Восстановление Kv канала в липидные мембраны для Структурно-функциональные исследования

Резюме

Процедуры для полного восстановления прототип напряжения закрытого калиевых каналов в липидных мембран описаны. Восстановленные каналы подходят для биохимических анализов, электрические записи, лиганд скрининга и электронно исследования кристаллографических. Эти методы могут иметь общего применения в структурных и функциональных исследований других мембранных белков.

Аннотация

Для изучения липид-белковых взаимодействий в редукционистский моды, необходимо включить мембранных белков в мембранах четко определенных липидной композиции. Мы изучаем липидов зависит эффект стробирования в прототипе напряжения закрытого калия (кВ) канал и разработали подробные процедуры для восстановления каналов в различных системах мембраны. Наши процедуры восстановления принимать рассмотрение как моющее средство индуцированного слияния пузырьков и слитый белок / детергент мицеллы с липидной / детергент смешанные мицеллы, а также важность достижения равновесного распределения липидов у белка / детергент / липид и моющего средства / липид смешанные мицеллы. Наши данные свидетельствуют о том, что введение каналов в липидных везикул относительно случайной ориентации, а также восстановление эффективность настолько высока, что нет обнаруживаемых совокупностей белка были замечены в фракционирование экспериментов. Мы использовали восстановитьд каналов для определения конформационных состояний каналов в различных липидов записи электрических деятельности небольшим количеством каналов включены в плоских липидных бислоев, экран конформационно-специфических лигандов из пептидных фаговых дисплеев, библиотеку и поддерживать рост кристаллов 2D каналов в мембранах. Восстановление процедуры, описанные здесь, могут быть адаптированы для изучения других мембранных белков в липидных двойных слоев, особенно для исследования липидов действие на эукариотические напряжения закрытого ионных каналов.

Введение

Клетки обмена материалами и информацией с окружающей средой через функции специфических белков мембраны ^1. Мембранные белки в клеточных мембранах функционировать как насосы, каналы, рецепторы, ферменты внутримембранных, линкеры и структурные сторонников через мембраны. Мутации, которые влияют на мембранные белки были связаны со многими заболеваниями человека. В самом деле, многие мембранные белки были основными целями наркотиков, потому что они важны и легко доступны в клеточных мембранах. Поэтому очень важно понимать структуру и функцию различных мембранных белков в мембранах, и делают возможным разработать новые методы, чтобы облегчить вредных эффектов от мутантных белков в человеческих болезней.

Липиды окружают все мембранные белки интегрированы в ^{2 бислоя, 3.} В эукариотических мембраны, различные типы липидов, как известно, организованных в микродоменов ^{4, 5.}Многие мембранные белки, как было показано, распределяется между этими микродоменов а также громоздкие жидкой фазы мембран ^{3, 6.} Механизм, лежащий организации микродоменов и поставка мембранных белков в них и физиологическое значение таких распределений явно важна, но остаются плохо изученными. Одним из основных технических трудностей в изучении влияния на липидный мембранных белков является надежным восстановления биохимически очищенных мембранных белков в мембраны хорошо контролируемых липидный состав, так что почти все восстановленные белки являются функциональными ^7. В последние несколько лет, мы разработали методы для восстановления прототипа напряжения закрытого канала калия из A. Pernix (KvAP) в различные мембранные системы для структурных и функциональных исследований ^8-10. Данные от других и нас вместе показали, что липиды, вероятно определителя в конформационные изменения напряжения зондированиядоменами напряжения закрытого ионных каналов и может формировать структуры некоторых из этих каналов ^11. В следующем, мы предоставим подробное описание наших методов и предложит важные технические советы, которые, скорее всего, обеспечить успешное воспроизводство наших результатах, а также расширение наших методов в исследованиях других мембранных белков.

протокол

1. Экспрессия и очистка KvAP канала (рис. 1)

