проекции изображений. Проекция максимальной интенсивности Z-стеки изображений показано на рисунке 3, правая панель.
8. Рассчитать означает интенсивности флуоресценции от максимальной интенсивности Z -. Проекцию изображения Среднее интенсивности флуоресценции изображения через общий поле зрения были вычислитьD Использование ImageJ.

5. Логометрический спектральных изображений и анализа

Логометрический спектральных изображений и анализа позволяет дискриминации между Dox флуоресценции и флуоресценции.

1. Включение лазерной сканирующей флуоресцентной конфокальной микроскопии.
2. Получить 15 изображений HerDox-обработанных и необработанных опухолей на заданной глубине в спектральном диапазоне 510-650 нм с шагом 10 нм, возбуждение при 488 нм светом с помощью SPE Leica конфокальной микроскопии.
3. Подготовьте 100 мкМ раствора доксорубицина.
4. Выполнение спектральных изображений 100 мкМ раствор доксорубицина, чтобы получить чистый спектральными характеристиками Dox флуоресценции (спектральный диапазон 510-650 нм, размер шага: 10 нм). Типичные результаты получения изображения из спектральных изображений и в результате спектр флуоресценции построена в виде графика представлены на рисунке 4.
5. Приобретать аутофлюоресценция спектральные подписи из образа CВБО (спектральный диапазон: 510-650 нм, размер шага: 10 нм), полученных спектральных изображений необработанных опухолей. Типичные результаты получения изображения из спектральных изображений и в результате спектр флуоресценции построена в виде графика представлены на рисунке 5.
6. Генерирования четырех ссылкой спектральные характеристики (чистый аутофлюоресценция, 0.1.doxorubin 0,9. Аутофлюоресценция, 0,2. Доксорубицин 0,8. Аутофлюоресценция, 0.3.doxorubin 0,7. Аутофлюоресценция) с помощью программы мы разработали ^9. Типичная кривая четыре ссылкой спектральные характеристики показан на рисунке 6.
7. Выполнение спектральной классификации изображений, как это определено опорной спектральной сигнатуры через евклидова мера расстояния с использованием программы мы ранее разработанных ^9.
8. Выполните линейная спектральная расслоении эти изображения с помощью спектрального программы расслоении (плагин в ImageJ) мы разработали ^{7, 10,} для сравнения с логометрических спектральных изображений и анализа. Электроннойнапр разделения HerDox флуоресценции аутофлюоресценция линейной спектральной несмешивания показано на рисунке 7.

Результаты

На рисунке 1 показана в естественных прототипов оптических изображений, который был построен с целью получения изображения под несколькими условиями, в том числе интенсивность флуоресценции, спектральных, жизни, 2-фотона, внутри-жизненно конфокальной и биолюминесценции ...

Обсуждение

Dox флуоресценция может быть обнаружена в естественных условиях использования многомодового Imager, когда подкожные опухоли. Тем не менее, терапевтически эффективной дозы HerDox (0,004 мг / кг) ниже порога обнаружения после однократной дозы. В противоположность этому, после 7 ежедневных инъ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B