構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

要約

脂質膜にプロトタイプ電位依存性カリウムチャネルの完全な再構成のための手順が説明されています。再構成されたチャネルは、生化学的アッセイ、電気録音、リガンドのスクリーニングおよび電子結晶学的研究に適している。これらの方法は、他の膜タンパク質の構造的および機能的研究の一般的なアプリケーションを有することができる。

要約

還元主義様式で脂質 - タンパク質相互作用を研究するために、明確に定義された脂質組成物の膜に膜タンパク質を組み込むことが必要である。我々はプロトタイプ電位依存性カリウム（Kv値）チャネル内の脂質依存ゲーティングの効果を研究しているし、別の膜システムにチャネルが再構成する詳細な手順をしてきました。当社の再構成の手順は、洗剤によって誘発される小胞の融合及び脂質/洗剤混合ミセルと同様、タンパク質/洗剤/脂質と洗剤間脂質の平衡分布に達することの重要性を持つタンパク質/洗剤ミセルの融合両方の配慮を/脂質混合ミセル。我々のデータは、脂質小胞のチャネルの挿入方向で相対的にランダムであり、かつ再構成効率が検出可能なタンパク質凝集体を分別実験で見られなかったように高いことを示唆した。我々は再構成を利用してきた異なる脂質のチャネルのコンフォメーション状態を決定するために、dはチャネルは、平面脂質二重層に組み込まれたチャンネルの数が少ない、ファージディスプレイペプチドライブラリーからのコンフォメーション特異的リガンドをスクリーニングの電気的活動を記録し、二次元結晶の成長を支える膜のチャンネル。ここで説明した再構成手順は、特に真核生物の電位依存性イオンチャンネル上の脂質効果の調査のために、脂質二重層内の他の膜タンパク質を研究するために適合され得る。

概要

セル交換物質と特異的膜蛋白質¹の機能を通じて環境との情報。細胞膜中の膜タンパク質は、ポンプチャネル、受容体、膜内酵素、リンカーおよび膜を横切って構造的支持として機能する。膜タンパク質に影響を与える突然変異は、多くのヒトの疾患に関連していた。それらは重要で細胞膜で容易にアクセス可能であるため、実際には、多くの膜タンパク質は、一次薬物標的であった。これは、膜に種々の膜タンパク質の構造と機能を理解することが非常に重要であり、それが可能にヒトの疾患において突然変異体タンパク質からの有害な影響を軽減する新規な方法を考案するにしている。

脂質二重層は^、2、3に統合されたすべての膜タンパク質を取り囲む。真核生物の膜において、脂質の様々な異なるタイプのミクロドメイン^4,5に編成されることが知られている。多くの膜タンパク質は、これらのマイクロドメインならびに膜^3,6の嵩高流体相の間で分配されることが示された。マイクロドメインとそれらへの膜タンパク質の配信とそのような分布の生理的意義の組織化のメカニズムは明らかに重要ですが、よくわかっていないままです。膜タンパク質に脂質の影響を研究の1つの主要な技術的な難しさは、生化学的にほぼすべての再構成されたタンパク質は⁷官能であるように十分に制御された脂質組成物の膜に膜タンパク質を精製した信頼性の高い再構成である。過去数年間で、我々はAから再構成プロトタイプ電位依存性カリウムチャネルに方法を開発の構造的および機能的研究^8-10のための様々な膜システムにペルニクス （KvAP）。他人からのデータと私たちは一緒に脂質がおそらく電圧センシングのコンホメーション変化における決定要因であることを示した電位依存性イオンチャンネルの領域と、これらのチャネル¹¹の一部の構造を形作ることができる。次では、我々の方法の詳細な説明を提供します、おそらく我々の結果の成功の再現だけでなく、他の膜タンパク質の研究と我々の方法の延長を確保する重要な技術的なヒントを提供します。