1. Подготовительные работы - день 0
   1. Промыть стекло колбы для бактериальной культуры деионизированной водой (DIH ₂ O) и MilliQ Н ₂ О (MQH ₂ O), чтобы удалить следы моющего средства из общих мытья посуды.
   2. Автоклав 1000 мл LB среды в 2,8 л колбы Эрленмейера (всего двухлитровым культуру за образец здесь). Низкая жесткость воды было установлено, что важно для успешного культуры трансформированных бактерий.
   3. Автоклав 100 мл LB среды в 500 мл колбах
   4. Преобразование 60 мкл XL1-синий компетентных клеток с 200 нг pQE60 плазмиду, содержащую ген KvAP с сайтом тромбина резки и Его ₆ тег на его С-конце, плиты бактерий на два LB-агаром, содержащим 100 мкг / мл ампициллина, и инкубировать их в течение 14-16 часов при 37 ° C инкубатора.
2. Выражение KvAP - День 1
   1. Проверьте приложениеearance бактериальных колоний на пластинах после инкубации в течение ночи. Колонии правило, только около 0,2-0,5 мм в диаметре, и было их много. Мы не хотим, пластин, которые питают большие колонии, окруженные большим количеством спутниковых колоний.
   2. Добавить 5,0 мл LB среду в каждую LB-агаром инкубируют в течение ночи и лом от колоний. Передача суспензию бактерий в 100 мл LB-средой автоклаве в колбу объемом 500 мл. Добавить ампициллин в концентрации 100 мкг / мл, инкубацию небольшой культуре в течение ~ 1 ч при 37 ° С или пока OD600 не достигнет 0,60.
   3. В то же время, место две фляги 1,0 л среды в 37 ° C инкубаторе встряхивания, чтобы разогреть среды, и подготовить 20 мл BaCl ₂ (1,0 М, 10 мМ конечной концентрации в каждой культуре L 1.0), 2,0 мл 0,4 М IPTG (изопропил-тио-β-галактозид) и 2,0 мл 100 мг / мл ампициллина акции в воде.
   4. После того как небольшие культуры готово, добавьте 10 мл BaCl _2, 1,0 мл ampiciОИСДП акций, и 50 мл культуры Малой с шага 1.2.2 подогретого СМИ LB. OD 600 должно быть около 0,05. Часы для возможных осадков из-за высокой жесткости воды и противоионов в LB среды. Ва ^{2 +,} как известно, связываются с порами область калиевых каналов и блоков ионного тока, и, следовательно, снижает токсичность высокий уровень экспрессии каналов бактерий.
   5. Возьмем OD600 каждый час, пока он не достигнет 0,70, и каждые пятнадцать минут, пока не достигнет 0,8 до 0,9. В нашей установке, как правило, занимает ~ 5 часов, чтобы достичь 0,8.
   6. Добавить 0,40 мМ IPTG, чтобы начать индуцированной экспрессии белка канал, и инкубируют культуры в течение еще 4,0 ч при 37 ° С при 225 оборотах в минуту встряхивании.
   7. Урожай бактерий в 1,0-литровых бутылок центрифуги центрифугированием при 4000 х г, 4,0 ° C в течение 15 мин. Слейте супернатант как можно больше отходов в стакан, добавить 10 мл 1,0 М Na-фосфатный буфер, чтобы осадить все Ba ^{2 +,} а затем добавитьНебольшой объем отбеливателя, чтобы убить бактерии. Хранить собранные бактерии в центрифуге бутылки похоронили в лед в 4,0 ° C холодную комнату на ночь.
3. Очистку белка KvAP (день 2 и 3; фиг.1В)
   1. Ресуспендируют осадок бактерий в 15 мл буфера для лизиса IMAC в культуре L 1.0. Добавить ~ 1,0 U ДНКазой I, и три ингибиторов протеазы лейпептина, пепстатина и апротинина в 1,0 мкг / мл. Общий объем в двухлитровый культура была ~ 35 мл.
   2. Разрушать ультразвуком Ресуспендированную бактерий в металлический стакан похоронен на льду в течение всего 10 мин времени включения. Микрозонде ультразвукового был установлен в 5 секунд ON / OFF 10 сек цикл с 40% выходной мощности в 4,0 ° C холодном помещении. Установка выходной мощности определены эмпирически, так что большинство бактерий лизировали без особого нагрева в растворе.
   3. Добавить 0,50 г N-децил-β-D-мальтозид (DM; Соль-класса от Anatrace) в форме сухого порошка, чтобы ультразвуком клеточного лизата и инкубировать смеси в течение 30,5 ч при комнатной температуре (RT) при постоянном встряхивании горизонтальной (~ 100 оборотов в минуту) для того, чтобы извлечь столько белков канал насколько это возможно. Важно, чтобы убедиться, что моющий порошок полностью растворяется в течение 30-50 мин.
   4. После того, моющее средство экстракции удалить остатки клеток из лизата центрифугированием при 20000 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. В ожидании центрифугирования до конца, подготовить His-основе тегов LC (низкого давления жидкостной хроматографии) колонки как описано во вставке 1.
   5. Загрузите супернатант со стадии 1.3.4 на предварительно упакованные IMAC (я mmobilized м идр ион ffinity с hromatography) колонку при скорости потока 1-2 мл / мин, который приводится в действие перистальтический насос. Альтернативно извлеченного His-меченый белок можно инкубировать с IMAC-смола для периодического обязательным.
   6. Вымойте смолы IMAC, запустив 5 объемам слоя IMAC промывочного буфера и 10 объемов слоя IMAC любителя мытьяER плюс 20 мМ имидазола. В линию УФ монитор используется, чтобы убедиться, что промывка чистой.
   7. Элюировать KvAP белка путем применения IMAC буфера для элюции, содержащего 300 мМ имидазола. Большинство связанных KvAP элюируют в течение 6 мл элюирующего буфера через колонку. Добавить тромбина (1,0 ЕД в 2-3 мг белка) в объединенных фракций элюирования и инкубировать белка ночь на скамейку, чтобы расщеплять Его ₆ тега.
   8. На следующий день, концентрат тромбина расщепленный раствор белка в Centricon (MWCO = 30K) до 600 мкл на гель-FPLC (жидкостной экспресс-хроматографии белков). Во время центрифугирования перемешайте пробу каждые пять минут, чтобы минимизировать агрегацию белков. Поскольку белок концентрируют локальной концентрации на мембранный фильтр становится выше, и иногда ясны белый осадок, которые могли бы попасть в фильтр мембраны. Кроме того, высокая концентрация белка (~ 5-10 мг / мл) в нижней части концентратора приводит к бровиНиш смешивания цветов и действительно помогает свести к минимуму потери образцов.
   9. Выполнить концентрированного KvAP через колонку Superdex 200, который предварительно уравновешивали FPLC уравновешивающим буфером. Обычно пик тетрамерная канал KvAP в DM элюируется с сохранением объема 12,3 мл. Существует небольшая заднего хвоста около 13,6 мл, который имеет небольшое количество мономерных KvAP. Пустоты колонны мы использовали в 7,0 мл и обычно образца приводит к небольшой пик при пустоты, который содержит очень мало KvAP белка. Имидазола приходит в конце элюции (~ 24 мл). Бассейн фракций, содержащих KvAP тетрамеров вместе и концентрат раствор белка до 0,5 мл. Определяют концентрацию образца путем вычисления коэффициента поглощения (~ 1.2E-5.0 М ^-1 см ^-1, которая была рассчитана на основании количества ароматических остатков) из KvAP при 280 нм [ссылка ^12; URL: http:// web.expasy.org / protparam /].
      При комнатной температуре очищенного KvAP в DM стабилен в течение по крайней мере недели без существенной потери белка. При 4 ° С, это может длиться еще дольше. никогда не замерзают белка в моющих средствах. Рекомендуется хранить белка в DM при 4 ° С и белка в β-OG при комнатной температуре. Но мы обычно не ждут, и перейти к шагу восстановления сразу после белки готовы.
   10. Assay образцов в 12% снижение SDS-PAGE гель.
       Образцы из каждой стадии, описанной выше, были получены смешиванием 20 мкл образцов с 5-кратным SDS-буфера для образцов (см. таблицу 3 для буферов) с добавлением 1,0% β-ME. Образцы не кипятят. После гели были готовы, образцы обычно был в SDS-буфера в течение более 10 мин при комнатной температуре. После гель был запущен и окрашивали Кумасси синим, дикого типа KvAP появился в виде одной полосы на уровне около 26 кДа (фиг.1В ). Очищенный образец был биохимически однородной и по крайней мере 95% чистоты.