プロトコル

1。発現とKvAPチャンネルの精製（図1）

1. 準備作業 - 0日目
   1. 一般食器から洗剤の痕跡を除去するために脱イオン水（DIH ₂ O）とミリQ H ₂ O（MQH ₂ O）で細菌培養用のガラスフラスコを洗浄します。
   2. 2.8 L三角フラスコ（ここでは例として、合計2リットルの文化）でオートクレーブ千ミリリットルのLB培地。水の硬度が低い形質転換された細菌の培養に成功にとって重要であることが見出された。
   3. 500mLのフラスコ中でオートクレーブを100mlのLB培地
   4. 100μgの/を含む2つのLB-寒天プレート上トロンビン切断部位とそのC末端、プレートでの彼の₆タグ付きKvAPの遺伝子細菌を含むプラスミドpQE60 200ngのとXL1-ブルーテントセル60μlのを変換するアンピシリン、37℃のインキュベーター内で14-16時間のためにそれらをインキュベートする。
2. KvAPの発現 - 1日目
   1. アプリをチェック一晩のインキュベーションの後、プレート上の細菌のコロニーのearance。コロニーは、通常、直径がわずか約0.2〜0.5ミリメートルであり、それらの多くがあった。我々は衛星コロニーの多くに囲まれた大きなコロニーを抱いプレートを望んでいない。
   2. 一晩インキュベート各LB-寒天プレート、5.0 mlのLB培地を追加し、コロニーをオフにスクラップ。 500mlのフラスコにオートクレーブを100mlのLB培地に細菌懸濁液を移す。は100μg/ mlの最終濃度にアンピシリンを加え、37℃で約1時間の小さな文化をインキュベートまたはOD600まで0.60に達する。
   3. その間、代わりに37に1.0 L培地を持つ2つのフラスコ℃のインキュベーターがメディアをウォームアップし、塩化バリウム_2（1.0 M;各1.0 L培養で10mMの最終濃度）を20mlのを準備するために振って、2.0ミリリットル0.4 M IPTG（イソプロピルチオ-β-ガラクトシド）、水で100 mg / mlのアンピシリンストックの2.0ミリリットル。
   4. 小さ ​​な文化の準備ができたら、、ampici 1.0mlの塩化バリウムを₂ 10mlのを追加ステップ1.2.2から予め温めLBメディアに小さな文化のLLINストック、50ミリリットル。 OD600が0.05程度になるはずです。水の硬度が高く、LB培地中でカウンターイオンによる可能降水量を監視します。のBa ^{2 +は、}カリウムチャネルを遮断イオン電流の細孔ドメインに結合することが知られているので、細菌へのチャネルの高レベル発現の毒性を減少する。
   5. それは0.9から0.8に達するまで、それが0.70に達するまでOD600毎時間を取り、15分ごと。当社では、セットアップは、通常、0.8に達するために約5時間かかります。
   6. チャネルタンパク質の発現誘導を開始し、225 rpmで振とうしながら37℃で4.0時間、別のカルチャをインキュベートするIPTG 0.40 mMのを追加します。
   7. 収穫の15分間4000×gで、4.0°Cで回転によって1.0リットル遠心ボトルの細菌。 、廃棄物のビーカーにできるだけ上清を除去すべてのBa ^{2 +を}沈殿した後、追加するために10ミリリットルの1.0MのNa-リン酸緩衝液を追加細菌を殺すために漂白剤の少量。一晩4.0°C寒い部屋で氷に埋もれ遠心分離機ボトルで収穫された細菌を保つ。
3. KvAPタンパク質の精製（2日目および3、 図1B）
   1. 1.0 Lの文化ごとIMAC溶解バッファー15mlに細菌ペレットを再懸濁します。 1.0μgの/ mlで〜1.0 UのDNase I、及びロイペプチンの3プロテアーゼ阻害剤、アプロチニンおよびペプスタチン追加。 2リットルの培養のための総容積は約35ミリリットルであった。
   2. オン時間の合計10分間氷上に埋もれ金属ビーカーに再懸濁した細菌を超音波処理。マイクロプローブ音波処理器は、4.0℃の寒い部屋の中で40％の出力パワーとサイクル/ OFF 10秒ON 5秒に設定されていました。バクテリアの大部分が溶液中で非常に加熱せずに溶解されたように、出力電力設定値は経験的に決定した。
   3. 超音波処理した細胞溶解物を乾燥粉末にし、3のために混合物をインキュベート、n-デシル-β-D-マルトシド（AnatraceからソルグレードDM）の0.50グラムを追加一定の水平振盪（〜100rpmで）できるだけ多くのチャネルタンパク質を抽出するために、室温（RT）で.5時間である。洗剤粉末が完全に30〜50分間かけて溶解することを確認することが重要である。
   4. 界面活性剤抽出した後、室温で30分間、20,000×gでの遠心分離により溶解物から細胞残屑を除去する。遠心分離はボックス1で説明するようにHisタグベースのLC（低圧液体クロマトグラフィー）カラムを準備し、終了するのを待っている間。
   5. 1-2蠕動ポンプによって駆動され、ml /分の流速でプレパックIMAC（iはmのエタル島イオンffinity C hromatographyをmmobilized）カラムにステップ1.3.4から上清をロードします。また抽出したHisタグタンパク質は、バッチ式の結合のためのIMAC樹脂でインキュベートすることができる。
   6. IMAC洗浄バッファーの5ベッドボリューム、およびIMAC洗浄バフの10ベッドボリュームを実行することにより、IMAC樹脂を洗浄しえープラス20 mMイミダゾール。インラインUVモニターは洗浄がクリーンであることを確認するために使用されます。
   7. 300mMのイミダゾールを含むIMAC溶出緩衝液を適用することによってKvAPタンパク質を溶出する。結合したKvAPのほとんどは、カラムを通して溶出緩衝液6mlの内に溶出する。プールされた溶出画分にトロンビン（タンパク質の2-3 1mgあたり1.0 U）を追加し、切断するためにベンチに一晩彼の₆タグをタンパク質をインキュベートする。
   8. 翌日、サイズ排除FPLC（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）用に600μlにセントリコン（MWCO = 30K）でトロンビン消化タンパク質溶液を下に集中させる。遠心分離中、タンパク質の凝集を最小にするために、サンプルを5分ごとに混合する。タンパク質が濃縮されているように、メンブレンフィルターの局所濃度が高くなり、時にはクリアホワイトさもなければフィルタ膜を詰まらせる可能性のある沈殿物がある。また、コンセントレータの下部にあるタンパク質の高濃度（〜5-10 mg / mlの）が額につながるニッシュの色混合は、実際にサンプルのロスを最小限に抑えることができます。
   9. FPLC平衡緩衝液で予め平衡であるスーパーデックス200カラムを通して集中KvAPを実行します。一般的に12.3ミリリットルの保持容量とDM溶出における四量KvAPチャネルのピーク。単量KvAPの少量を持って周りに13.6ミリリットル、の小さな末尾の尾があります。我々が使用されるカラムの空隙は、7.0ミリリットルであり、通常はサンプルが非常に少ないKvAPタンパク質が含まれているボイドに小さなピークを生じさせる。イミダゾール溶出（〜24ミリリットル）の端に来る。一緒KvAPテトラマーを含む、プールフラクションを0.5 mlにタンパク質溶液を下に集中する。 280nmの[参照¹²時KvAPの推定吸光係数（芳香族残基の数に基づいて算出した〜1.2E-5.0 M ^-1 cm ^-1の^を 、）を使用して、サンプルの濃度を決定し、URL： http://のweb.expasy.org / protparam /]。
      室温では、DMで精製KvAPは、タンパク質の実質的な損失なしで少なくとも1週間安定です。 4℃で、それも長く続くことができます。洗剤中のタンパク質を凍結することはありません。それは、4℃で、室温でβ-OGでタンパク質をDMでタンパク質を保管することをお勧めします。しかし、我々は正常に待ち、タンパク質は準備ができていた直後に再構成ステップに進まないでください。
   10. アッセイSDS-PAGEゲルの削減12％のサンプル。
       上述した各ステップからの試料を、1.0％β-MEを補充した5×SDSサンプルバッファー（バッファー表3）を用いて標本の20マイクロリットルを混合することによって調製した。サンプルは茹でませんでした。ゲルは準備ができていた後、試料は、通常、室温で10分以上のためにSDS-緩衝液中にあった。ゲルを実行し、クマシーブルーで染色した後、野生型KvAPは約26 kDaの（ 図1Bの単一バンドとして現れた）。精製されたサンプルは、生化学的に均質と少なくとも95％の純度であった。