2. Восстановление ионного канала

2.1. Липосом и моющих средств-индуцированного слияния везикул

До липидный препарат, мыть 14 мл одноразовые стеклянные пробирки, с завинчивающейся крышкой стеклянной трубке, и 250 мкл стеклянный шприц с хлороформом. Вылейте ~ 10 мл хлороформа в TestTube.

1. Приготовление пальмитоил-олеоил-фосфатидилхолина этаноламином (Папа Римский) и пальмитоил-олеоил-фосфатидилхолина глицерина (POPG) липосомы.
   1. Передача 3,75 мг POPE и 1,25 мг POPG (POPE: POPG = 3:1, весовое соотношение) в хлороформе в предварительно очищен с завинчивающейся крышкой стеклянную трубку и высушить липидов в непрерывном потоке газа аргона. Когда никакого видимого хлороформ не осталось, сухой липидной далее при комнатной вакуумом в течение одного часа.
   2. Добавить 440 мкл низким содержанием соли-буфера (10 мМ HEPES, рН 7,4) Или воды в высушенного липида и вихревые трубки для гидратации липидов. Липидной суспензии выглядит беловатым и мутной.
   3. Разрушать ультразвуком липидной суспензии в ледяную ванну ультразвуковую до пузырька раствор не станет полупрозрачным (OD410 <0.2).
      Как правило, для 10 мг / мл Pope / POPG раствора в воде или низкой буферной соли, мы работали с ультразвуковым 30 сек ON и OFF 30 секунд (на льду) в общей сложности на 15-20 мин. Из-за тепла, генерируемого во время обработки ультразвуком, желательно добавить 1,0 мМ DTT в липидной решение для того, чтобы минимизировать окисление липидов, а для охлаждения водяной бане устройства для обработки ультразвуком до 10 ° С или ниже. Окончательный OD410 является липидный-зависимыми. Для некоторых липидов может быть очень трудно достичь таких низких OD. Если это произойдет, мы обычно используем моющие средства, чтобы полностью растворить липиды и использовать долговременные инкубации для достижения хорошего распределения липидов вокруг белоксодержащий мицеллы (см. далее).
      Высокой емкости ванны ультразвуковой играет важную роль в аоER достичь OD410 <0,2. Мы используем системы сделано в лаборатории назначения Co, Inc (Model # G112SPIG, Hicksville, NY). Ключ для надлежащей обработки ультразвуком везикул, чтобы убедиться, что резонансная центром в середине трубки имеет сильную вибрацию. Вибрации изменяется в зависимости от объема воды и, следовательно, могут быть скорректированы. Также эмпирически установлено, что повышение вязкости воды при добавлении небольшого количества глицерина может повысить эффективность обработки ультразвуком.
      Альтернативно мы обнаружили, что использование ультразвукового микрозонда в контакте с липидной суспензии в пластиковую или металлическую трубку можно получить те же результаты. Микрозонде должна быть очищена и только погрузите наконечник в липидной решение. Поскольку липидных частиц разбиты на мелкие кусочки на поверхности микрозонда, очень важно, чтобы образец охлаждается, и некоторые восстановители вокруг, чтобы предотвратить окисление ненасыщенных липидов.
      Под крио-электронной микрoscopy, большинство ультразвуком однослойные везикулы 30-50 нм в диаметре (данные не показаны). Кривизна небольших внедорожников настолько высока, что небольшое возмущение достаточно, чтобы вызывать яркие слиянием этих пузырьков в более крупные, которые являются 80-200 нм в диаметре (см. ниже).
   4. Добавить 50 мкл 3,0 М KCl и 10 мкл 0,50 М DM к смеси таким образом, чтобы конечной суспензии липидов имеет 300 мМ KCl и 10 мМ DM. Инкубируют раствора с горизонтального вращения в течение 2 ч при комнатной температуре, чтобы сформировать липид / моющее средство смешанных мицелл. После инкубации суспензии должна стать немного мутный бит (2А), что связано с моющим средством индуцированного слияния небольшие однослойные везикулы.
   5. Когда белок концентрируют до более чем 2,0 мг / мл, и 0,50 мг KvAP белка, 50 мкл 3,0 М KCl, 16 мкл 0,50 М маточного DM в воде, и HEPES 10 мМ, рН 7,4 с липидом / детергент смеси составляют 1 мл конечного объема. Окончательный липидов: соотношение белков вес 10:01и конечная концентрация DM в 18 мМ (фиг. 2А). Инкубируйте белок / липид / детергент смесь в стеклянную трубку с горизонтального вращения в течение еще 2 часов.
      Выбор концентрации моющего средства ориентируется на моющее средство индуцированного слияния везикул и везикул солюбилизации ^13. Когда пузырьки образуются сильные ультразвуком, их средний диаметр находится в диапазоне 30-50 нм при EM. Эти пузырьки имеют очень низкое рассеяние при 410 нм. При низких концентрациях, моющие средства сначала вставл ютс в пузырьки, дестабилизировать пузырьков, и индуцировать слияние моющее средство насыщенной везикулы (OD410 идет вверх, см. рисунок 2А). Везикул слияние приводит к увеличению OD410 нм. Для 10 мг / мл Pope / POPG пузырьков, OD410 пиков на уровне около 15 мМ DM. Когда больше моющих средств вводятся, пузырьки начинают ломаться на куски и липидов становятся разделена на моющие средства / липидного смешанные мицеллы. Этот последний процесс сопровождаетсяснижение OD410 до конечного низкого уровня (<0,1).
      Из-за активные события синтеза в фазе роста оптической плотности в связи с моющим средством индуцированного слияния мелких пузырьков, весьма вероятно, что белок / детергент мицеллы будут активно слиты с моющим средством насыщенной липидные везикулы. Это является причиной выбора 18 мм DM на момент получения белка / липид / моющего средства смеси. Если моющее средство становится концентрировали более 4 складок, количество DM должна быть отрегулирована таким образом, чтобы конечная концентрация еще около 18-20 мМ. Когда выход белка является очень низкой, трудно оценить, сколько концентрированной моющие средства в образце вместо этого мы будем смешивать белка с полностью солюбилизированного липидов и использовать полностью уравновешенной смеси для восстановления. В наших руках, если не хватает времени давали достичь хорошего равновесное распределение липидов между содержащего белок и не содержащей белков мицеллы, reconstitutионных эффективности значительно снизились. Обычно мы проверить восстановление эффективность двух экспериментов: 1) рассматривает совместно миграции белковой с пузырьком фракции сахарозы центрифугирования в градиенте плотности; 2) извлечения белка из восстановленной везикулы и фракционирования их в гель фильтрационную колонку найти сколько белка (KvAP в нашем случае) остается быть тетрамерной. Минимальное время инкубации белок / липид / моющих средств нескольких часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °.
      Для нового мембранного белка, который является стабильным в различных моющих средств, первый шаг, чтобы выяснить, растворение свойство липидов таких моющих средств, подобно тому, что показано на рисунке 2А. Далее, желательно начинать с ПК экстракты, такие, как E. палочка полярного PC экстракт, экстракт сои ПК и т.д., так что если специфический белок нуждается в определенных фосфолипидов для своей функции, она может быть уже включен в добычеТед липидной смеси.
2. Подготовка KvAP в смеси с детергентом солюбилизированного 1,2-диолеил-3-триметил-пропан (DOTAP) или 1,2-диолеоил-Sn-глицеро-3-сукцинат (собак) --- пример полной солюбилизации липидов для восстановления
   1. Липидный препарат такой же, как для POPE / POPG пузырьков. Ультразвуком гидратированных липидов на мелкие однослойные везикулы нужно больше времени (обычно 45-60 минут), чем для Pope / POPG липидов (обычно 5-10 мин). Собаки пузырьков может медленно предохранитель друг с другом и образуют небольшие жирной капель.
      Из-за трудностей в создании высокого качества внедорожников из DOTAP и собак воспроизводимым, мы обычно растворения этих двух липидов полностью перед смешиванием с белками.
   2. Для растворения ДОТАП или собаки полностью обработанной ультразвуком везикулы смешивали с 10 мМ DM и 40 мМ н-октил-β-D-глюкозид (β-OG). Липид / детергент смесь инкубировали в течение ночи (> 15 ч)при комнатной температуре, и полученную смесь не должно быть никаких мелких частиц или капель. Но вместо этого он достаточно ясно. Неспособность достичь полного равновесия на этой стадии, будет приводить к образованию значительной части многослойные везикулы.
   3. Смешать KvAP белка с моющим средством растворимые ДОТАП или собаки в белке: липид, который меньше или равна 1:10. Белок / детергент / липид смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2-3 часов с донышка на конец вращения.