2。イオンチャネルの再構成

2.1。小胞のリポソーム製剤と洗剤誘発融合

脂質の準備の前に、14ミリリットルの使い捨てガラス試験管、スクリューキャップのガラス管、およびクロロホルム250μlのガラスシリンジを洗う。 testtubeに〜10ミリリットルのクロロホルムを注ぐ。

1. パルミトイル-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（POPE）とパルミトイル-オレオイル-ホスファチジル-グリセロール（POPG）リポソームの調製。
   1. POPEの3.75ミリグラムとPOPG 1.25mgの（POPE：POPG = 3:1重量比）転送プレ洗浄スクリューキャップのガラスチューブにクロロホルム中に、アルゴンガスの連続ストリームで脂質を乾燥させます。目に見えるクロロホルムが残されていない場合、1時間室温真空下でさらに乾燥させて脂質。
   2. 低塩緩衝液（10mMのHEPES、pHが7.4の440μlを）または水乾燥した脂質と渦和物脂質にチューブに。脂質懸濁液は白っぽく濁ったと見える。
   3. 胞液が半透明になるまで（OD410 <0.2）を氷冷浴超音波処理における脂質懸濁物を超音波処理。
      典型的には、水または低塩緩衝液中で10 mg / mlのPOPE / POPG解決のために、我々は15〜20分の合計30秒ON、30秒OFF（氷の上）で超音波破砕機を運営。なぜなら超音波処理中に発生する熱のではなく、脂質酸化を最小限にし、10℃以下にソニケーターの恒温槽を冷却するために、脂質溶液に1.0mMのDTTのを追加することが望ましい。最後のOD410は、脂質に依存します。特定の脂質のためには、このような低ODを達成することは非常に困難である。その場合、我々は、通常、完全に脂質を可溶化および長期インキュベーションタンパク質含有ミセル（次を参照）の周りに脂質の良好な分布に到達できるようにするために洗剤を使用しています。
      大容量のお風呂超音波処理は、ORDは重要であるえーOD410 <0.2に到達する。私たちは、研究室用品株式会社株式会社（モデル＃G112SPIG、ヒックスヴィル、NY）によって行われたシステムを使用している。小胞の適切な超音波処理のための鍵は、チューブの途中で共振センターは強い振動を持っていることを確認することです。振動は、水の量に応じて変化するので、調整することができる。またそれは、経験的にグリセロールを少量添加することにより、水の粘度が増加した超音波処理の効力を高めることができることがわかった。
      代替的に、我々は、プラスチックや金属管における脂質懸濁液と接触したマイクロプローブ音波処理器を使用して同じ結果を得ることができることを見出した。マイクロプローブをクリーニングする必要があり、先端のみが脂質溶液中に浸すある。脂質粒子は、マイクロプローブの表面に小さな断片に分割されるので、試料を冷却しておくことは非常に重要であり、不飽和脂質の酸化を防止するために周りにいくつかの還元剤を有する。
      低温電子MICR下oscopy、超音波処理した単層小胞の大部分は直径が30〜50ナノメートル（データは示さず）である。小さなSUV車の曲率が小さい摂動は直径80-200 nmの（次を参照）である大規模なものにこれらの小胞の活気のある融合を誘発するのに十分であることが非常に高いです。
   4. 3.0 M KClを50μlのと最終脂質サスペンションは300ミリのKClとDM 10mMのを持っているように、混合物へのDM 0.50 M10μlのを追加します。脂質/洗剤混合ミセルを形成するために、室温で2時間、水平回転でソリューションをインキュベートする。インキュベーション後、懸濁液は小さな単層小胞の洗浄剤誘発性融合によるものです少し濁った（ 図2A）、になるはず。
   5. タンパク質はに脂質/洗剤の混合物に0.50 mgのKvAPタンパク質、3.0 MのKCl、水中で0.50 M DM株式の16μL、および10mM HEPESを50μl、pHが7.4を追加、以上の2.0 mg / mlのに濃縮されている場合最終容量を1ml作る。最終脂質：蛋白質の重量比は10:1そしてDMの最終濃度は18mMの（ 図2A）である。別の2時間のために水平回転とガラス管中のタンパク質/脂質/洗剤混合物をインキュベートする。
      界面活性剤濃度の選択は、洗剤誘起小胞融合及び小胞の可溶化¹³によって案内される。小胞は、強力な超音波処理によって形成される場合には、その平均直径は、EMの下で30〜50ナノメートルの範囲である。これらの小胞は410 nmで、非常に低い散乱を持っている。低濃度で、界面活性剤は、第一小胞に挿入され、小胞を不安定にし、洗剤飽和小胞の融合を誘導する（OD410が上がる、 図2Aを参照）。小胞の融合はOD410 nmでの増加につながる。 10 mg / mlのPOPE / POPG胞のために、DM約15 mmとOD410ピーク。以上の清浄剤が導入されると、小胞は洗剤/脂質混合ミセルに分割片や脂質になるに侵入し始める。この後者のプロセスが伴っているダウンの最終的な低レベル（<0.1）にOD410の減少となりました。
      なぜなら小さな小胞の洗浄剤誘発性融合による光学密度の立ち上がり段階に積極的に融合イベントを、それがタンパク質/洗剤ミセルが活発に洗剤飽和脂質小胞と融合される可能性が高い。それは、タンパク質/脂質/洗剤混合物を調製する時のDM 18 mMのの選択の背後にある理由です。界面活性剤は、4倍以上にすることにより濃縮しなくなった場合、DMニーズの量は、最終濃度が18〜20 mMの周りに残っているように調整することができる。タンパク質収率が非常に低い場合、それは濃厚洗剤がサンプルにあるどの程度評価することは困難であり、我々はその代わりに完全に可溶化された脂質とタンパク質を混ぜ、および再構成の完全平衡混合物を使用します。我々の手ではなく、十分な時間は、タンパク質含有および無タンパク質ミセル間脂質の良好な平衡分布に到達させた場合、reconstitutイオン効率が大幅に下落した。我々は通常、2つの実験によって再構成効率をテスト：1）ショ糖密度勾配超遠心分離で胞分画とのタンパク質の同時移行を検討する、2）に分別して再構成された小胞のタンパク質を抽出し、ゲル（我々の場合KvAP）四量体であることが残っているどのくらいのタンパク質見つけるため濾過カラム。タンパク質/脂質/界面活性剤のインキュベーションの最小時間は、室温または4℃で一晩で数時間です。
      別の洗剤に安定である新規膜タンパク質については、最初のステップは、 図2Aに示したもののと同様に、そのような洗剤による脂質の可溶化特性を調べることである。次に、それは、例えば大腸菌などのPCを抽出、で開始することをお勧めしますコリ極性抽出PC、大豆PCエキスなどが、その特定のタンパク質がその機能のために特定のリン脂質を必要とする場合、それは既に抽に含まれてもよいことテッドの脂質混合物。
2. 界面活性剤可溶化との混合物中でKvAPの調製1,2 -ジオレオイル-3 -トリメチルアンモニウム-プロパン（DOTAP）または1,2 -ジオレオイル-sn-グリセロ-3 -サクシネート（DOGS）---完全な脂質可溶化の例再構成のため
   1. 脂質製剤は、POPE / POPG胞の場合と同じです。小さな単層小胞に水和した脂質の超音波処理は、POPE / POPG脂質（通常5-10分）よりも長い時間（通常は45-60分）が必要です。 DOGS小胞は徐々に互いに融合し、小さな油性液滴を形成することができる。
      なぜなら再現DOTAPと犬質の高いSUVのを作ることが困難である、我々は通常のタンパク質と混合する前に、完全にこれら二つの脂質を可溶化する。
   2. 完全にDOTAPまたはDOGSを可溶化するために、超音波処理した小胞はDMの10mMと40mMのn-オクチル-β-D-グルコシド（β-OG）と混合する。脂質/洗剤混合物（> 15時間）一晩インキュベートする室温で、混合物は、任意の小さな粒子または液滴を持つべきではない。しかし、その代わりに、それはかなり明確である。このステップで完全に平衡に達するのに失敗すると、マルチラメラベシクルのかなりの割合の形成につながる。
   3. 以下1:10〜等しい脂質比：タンパク質に界面活性剤可溶化DOTAPまたはDOGSとKvAPタンパク質を混ぜる。タンパク質/洗剤/脂質混合物を転倒回転に伴って2〜3時間室温でインキュベートする。