2.2. После удаления моющих средств для формирования протеолипосом

1. Диализ --- медленного удаления моющих средств, таких как СД и β-OG, которые имеют относительно высокую критическую концентрацию мицелл (CMC ≥ 1,0 мМ)
   Подготовка 2-литра буфера для диализа (табл. 3) для каждой смеси 1,0 мл.
   Вырежьте подходящую длину диализа (MWCO = 10K; 0,70 см в ширину), и промойте его дистиллированной водой. Важно, чтобы проверить и убедитьсяУбедитесь, что нет утечки в трубопроводе. Для чувствительных образцов труб может быть сначала обрабатывали буфером 10 мМ Трис-HCl, pH 8,0 и 2,0 мМ ЭДТА, а затем очищать в кипящей воде в течение 3-5 мин. Трубку затем фиксировать на одном конце и промывают буфера для диализа.
   Загрузите белка липидов моющего смесь в диализной трубке. Зажим обоих концах трубки с минимальным свободного места над раствором. Поместите загруженный трубы в буфера для диализа, а также использовать перемешивание пластине таким образом, что трубка вращается медленно в растворе. Измените буфера для диализа каждые 8 ​​часов. После первой буфер, раствор должен мутнеет, если белок-липид моющего смесь была совершенно ясно. Если диализ слишком быстро, может быть твердый белый осадок на дне диализной трубке. Рекомендуется, чтобы во время буфер изменение трубки следует протереть и инвертированный несколько раз. После пяти изменений буфера для диализа, пузырьки обычно готовы.
   Мы проверяем остаточное количество моющих средств, стреляя пузырьки на липидный бислой. Если есть еще значительное количество моющих средств влево, двухслойных становится сломаны почти мгновенно. Кроме того, можно измерить остаточного моющего средства с помощью колориметрического метода или измерения поверхностного натяжения пузырька подвески.
2. Использование полистирольные шарики, чтобы помочь удалить моющие средства, которые имеют низкую CMC
   Во многих случаях мы должны использовать низкий CMC моющие средства, такие как DDM (CMC ~ 0,17 мМ в воде). Бисер с крошечными порами гидрофобных используются для удаления этих моющих средств ^14.
   1. Приготовление шариков. Вес из 0,5 г сухого бисером и положить их в 50 мл трубки Corning, добавьте 20 мл метанола, разрушать ультразвуком раствор в ванну ультразвуковой в течение 5 мин, чтобы удалить пузырьки, спин вниз бус на 5000 оборотов в минуту в течение 5 мин, а затем декантируйте наиболее метанола. Повторите промывку этанолом и MilliQ воды. Промытые гранулы хранятся в 20%-ном этаноле при 4 ° С, а такжедолжны быть изменены, чтобы моющее средство без буфера перед использованием.
   2. Оценка количества моющих средств в белке / липид / детергент смеси, подлежащей лечению, и рассчитать количество шариков, необходимое для удаления моющих средств. Для DDM и DM, связывающую способность составляет около 100 мг шарики для моющих средств 10 мг. Влажный шарики без избытка воды, взвешивают и добавляют непосредственно в белковой смеси. По крайней мере, 15-20 минут требуется для бисера, чтобы быть в полной мере эффективными и снижение концентрации моющего средства достигает стабильного уровня ^14-16. Для удаления 8,7 мг DDM (додецил-мальтозид) в 1,0 мл раствора, что эквивалентно ~ 18 мМ, в общей сложности 87 мг полистирола, например Bio-Beads SM2, используется в пять равных фракций. Смешать белок / липид / детергент смеси с каждой из фракций в течение 20-30 мин с постоянным вверх-конца вращение при комнатной температуре спин вниз шарики, передача супернатант в следующей фракции гранул и повторить до конца.
      Когда моющего средства КонцAtion достигает CMC, мы намеренно продлить период времени, за который до одного часа, так что небольшое количество моющих средств в растворе будет способствовать слиянию небольшие пузырьки в больших.
   3. Чтобы удалить следовые количества моющих средств после последней стадии, добавляют 35 мг Bio-Rad SM2 бусы и инкубировать с пузырьками в течение 4 час.
      Когда процедура удаления детергента, описанные выше, должны применяться к новому белку, как правило, целесообразно начинать с белком / липид отношение (вес / вес) от ~ 1:10. Липид / детергент смесь должна быть тщательно подготовлена ​​таким образом, что достаточно моющих средств добавляются, чтобы полностью растворить липиды (Фиг.2А). Важно, чтобы инкубировать липидов моющего смесь в течение более 2 ч при комнатной температуре (1-2 мМ DTT) при постоянном встряхивании (400 оборотов в минуту) или вверх-конца вращения. Когда белок смешивают с липиды, белок / липид / детергент смесь следует инкубировали достаточно долго (в течение ночи, если белок является Stablд) на обоих комнатной температуре или в холодном помещении так, что распределение моющих средств и липиды между белком содержащих мицеллы и не содержащей белков мицелл относительно равномерным. Кроме того, если быстрого удаления моющих средств с помощью Biobeads используется, важно, чтобы узнать, моюще-связывающую способность шариков. Медленное удаления моющих средств вероятно гарантирует, что белки будут иметь достаточно липидов для поддержания их целостности и стать вставлен в относительно значительную пузырьков.