2.2。フォームプロテオリポソー​​ムに洗剤の除去

1. 透析---比較的高い臨界ミセル濃度（CMC≥1.0 mM）を持っているようなDMとβ-OGとして洗剤の遅い除去、
   各1.0 mlの混合物のために2リットルの透析液（ 表3）を準備。
   透析チューブの適当な長さ（= 10K MWCO; 0.70センチメートル広い）を切り出し、DI水で洗ってください。チェックして作ることが重要です配管内に漏れがないことを確認してください。敏感なサンプルについては、チューブは、第一の10mMのトリス-HCl pH8.0のおよび2.0 mMのEDTAの緩衝液で処理することができ、その後3-5分間熱湯で洗浄される。チューブは、1つの端部でクランプと透析緩衝液で洗浄する。
   透析チューブにタンパク質 - 脂質 - 界面活性剤混合物をロードします。ソリューション左上最小限のスペースとチューブの両端を固定します。透析バッファにロードされたチューブを入れ、チューブが液中に徐々に回転するように攪拌プレートを使用しています。毎8時間一回の透析バッファーを変更します。タンパク質 - 脂質 - 界面活性剤混合物が完全にはっきりしていた場合は、最初のバッファを変更した後、溶液が白濁する必要があります。透析が速すぎると、白色固体を透析チューブの底に沈殿物があってもよい。なお、緩衝変更時に、チューブが擦られ、複数回反転されるべきであることが推奨される。透析緩衝液の5変化した後、小胞は通常、準備ができている。
   私たちは、脂質二重層上に小胞を撮影して洗剤の残量を確認してください。左洗剤のまだかなりの量がある場合には、二重層はほぼ瞬時に壊れなります。これは、比色法を使用するか、または小胞の懸濁液の表面張力を測定することにより残留洗剤を測定することも可能である。
2. 低いCMCを持つ洗剤を除去するためのポリスチレンビーズを使用する
   多くの場合、私たちはそのようなDDM（水中CMC〜0.17ミリモル）のような低CMC洗剤を、使用する必要があります。小さ ​​な疎水性細孔を有するビーズは、これらの界面活性剤^14を除去するために使用される。
   1. ビーズの調製。重量乾燥ビーズ0.5gのアウトと閉じ込められた気泡を除去するために5分間入浴ソニケーター溶液を超音波処理し、20ミリリットルのメタノールを加え、50ミリリットルコーニングチューブに入れ、5分間5,000 rpmでビーズをスピンダウンしてから、デカント最もメタノール。エタノールとミリQ水で洗浄を繰り返します。洗浄したビーズを、4℃で20％エタノールに格納されていると使用前に界面活性剤を含まないバッファに変更する必要がある。
   2. 処理されるべきタンパク質/脂質/洗剤混合物中の界面活性剤の量を推定し、界面活性剤を除去するために必要とされるビーズの量を算出する。 DDMとDMの場合、結合容量が10ミリグラム洗剤用約100mgビーズです。過剰の水なしで湿潤ビーズを量り取り、タンパク質混合物に直接添加する。少なくとも15〜20分間は完全に有効であることがビーズに必要であり、界面活性剤濃度の低下は、定常レベル^14-16に到達する。このようなバイオビーズSM2など〜18 mMのと同等の1.0ミリリットル液、ポリスチレンビーズの87ミリグラムの合計でDDM（ドデシルマルトシド）の8.7ミリグラムを削除するには、5等しい分数で使用されています。室温で一定転倒回転で20〜30分間、各画分とタンパク質/脂質/洗剤混合物を混ぜて、ビーズをスピンダウンビーズの次の画分に清を転送し、最後まで繰り返します。
      とき洗剤concentrATIONがCMCに達すると、我々は意図的に、溶液中の界面活性剤の少量の大きいものに小胞の融合を促進するように一時間に、その期間を延長する。
   3. 最後のステップの後に洗剤の微量を削除するには、35mgのバイオ·ラッドSM2ビーズを追加して、4時間のために小胞とインキュベート。
      上述した洗剤を除去するための手順は、新しいタンパク質に適用されるとき、それは一般的に〜1:10タンパク質/脂質比（重量/重量）で開始することが望ましい。脂質/洗剤混合物は慎重に十分な洗剤が完全に脂質（ 図2A）を可溶化するために追加されたように調製する必要があります。それは一定の揺れ（400回転）またはエンドオーバーエンド回転に室温（1〜2 mMのDTTを含む）で2つ以上の時間脂質洗剤混合物をインキュベートすることが重要です。タンパク質はstablであればタンパク質は脂質と混合する場合、タンパク質/脂質/洗剤混合物を一晩（十分な長さでインキュベートされるべきであるe）のいずれかを室温または寒い部屋の中でタンパク質含有ミセルと無タンパク質ミセル間に洗剤や脂質の分布が比較的均一になるように。 BioBeadsを用いた界面活性剤の迅速な除去が採用されている場合だけでなく、それはビーズの洗剤結合能を知ることが重要である。洗剤の遅い除去はおそらくタンパク質がそれらの整合性を維持し、相対的にかなりの小胞に挿入さになるように十分な脂質を持っていることが保証されます。

2.3。プロテオリポソー​​ムの貯蔵と品質管理

1. 胞の準備ができたら、液体窒素中に直接プランジングにより50μlのアリコートとフラッシュ凍結アリコートにそれらを準備。凍結した小胞は、その後-80℃の冷凍庫に保存されます。凍結融解サイクルは時々私達のCys-特異的反応にアーティファクトを導入することが判明したので、生化学的アッセイのために、我々は冷凍小胞を使用しません。電気的記録のためにsが、我々は唯一の6ヶ月未満のために-80°Cに保存されている小胞を使用しています。
2. 密度勾配における小胞の浮き（ 図2B）
   1. 0.3ミリリットル10のそれぞれ、35と4で4時間20万gで10mMのHEPESおよびスピンで行われた55％のショ糖℃までを含むショ糖勾配の層の上に小胞の懸濁液50μLを読み込む加速すると層の間の界面の混乱を避けるためにゆっくりと減速。
   2. 上から下に100μlの分画を収集し、非還元SDS-PAGE（ 図2B）でそれらを実行します。 KvAPは0.5〜1.0マイクログラムのタンパク質のバンドがはっきりと見えるようクーマシーブルーでよく染色される。 KvAPタンパク質は10〜35％ショ糖との間のインタフェースで発見されるべきである。タンパク質のない重質凝集体は、ほぼ全てのタンパク質が膜にあることを示し、高濃度域では見られない。
3. 胞におけるKvAPチャネルの適切なコンホメーションをチェックします。
   シングルシステイン変異体（L125C/C247S）KvAPことが確立我々の以前のデータは、適切に二重層に組み込まれたときに、完全に膜に埋もれており、システイン特異的な試薬⁸でアクセスすることはできません。再構成の手順は、この変異体チャネルでテストし、Cysを固有の試薬、MTS-PEG5000によって確認された。室温で1.0μMMTS試薬とL125Cで修正は非還元SDS-PAGEゲルでKvAPバンド5kDaシフトを導入しています。我々の再構築手順の実装を成功させるには、二重層内のすべてのチャネルのほぼ完全な挿入を示唆し、リン脂質膜におけるL125C変異体チャネルに対する検出可能な反応につながるはずだ。反応の陽性対照として、5.0 mMのDMがMTS試薬にアクセス可能な変異体チャネルのほぼすべてのL125C残をレンダリングするために導入される。
   あるいは、chrybdotoxin細孔結合毒素は、四チャネルをカウントするために使用することができる。などの抗体ベースのバインディング（FvをがKvAPためのコンフォメーション特異的リガンドとして調製されてボックス2を参照してください）​​と言うが、再構成された小胞で利用可能な結合部位を定量化するために使用されるかもしれません。これらの結合アッセイは、その後、再構成されたチャネルの割合が四と蛋白質の何分の適切に電位センサーパドルを（電圧センサのS3/S4）があるかを把握するために、総蛋白を測定する定量分析と比較することができます折った。
   再構成する他のタンパク質のためには、再構成されたタンパク質の割合が適切に折り畳まれているかを評価するための定量的な方法を導入することをお勧めします。慎重な機能検査は、このように成功した再構成のための良質のコントロールを開発するための前提条件である。

3。再構成チャネル含有小胞の応用

3.1。黒脂質膜におけるイオンチャネル活動の機能的研究。

n個の調製eeded材料。

1. 脂質製剤
   1. ガラス試験管、テフロン表面​​スクリューキャップ付きアンバーバイアル、クロロホルムのガラス注射器のセットを清掃してください。アルゴンガスの気流下アンバーバイアルを乾燥させる。
   2. アンバーバイアルに転送クロロホルム中0.75mgの教皇と0.25ミリグラムPOPGとアルゴンガスでクロロホルムを蒸発させる。
   3. 0.20ミリリットルのペンタンで乾燥させた脂質を洗浄し、残留クロロホルムを除去するために、完全に乾燥させます。最後に50μlのデカンで脂質を溶解する。デカン（20 mg / mlの）中の脂質二重層は、実験カップ（ 図3A）の一側に薄肉部分に穿設さ150-250ミクロンの孔（ 図3B）全体の脂質二重層を描くために使用される。
2. 溶液調製
   1. 細胞内液（トランス）：10mMのHEPES / KOH、pH7.4の、15mMの塩化カリウム
   2. 細胞外液（シス）：10mMのHEPES / KOH、pH7.4の、150mMのKClを
   3. 塩橋：ベンドガラスキャピラリーU字形ブリッジに、細胞外液中に溶解し、溶融寒天1.0％でそれらを埋める。
      トランスおよびシスソリューションとの間に確立浸透勾配が脂質二分子膜¹⁷上の小胞融合のための主要な原動力であることが判明した。負に荷電した脂質については、15 mMのCaCl ₂をまたは正に荷電したポリアルギニンペプチドは、融合事象を誘導できることが見出された。などDOTAPとDOGSとして融合脂質、などが、脂質に導入することができる融合イベントのチャンスが高くなるように小胞。