2.3. Хранение proteoliposome и контроль качества

1. Как только пузырьки готовы, подготовить их в 50 мкл аликвоты и заморозить флэш-аликвоты прямого погружения в жидкий азот. Замороженных везикулы затем сохраняется в -80 ° C морозильник. Для биохимических анализов, мы не используем, потому что замороженные пузырьки цикла замораживания-размораживания иногда был найден ввести артефакты в нашем Cys-специфическая реакция. Для электрических записис, мы используем только пузырьки, которые хранятся в -80 ° С в течение менее 6 месяцев.
2. Флотационные везикул в градиенте плотности (фиг. 2В)
   1. Загрузите 50 мкл везикул подвески в верхней части слоев градиенте сахарозы содержащего 0,3 мл каждого из 10, 35 и 55% сахарозы, сделанные в 10 мМ HEPES и вращаются на 200000 г в течение 4 ч при 4 ° С. Ускорения и замедления медленно, чтобы избежать разрушения поверхности раздела между слоями.
   2. Собрать 100 мкл фракции из сверху вниз, затем запустить их невосстанавливающем SDS-PAGE (рис. 2В). KvAP окрашивается хорошо с синим Coomassie так, что полоса 0,5-1,0 микрограмм белка четко виден. Белок KvAP должны быть найдены на границе раздела между 10 и 35% сахарозы. Нет тяжелых агрегатов белков не видно в диапазоне высоких плотностей, указывая, что почти все белки в мембранах.
3. Проверка правильной конформации канала KvAP в пузырьки.
   Наши предыдущие данных установлено, что одного мутанта цистеина (L125C/C247S) KvAP, когда должным образом интегрированы в бислои, полностью похоронили в мембранах, и не могут быть доступны цистеин-специфических реагентов ^8. Восстановление процедуры были протестированы с помощью этого мутанта канала и проверяются Cys-специфическим реагентом, МТС-PEG5000. Модификации в L125C с 1,0 мкМ реагента MTS при комнатной температуре вводит 5 кДа сдвиг KvAP группу в невосстанавливающих SDS-PAGE гель. Успешная реализация наших процедур восстановления должно привести к не обнаруживается реакция L125C мутант каналов в мембране фосфолипидов, предлагая почти полное введение всех каналов в бислои. В качестве положительного контроля реакции 5,0 мМ DM вводится, чтобы сделать почти все L125C остатков в мутантных каналов доступны для реагента MTS.
   Кроме того, пор-связывающий токсин, такой как chrybdotoxin, может быть использована для подсчета тетрамерная каналов. На основе антител, как связываниесказать (см. вставку 2, где Fv получают в виде конформационно-специфического лиганда для KvAP), может быть использован для количественного определения доступных сайтов связывания в восстановленном пузырьков. Эти анализы связывания затем можно сравнить с количественным анализом измерения общего белка для того, чтобы выяснить, какая доля восстановленных каналов тетрамерами и какая доля белка имеет датчик напряжения весла (S3/S4 напряжения датчика) правильно сложены.
   Для других белков, который должен быть восстановлен, целесообразно ввести количественный метод оценить, что фракция восстановленного белка правильно сложены. Тщательное функциональное обследование, таким образом, необходимым условием для развития хорошего контроля качества для успешного восстановления.

3. Применение восстановленного канала содержащей везикулы

3.1. Функциональное исследование ионного канала деятельность в черном липидные мембраны.

Подготовка Needed материалов.