脂質二重層におけるKvAPチャネルからの電気録音

1. 二重層カップ（ 図3B）の円筒面で掘削され丸い穴（直径〜0.25ミリメートル）プリペイント。脂質は実験室で作られてキャピラリー乳棒で転送されます。キャピラリー杵の丸頭を研磨し、カップの表面を傷つけることはありません。木曜日キャピラリー乳棒によって運ばれる脂質の電子少量重層カップの穴の周りに広がると、空気乾燥されています。
2. デカンが完全に蒸発するように、1〜2分待ちます。注意が孔内への脂質溶液を回避するために取られるべきである。
3. 録音室にカップを挿入し、塩橋に入れ、記録カップの両側（ 図4A）に電極を接続してください。穴の両側にシス - およびトランス - ソリューションを追加します。浸透勾配は脂質二重層への小胞の融合を促進するために確立されます。
4. 〜0（通常<2ミリボルト）にカップの両側間のオフセット電位を調整します。デカンの脂質混合物の少量を転送するために毛細血管乳棒を使用し、二重膜が形成されるまで穴を越え脂質をペイント。二重層の形成は、ランプパルスの配達の間の静電容量電流を記録することによって検出される。
5. 膜まで待つ間引くと比較的安定する。 3-5分間膜容量には多くの変化がないまで、私たちは待ってください。
   、大きな穴全体に形成された平面二重層に関する一般的な考え方では、膜の非常に中央部分は、通常の二重層の厚〜4.0 nmであることが近いことであり、それは穴の縁に近づいたときに膜が厚くなるそこアニュラスの周りで、デカン溶媒のほとんどは^{、19 18}である。それは、膜の二重層中央部に残された残留デカンが存在することは避けられない。 n-デカン対PCの体積比の過去の推定は二重層^18、20-22の薄型化の後に0.35〜0.45であった。 EM間引き二重層の検査では、二重層²²の二尖の間に挟まデカンのレンズがあったことを示した。これらのデータは、脂質二重膜に挿入された膜タンパク質は、デカンの小さな島（直径50nmまで）と共存することが示唆された。残留デカンIn個の二重層はまた、測定された静電容量に基づいて間引き二重層の大きさの大まかな推定値を得るために使用することができる0.4〜0.5μF/ cm ²で、一定の電気容量を減少させる。 100pFの容量の二重層は、直径〜180ミクロンの円形の二重膜から来ている。
   KvAPについては、残留デカンは、チャネル機能を慎重に無溶剤型二重層で検討されていない場合でも、その電圧依存性ゲーティングを損なわなかった。同じことがNaChBacチャンネルBLMS ²³挿入Kv1.2チャネルに対して真であるように思われた。これは、卵母細胞のチャネルにデカン脂質二重層の相対でKv1.2チャネルから測定されたGV曲線の重要な左シフトが残留デカン²³とは何かを持っているかどうかはまだ不明である。二重層を形成するのに使用される脂質に応じて、二層の残留デカンの量が変わる場合があります。例えば、それが報告された平面脂質membrの形成MGDGのanes（モノガラクトシル - ジアシルグリセロール）はデカン分子で満たされている円錐MGDG間に隙間が原因の可能性デカンが必要です。残留デカンを検討するタンパク質の影響を持っているかどうかは、純粋に経験的であり、実験的なテストが効果が有意であるかどうかを伝えるために必要とされる。
6. とすぐ膜が安定するように、右の穴の上にP2-ピペットチップの細かい端を配置することによって、0.5〜1.0μlのチャネル含有小胞を撃つ。小胞は、カップの底に穴を越え落ちる。
   このプロセスの間に、複数の小胞は、穴を横切る膜に付着する。十分な時間が与えられ、いくつかはKvAPチャンネル数が少ない適切膜の中央部に平面的な二重層に挿入されるように、二重層部分に融合される。浸透勾配と静電相互作用の両方が脂質二重層^17、24への小胞の融合において重要である。
7. テストする二重層中KvAPチャネル、80 mVのの短いパルスが-80 mVの保持電位から配信されています。速い不活性化と不活性化からの回復の遅れが原因で、長い間隔（PE / PG膜におけるチャネル用〜120秒）は、2つのパルス間与えられている。 POPE / POPG膜内のチャネルからの典型的な現在の記録は、 図3Cに示す。電流が小さい場合には、より多くの小胞を撮影する。電流の大きさがよさそうすれば、膜の両面に溶液中のイオン濃度のバランスをとる。チャネルは、電気生理学的実験のための準備が整いました。