1. Липидный препарат
   1. Очистите стеклянную пробирку, янтарь емкость с тефлоновой поверхностью винтовой крышкой и набор стеклянных шприцах хлороформом. Высушите янтарный флакон в токе аргона.
   2. Передача 0,75 мг папы и 0,25 мг POPG в хлороформе в янтарный флакон и выпаривают хлороформ аргоном.
   3. Вымойте сушеные липидов с 0,20 мл пентана и полностью высохнуть для удаления остаточного хлороформа. Наконец растворить липиды в 50 мл декана. Липидов в декан (20 мг / мл), будет использоваться для окраски липидный бислой через 150-250 микрон отверстие (фиг. 3В), просверленные в разбавленной часть на одной стороне экспериментальных чашки двойной слой (фиг. 3А).
2. Приготовление раствора
   1. Внутриклеточный раствор (транс): 10 мМ HEPES / KOH, рН 7,4, 15 мМ KCl
   2. Внеклеточный раствор (цис): 10 мМ HEPES / KOH, рН 7,4, 150 мМ KCl
   3. Солевой мостик: Bend стеклянных капилляровв П-образные мосты, и наполнить их 1,0% расплавленный агар растворяется в внеклеточной решение.
      Осмотического градиента устанавливается между транс-и цис решения было установлено, что основной движущей силой для слияние пузырьков на липидный бислой ^17. Для отрицательно заряженные липиды, 15 мМ CaCl ₂ или положительно заряженный поли-аргинин пептидов оказались способны индуцировать слияние событий. Фузогенный липиды, такие как ДОТАП и собаки, и т.д., могут быть введены в липидные везикулы, так что вероятность слияния событий гораздо выше.

Электрические записей с KvAP каналов в липидных бислоя

1. Предварительно краски круглое отверстие (диаметром около 0,25 мм), который при бурении на цилиндрической поверхности двухслойной чашки (фигура 3В). Липиды передаются с капиллярной пестиком, который сделан в лаборатории. Круглая голова капилляра пестиком полируется и не царапает поверхность чашки. Thэлектронной небольшое количество липидов осуществляется капиллярным пестиком распространяется вокруг отверстия в бислое чашку и сушат на воздухе.
2. Подождите 1-2 минуты, так что декан испарится полностью. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать липидов решение от попадания в отверстия.
3. Вставьте чашу в записи камеры, и положить в солевых мостиков и подсоединения электродов к двум сторонам записи чашки (Фиг.4А). Добавить цис-и транс-решением двух сторонах отверстия. Осмотического градиента, созданные для облегчения слияния пузырьков в липидный бислой.
4. Регулировка потенциал смещения между двумя сторонами чашки до ~ 0 (обычно <2 мВ). С помощью капиллярного пестиком для передачи небольшого количества смеси липидов в декане, а не краски липидов через отверстие, пока двухслойной формы мембраны. Формирование двухслойной обнаружен путем записи емкостных токов во время доставки рампы импульса.
5. Подожди, пока мембранаутончается и становится относительно стабильной. Мы не ждать, пока нет более изменения слизистой оболочки емкости в течение 3-5 мин.
   Общее мнение о плоской двухслойной формируется через большое отверстие в том, что очень средней части мембраны близка к быть ~ 4,0 нм как обычный двухслойных и мембраны становятся толще, когда он получает близко к краю отверстия, где есть кольцевое пространство вокруг и большинство декан растворитель ^{18, 19.} Это неизбежно, что существует остаточный декан оставили в центральной части бислой мембраны. Прошлое оценки объема н-декана в сравнении с ПК был 0.35-0.45 после прореживания бислоя ^{18, 20-22.} EM рассмотрении разбавленной двухслойной показали, что существуют линзы декан зажатой между двумя листовки двухслойной ^22. Эти данные свидетельствуют о том, что мембранные белки вставлен в липидный бислой мембраны сосуществовать с крошечные острова (до 50 нм в диаметре) в декане. Остаточная декана ян двухслойной также уменьшает электрическую мощность постоянного до 0,4-0,5 мкФ / см ^2, которые могут быть использованы для получения грубой оценки размера разбавленной двухслойной на основе измеренной емкости. Бислой 100 пФ емкости происходит от круглой мембраны бислой ~ 180 мкм в диаметре.
   Для KvAP, остаточная декан не ухудшить ее потенциал-зависимых Память, хотя канал функция не была предметом тщательного рассмотрения в растворителей двухслойной. То же самое оказалось справедливо и для NaChBac каналов и каналов Kv1.2 вставляется в BLMS ^23. До сих пор неясно, является ли значительным сдвигом влево кривой Г.В. измеряется от Kv1.2 каналов в декан-липидный бислой относительно каналов в ооциты не имеет ничего общего с остаточной декана ^23. В зависимости от липиды, используемые при образовании бислоев, количество остаточного декана в бислое может изменяться. Например, сообщалось, что формирование плоских membr липидовAnes из МГДГ (моно-галактозил-диацилглицеролом) требует декан, возможно, из-за щели между конической МГДГ наполняется декан молекул. Если остаточная декана оказывает воздействие на белки изучаться чисто эмпирических и экспериментальных тестов необходимо сказать, является ли эффект будет значительным или нет.
6. После того, как мембрана становится устойчивой, стрелять 0,5-1,0 мкл содержащий канал пузырьки путем установки тонкой части P2-пипетки непосредственно над отверстием. Пузырьки падают через отверстие в дне чашки.
   Во время этого процесса, множественные пузырьки привязываться к мембране через отверстие. При наличии достаточного времени некоторые слиты в двухслойной части так, что небольшое число каналов KvAP правильно вставлены в плоскую двухслойную в центральной части мембраны. Оба осмотического градиента и электростатического взаимодействия играют важную роль в слиянии пузырьков в липидные бислои ^{17, 24.}
7. Чтобы проверитьKvAP каналов в двухслойных, короткого импульса 80 мВ поступает от удерживающего потенциала -80 мВ. Благодаря быстрой инактивации и медленное восстановление от инактивации, длинный интервал (~ 120 сек для каналов в PE / PG мембран) дается между двумя импульсами. Типичный текущей записи из каналов в Pope / POPG мембраны показали на рисунке 3C. Если ток небольшой, снимать больше пузырьков. Как только текущий выглядит хорошо в размере, сбалансировать концентрации ионов в растворе по обе стороны мембраны. Каналов готовы к электрофизиологических экспериментов.