3.2。胞のチャネルに対するコンフォメーション特異的リガンドのスクリーニング

1. ファージディスプレイライブラリの紹介。
   ファージディスプレイ20量体のペプチドライブラリは、糸状バクテリオファージfdの-テトラ²⁵の一端にPIIIタンパク質の5コピーのN末端 ​​に存在する。ライブラリには約を提示します。 1×10 ^8が異なるランダム20-merのペプチド配列のENTタイプは、とは、親切にUTの南西医療センターの²⁶博士Kathlynnブラウンの研究室で私たちに提供された。 E.へのファージ感染大腸菌 K91は12μgの/ mlのテトラサイクリンに細菌が耐性になります。
   細菌培養のための詳細な手順、ファージとファージコロニーのシークエンスの増幅とタイターは、我々は次のセクションで基本的な操作の簡単な説明を与えるマクガイアら ²⁶によって記載されている。読者はマクガイア紙と、より詳細な情報を確認することができます。私たちは、その代わりに小胞（ 図4A）で再構成イオンチャネルにしっかりと結合する特異的クローンの分離に焦点を当てます。
   我々の画面の背後にある基本的な考え方は、特に再構成されたチャネルに結合したファージを小胞でプルダウンすることができることである。結合したファージは、脂質膜のチャネルに対して増幅し、試験することができる。の我々の研究異なる脂質膜⁸ KvAP電圧センサーのコンフォメーション変化は、通常のリン脂質から頭部基の領域にリン酸塩を含まないものに脂質を切り替えることにより、 "活性化"または"安静"状態のいずれかで、電圧センサを維持することが可能であることを示した（我々の実験でDOTAPとDOGS）。これら二つの脂質決めコンフォメーションは、コンフォメーション特異的リガンドの我々のスクリーニングに利用されている。ファージライブラリーは、最初DOTAP及びDOGS膜（ポジティブセレクション）のチャネルにタイトバインダー用に選択される前に、リン脂質小胞のチャネル（負の選択）によって飽和されます。
2. ファージの選択の背後にある基本的な手順
   LB培地でK91細菌の増殖：細菌の倍加時間は37℃で約20分で200℃回転してCが揺れ。
   ライブラリの増幅：OD0.4で細菌K91とファージ溶液を混ぜる。 37℃で15分間のインキュベーション後に°C、混合物を12μgの/ mlのテトラサイクリンを含む-9.5 X 9.5インチ²寒天プレート上に均等に分散されている、大規模なプレートの使用は、高い成長率を持っている細菌によって文化の優位性を防ぐことができます。ライブラリーの多様性が小さくなると、10cmのペトリ皿を選択および小規模増幅のために使用される。
   個々のクローンの大規模増幅：37℃で一晩増殖、250mlのLBプラス5 mMのMgSO ₄を、12μgの/ mlのテトラサイクリンにファージの少量（〜100百万）を接種℃に10分間6,000 rpmでスピンして細胞を収集します。上清を回収し、その中に0.2体積/体積降水バッファー（2.5 MのNaCl、20％PEG8000）を追加します。 1.0時間、氷上でインキュベートした後、ペレットすべてファージ〜30分間17,000 xgでソリューションを遠心。すべての上清を取り除き、30分間氷上に1.0ミリリットルPBS、インキュベートを追加、優しくペレット（無ボルテックス）を懸濁します。新しいチューブに懸濁物を移し、14,00で遠心2分間0回転。別のチューブに上清を移し、すべての細菌を殺すために15分間65℃の水浴中でインキュベートする。 13,000 rpmで2分間、チューブを遠心します。ペレット、アリコートを破棄し、-80℃でファージ溶液を保存する
3. 脂質小胞にKvAPチャネルに対するファージのパン。
   1. ペプチド表示ファージは増幅され、我々の実験はそう単位体積当たりのファージの数が知られている前に滴定する必要があります。 KvAPをネガティブコントロールとして、そしてDOGSにPOPE / POPG（3:1）プラス0.50％ビオチン-DOPE小胞に再構成されました：ビオチン-DOPE（199:1;同じはDOTAP胞のために行われた）選択対象として使用されます。小胞におけるKvAPの最終濃度は0.50 mg / mlのであり、脂質が5.0 mg / mlのである。パンバッファは500のKCl、100mMリンHEPES / KOH pH7.4の、および0.10 mg / mlのBSAを含んでいた。
      最初の実行については^、10〜10ファージ（各タイプのための100コピー）が0.050ミリリットルのLB培地に希釈した。その後のパンステップ、stのためのartingファージ^8月 10日から^6月 10日まで内になるように調整した。
   2. 負の選択：
      1.0ミリリットルパンバッファで、100μlのアビジンアガロースビーズ（ピアース樹脂1mlあたり結合1-2 mgのビオチン化BSAのできる）と50μlのLBで希釈したファージをインキュベートする。 10分のインキュベーション後、1.0分間100×gで、それらを回転させてビーズを分離する。二回ビーズに直接結合する任意のファージを削除するには、この手順を繰り返します。
      全くタンパク質を含まない50μlの空胞（POPE / POPGプラス0.5％ビオチン-DOPE）と前のステップから左オーバーファージを混ぜる。ファージ小胞混合物へのパンニング緩衝液で洗浄された100μlのアビジンビーズを追加します。 5分間室温で混合物を回転させた後、30秒間、100×gでスピンしてビーズを取り除く。ビオチン-DOPE（199:1）と同様POPE / POPG胞におけるKvAPチャネル（0.5％ビオチン-DOPEを含む）のために：このステップは、DOGSの空胞のために繰り返されます。これらの治療contai後の上清NS完全クリアファージ。最初の二つのスクリーンサイクル後、preclearanceはPOPE / POPG胞にKvAPに対してのみ行うことができた。
   3. 正の選択
      10分間室温で100μlのアビジンビーズの存在下でビオチン-DOPE（199:1）胞（DOTAP小胞に同じ）：DOGSでKvAPチャンネル完全クリアファージをインキュベートする。 10分間、100×gで遠心分離前にパンニング緩衝液を用いて15ミリリットルを混合物の体積を持参してください。ビーズを収集し、45ミリリットルパンバッファーでそれらを3回洗浄する。
   4. 5.0μgの/ mlのビオチンを含有する500μlのLB培地にビーズを再懸濁し、そして天然のビオチンよりも低い親和性を有するアビジンから、結合したファージの一部を解放するために、2時間室温で混合物をインキュベートする。 1分間100×gでスピンでビーズを分離する。タイターのための2つの異なるチューブに上清とビーズを収集します。
   5. 選択されたファージはmを増幅する上清または500μlのK91細菌培養物（培養OD600〜0.4〜0.6、〜4時間、それが使用される前に）との最後のステップに再懸濁したビーズのIX200μlの。 37℃でインキュベーションした後℃で一晩培養のためのテトラサイクリンプレート上にそれぞれ15分、プレート50μlのために。
      すべてファージコロニーを回収し、増幅するために最初の2つのスクリーンサイクルの間（ 図4A）、最後のステップからのすべての500μlの上清とビーズを集める5ミリリットルの細菌文化とそれらを混合し、9.5インチの正方形のプレート、プレート、それらを。このステップでは、細菌が他より遅い成長させるそれらのファージを回収するために重要です。
   6. プレートからのコロニーをパンニングと選択（マクガイアらを参照してください^。、26）の次のサイクルの前に増幅し、力価測定されています。
   7. チャネル上で積極的に選択されたファージの活動を調べます。
      選択の10-12サイクル後、脂質ビラでKvAPチャンネルで合計増幅ファージをテストPOPE / POPG作らのyers。陽性クローンのかなりの部分がある場合、我々は安静状態で安定チャネルに対して選択されたとして、100〜500 nMのに選択されたファージは、二重層（ 図4B）にチャネルのかなりの割合をブロックする必要があります。肯定的なデータは、静止状態でのチャネルに強い結合が表示されたクローンが存在することを示唆している。選抜の16サイクル後、シングルコロニー配列決定のための50陽性コロニーを選択します。識別された支配的なファージクローンは、配列を比較することから選択され、そして増幅され、二重層内のチャネルに対してテストされる。陽性クローンが確認されると、強い陽性クローンによって運ばれるペプチドを合成し、それらのコンフォメーション固有の活動を確認するだけでなく、チャネル上にそれらをテストします。