3.2. Скрининг на конформацию-специфические лиганды против каналов в пузырьках

1. Введение фаговых дисплеев библиотеки.
   Фаговых дисплеев 20-мерного пептида библиотека присутствует на N-конце пяти копий белков PIII на одном конце нитевидного бактериофага FD-тет ^25. Библиотека представляет ок. 1 х 10 ⁸ отличаютсяЛОР типов случайных 20-мерных пептидных последовательностей, и была любезно предоставлена ​​нам Kathlynn лаборатории доктора Брауна в Техасском медицинском центре ^26. Фаговой инфекции в E. палочки K91 делает бактерий, устойчивых к 12 мкг / мл тетрациклина.
   Подробный порядок бактериальной культуры, усиления и титрование фагов и последовательности фага колонии была описана McGuire и др.. ²⁶ мы дадим краткое описание основных операций в следующем разделе. Читатели могут найти более подробную информацию в бумагу McGuire. Мы будем сосредоточиться на выделение специфических клонов, которые связывают плотно к ионных каналов восстанавливают в везикулы (Фиг.4А).
   Основная идея нашего экрана в том, что фаги связан с восстановленным каналам специально может быть снесены с пузырьками. Связанный фаг может быть усилен и испытаны против каналы в липидную мембрану. Наше исследованиеконформационных изменений KvAP датчиков напряжения в различные липидные мембраны ⁸ показано, что можно поддерживать напряжение датчика в режиме «активированном» или «покоя» состояния путем переключения липиды от обычных фосфолипидов к тем, которые не содержат фосфатов в регионах головную группу (DOTAP и собак в наших экспериментах). Эти два липидов определенной конформации используются в нашей скрининга конформационно-специфических лигандов. Фаговой библиотеки сначала будет насыщен каналов в фосфолипидных везикул (негативный отбор) перед тем, выбранных для плотного связующих каналов в ДОТАП и собак мембран (позитивной селекции).
2. Основные процедуры за фага выбор
   Рост K91 бактерий в LB-среда: время удвоения бактерий составляет около 20 минут при температуре 37 ° С при 200 об встряхивании.
   Усиление библиотеки: Смешать фага раствора с бактериями в OD0.4 K91. После 15 мин инкубации при 37° C, смеси равномерно распределены на -9,5 х 9,5 дюйма ² агаром, содержащим 12 мкг / мл тетрациклина, использование больших пластин предотвращает доминирование культуры бактерий, которые имеют более высокую скорость роста. После разнообразие библиотеки меньше, 10-см чашки Петри используются для выбора и мелких усиления.
   Крупномасштабные усиление индивидуальных клонов: прививку небольшую аликвоту фагов (~ 100 млн.) в 250 мл БЛ плюс 5 мМ MgSO4 _и 12 мкг / мл тетрациклина, расти в течение ночи при 37 ° С. Собирают клетки 6000 оборотов в минуту спин течение 10 мин. Собирают супернатант и добавить в него 0,2 объем / объем буфера осадков (2,5 М NaCl, 20% ПЭГ8000). После инкубации на льду в течение 1,0 ч, центрифугируют раствор при 17000 х г в течение 30 минут для осаждения всех фагов. Удалить все супернатанта, добавляют 1,0 мл PBS, инкубировали на льду в течение 30 мин, осторожно ресуспендируют осадок (без встряхивания). Передача подвески в чистую пробирку, и центрифуге при 14,000 оборотов в минуту в течение 2 мин. Передача супернатант в другую пробирку и инкубировать в 65 ° С водяной бане в течение 15 мин, чтобы убить всех бактерий. Центрифуга трубки течение 2 мин при 13000 оборотов в минуту. Отменить гранул, аликвоты и хранят фага раствор при -80 ° С.
3. Панорамирование фаги против KvAP каналов в липидных везикул.
   1. Пептид-отображения фаги должны быть усилен и титруют до наших экспериментах, так что число фагов на единицу объема, как известно. KvAP был преобразован в POPE / POPG (3:1) плюс 0,50% Биотин-DOPE пузырьки в качестве отрицательного контроля, и в собак: биотин-DOPE (199:1; же самое было сделано для ДОТАП пузырьки) используется как выбор цели. Конечная концентрация KvAP в пузырьках составляет 0,50 мг / мл, и липиды 5,0 мг / мл. Панорамирование буфер содержал 500 мМ KCl, 100 мМ HEPES / KOH рН 7,4 и 0,10 мг / мл БСА.
      Для первого запуска, ~ ¹⁰ 10 фагов (100 экземпляров для каждого типа) разбавляют до 0,050 мл LB среде. Для последующих шагов панорамирование, улArting фага была скорректирована быть в пределах 10 ⁶ -10 ^8.
   2. Негативная селекция:
      Инкубируйте разбавленные фагов в 50 мкл LB с 100 мкл NeutrAvidin агарозных гранулах (способный связывать 1-2 мг биотинилированных BSA на мл смолы; Pierce) в 1,0 мл буфера панорамирование. Через 10 мин инкубации отделить шарики, крутя их при 100 мкг в течение 1,0 мин. Повторите этот шаг дважды, чтобы удалить все фаги, которые связываются непосредственно с бисером.
      Смешать левой над фагов из предыдущего шага с 50 мкл пустые пузырьки (POPE / POPG плюс 0,5% биотин-DOPE), не содержащие белков. Добавить 100 мкл NeutrAvidin бусины, которые были вымыты с функцией панорамирования буфера в фаг-пузырьком смеси. После поворота смеси при комнатной температуре в течение 5 мин, удаление шариков 100 мкг в спину в течение 30 сек. Этот этап повторяется для пустых пузырьков собак: биотин-DOPE (199:1), а также для KvAP каналов в POPE / POPG везикулы (0,5% биотин-DOPE). Супернатант после этих процедур содернс полностью очищена фагов. После первых двух циклов экрана, preclearance может совершаться лишь на KvAP в Pope / POPG пузырьки.
   3. Положительный выбор
      Инкубируйте полностью очищена фагов с KvAP каналов в собак: биотин-DOPE (199:1) везикулы (то же самое для пузырьков DOTAP) в присутствии 100 мкл шариков NeutrAvidin при комнатной температуре в течение 10 мин. Доведите объем смеси до 15 мл с использованием панорамирования буфер перед центрифугированием при 100 х г в течение 10 мин. Собирайте шарики, и мыть их в три раза с 45 мл панорамирование буфера.
   4. Ресуспендируют бисером в 500 мкл среды LB, содержащей 5,0 мкг / мл биотин, и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение двух часов для того, чтобы освободить некоторые из связанных фагов с NeutrAvidin, которая имеет меньшее сродство, чем нативный биотина. Отдельные гранулы по 100 мкг в спину в течение одной минуты. Сбор супернатант и бусы на две различные трубы для титрование.
   5. Для амплификации отобранных фагов, мIX 200 мкл супернатанта или ресуспендировали шариков в последнем шаге 500 мкл бактериальной культуры K91 (OD 600 ~ 0,4-0,6, культурный ~ 4 ч перед использованием). После инкубации при 37 ° С в течение 15 мин, пластина 50 мкл каждого тетрациклина на пластинах в течение ночи культуры.
      В течение первых двух циклов экрана (рис. 4А), собрать все 500 мкл супернатанта и бусы из последнего шага, смешайте их с 5 мл культуры бактерий, а их в пластины 9,5 дюйма квадратными пластинами для того, чтобы восстановить и усилить все колонии фага . Этот шаг важен для восстановления те фаги, которые делают бактерии растут медленнее, чем другие.
   6. Колонии из чашек усиливаются и титруют до начала следующего цикла панорамирования и отбора (см. McGuire и соавт., ^26).
   7. Изучить деятельность положительно отобранных фагов на каналах.
      Через 10-12 циклов селекции, проверить общее усиливается фагов на KvAP каналов в липидных БелаяYers сделал папы / POPG. Если есть значительная доля положительных клонов, отобранных фагов в 100-500 нМ должны блокировать значительную часть каналов в двухслойных (рисунок 4B), поскольку мы против выбора каналов стабилизировалась в состоянии покоя. Положительные данные свидетельствуют о том, что есть клоны, которые покажут сильную привязку к каналам в состоянии покоя. После 16 циклов селекции, выбрать 50 положительных колоний для одной колонии секвенирования. Идентифицированный доминирующих клонов фага, выбирают из сравнения последовательностей, и усиливаются и протестированы каналов в бислоев. Как только положительных клонов подтверждают, синтезировать пептиды несут сильный положительных клонов и проверить их на каналы, а подтвердить свою конформацию конкретной деятельности.