3.3。構造決定^27-29用膜にKvAPチャネルの結晶

1. のコンフォメーションを安定させるチャネルは、チャネル、33H1のFvタンパク質のコンフォメーション特異的結合剤は、KvAP / Fvを複合体を形成するために使用される。のFvタンパク質の調製は、箱2に詳述されている。スーパーデックス200カラムで複合体を精製する。我々のシステムで11.4ミリリットルの周りで複雑な溶出。
2. 初期画面では、完全にDMまたはβ-OGに可溶化されDMPCまたはPOPCとタンパク質を混ぜて。タンパク質/脂質/洗剤混合物は、混合ミセル間の3つの成分の分布における熱力学的平衡に達するために、15以上の時間混合される。通常、我々は最初の三つの異なる脂質/タンパク質比（LPR = 0.5、1.5、2.5）と3つの異なるpHレベル（6.0、7.0、および8.0）をテスト。透析緩衝液は、20mMのK-リン酸緩衝液、100mMのKClを、および3.0 mMのアジ化ナトリウムが含まれています。透析緩衝液は、2〜3日毎に変更される。結晶の小アリコートを、小胞の形成および結晶格子の可能な外観を調べるために2〜3日毎に取り出される。
   タブロイドリストLPRの対pHは、脂質2つの異なるタイプの中のタンパク質の挙動を決定するために使用される。私たちは、透析サンプルをネガティブ染色EMによって検査されたとき（以上150 nm）の比較的大型の小胞や膜シートを取得する。膜の小さな規則的なパターンは、ヒット提案してさらなる最適化を導くために使用される。
   ネガティブ染色EM：炭素膜（〜3-5 nmの厚さ）でコーティングされた銅グリッドがされグロー放電さ炭素表面を親水性にするために空気インチ結晶懸濁液を少量の（2-3マイクロリットル）炭素表面上にロードされ、0.5〜1.0分間インキュベートする。ワットマン＃4ろ紙の部分の破れたエッジ側からグリッドを吸い取る。グリッドを裏返し、150マイクロリットルの染色液（2.0％の低下の上に〜15秒のためにそれをインキュベートPTA / KOH、水のpH 8.0プラス0.5％トレハロース、または6.0％モリブデン酸アンモニウム/ KOH、pH6.3-6.5 、水のプラス0.5から1.0パーセントのトレハロース）。できるだけTからソリューションを吸い取る彼グリッド面と、グリッドが検査のためにTEMに挿入する前に乾燥させます。小胞の画像は電子による任意の結晶パッキンの損傷を避けるために低用量条件下で撮影されています。
3. 画面が正しいLPRを達成するために、LPRの小さなステップを調べるために拡張される。タンパク質は結晶化に適している場合は、膜中のタンパク質の小さな格子が見えるようになることがあります。これらの初期条件の周りに、さらに塩の種類と濃度、温度、速度及び洗剤の除去、二価カチオン、タンパク質を調製するために使用される界面活性剤、沈殿剤、脂質組成物等の方法を変化させることによって結晶化を最適化
   KvAPΔ36/Fv複合体の最適化された2次元結晶は20〜30ミクロン（ 図5A）に数ミクロンから大きなシートその範囲に成長。 4回対称ちゃんから予想通り低温電子顕微鏡の条件下では、結晶は明らか4回対称性と明確な正方格子を示すNELS（ 図5B及びC）。

結果

生化学的に均質KvAPチャネルを浄化するための実験の一般的な流れは、 図1Aに記載されている。タンパク質の発現および精製の ​​間に、典型的な試料は、 図1BにおけるSDS-PAGEゲルに示す。 IMAC精製後のタンパク質は比較的純粋である。 KvAPチャンネルの収量は約1.0 mg / Lの文化です。

洗剤と脂質小胞の可溶化は、脂質対洗剤のペアごとに解決され?...

ディスカッション

異なる膜にKvAPチャネルの再構成は、いくつかの研究^8-10に使用されています。洗剤/脂質混合ミセル及びタンパク質/洗剤/脂質混合ミセル間での脂質の分布を確保するという考え方に続いて、我々は非常に異なる脂質からなる膜にKvAPのほぼ完全な再構成を達成することができる。各四量KvAPチャネルは完全にその膜貫通ドメインをカバーするために〜100脂質分子を必要とします。本質的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	RPI Corp.	T60060
Yeast Extract	RPI Corp.	Y20020
NaCl	Fisher	S271-3
Tris Base	RPI Corp.	T60040
Potassium Chloride	Fisher	BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside	Affymetrix	D322S	Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside	Affymetrix	O311	Ana-grade
Aprotinin	RPI Corp.	A20550-0.05
Leupeptin	RPI Corp.	L22035-0.025
Pepstatin A	RPI Corp.	P30100-0.025
PMSF	SIGMA	P7626
Dnase I	Roche	13407000
Bio-Bead SM-2	Bio-Rad	152-3920
HEPES	RPI Corp.	H75030
POPE	Avanti Polar Lipids	850757C
POPG	Avanti Polar Lipids	840457C
DOGS	Avanti Polar Lipids	870314C
DMPC	Avanti Polar Lipids	850345C
Biotin-DOPE	Avanti Polar Lipids	870282C
DOTAP	Avanti Polar Lipids	890890C
NeutrAvidin agarose beads	Piercenet	29200
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories, Inc	132-570
Pentane	Fisher	R399-1
Decane	TCI America	D0011
MTS-PEG5000	Toronto Research Cemicals	M266501