3.3. Кристаллизация KvAP каналов в мембранах для определения структуры ^27-29

1. Для стабилизации конформацииканал, конформации конкретного связующего канала, 33H1 Fv белка, используется для формирования KvAP / Fv комплекса. Подготовка белка Fv, подробно изложены в коробки 2. Очищают комплекса в колонку Superdex 200. Комплекс элюирует на уровне около 11,4 мл в нашей системе.
2. Для начального экрана, смешайте с белком или DMPC POPC, который полностью растворяют в DM или β-OG. Белок / липид / детергент смесь перемешивают в течение более 15 часов, чтобы достичь термодинамического равновесия в распределении трех компонентов из смешанных мицелл. Обычно мы сначала проверить три различных липид / белок соотношения (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) и трех различных уровней рН (6,0, 7,0 и 8,0). Диализ буфер содержит 20 мМ K-фосфатный буфер, 100 мМ KCl, 3,0 мМ и NaN 3. Буфера для диализа меняется каждые 2-3 дня. Небольшую аликвоту кристаллы вынимают каждые 2-3 дней, чтобы исследовать образование пузырьков и возможного появления кристаллической решетке.
   Таблоид списокиз LPR от рН используется для определения поведения белка в двух различных типов липидов. Мы хотим получить относительно крупными (более 150 нм) или мембранные везикулы простыни, когда диализ образцы исследуют отрицательными EM-пятно. Небольшое закономерность в мембранах предлагает хитом и будет использоваться для руководства дальнейшей оптимизации.
   Отрицательные пятна EM: медные сетки покрытой углеродных пленок (~ 3-5 нм) имеют свечение разряженного воздуха, чтобы сделать углеродной поверхности гидрофильные. Небольшого объема (2-3 мкл) суспензии кристаллов загружается на поверхности углерода, и инкубировали в течение 0,5-1,0 мин. Тех решетки со стороны с оторванным краем кусок Whatman # 4 фильтровальную бумагу. Флип сетки и инкубируйте в течение ~ 15 секунд в верхней части капли 150 мкл окрашивание раствора (2,0% РТА / KOH, рН 8,0, в воде плюс 0,5% трегалозы, или 6,0% молибдата аммония / KOH, 6,5-pH6.3 , в воде плюс 0,5-1,0% трегалозой). Тех как можно больше раствора от тОн сетки поверхности и позволяют сетке высохнуть, прежде чем вставить его в ПЭМ на экспертизу. Изображения пузырьки взяты под низкие дозы состоянии, чтобы избежать повреждения любого кристаллического упаковки электронами.
3. На экране затем расширяется для изучения меньшие шаги из LPR, чтобы достичь правильного LPR. Если белки являются подходящими для кристаллизации, небольшой решетки белков в мембранах может стать видимым. Вокруг этих начальных условиях дальнейшей оптимизации кристаллизации путем изменения соль типов и концентраций, температура, скорость и методы моющее средство удаления, двухвалентных катионов, моющие средства, используемые для получения белков, осадителей, липиды и т.д. состав
   Оптимизированная 2D кристаллы KvAPΔ36/Fv комплекса вырасти в больших листах, которые варьируются от нескольких микрон до 20-30 мкм (рис. 5а). Под cryoEM условиях, кристаллы демонстрируют явные квадратной решетки с очевидной симметрией четвертого порядка, как ожидалось от четырех-кратно симметричных чанканалах (5В рис и С).

Результаты

Общий поток экспериментов для очистки KvAP канал в биохимические однородность описано на фиг.1А. Типичные образцы во время экспрессии и очистки белка показаны в ДСН-ПААГ-гель в фиг.1В. Белка после очистки IMAC является относительно чистым. Выход канала KvAP составляет приме?...

Обсуждение

Восстановление KvAP каналов в различных мембран был использован в нескольких исследованиях ^8-10. Следуя идее обеспечения распределение липидов между моющего средства / смешанные мицеллы липидов и белков / моющее средство / липидного смешанные мицеллы, мы способны достичь почти полн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	RPI Corp.	T60060
Yeast Extract	RPI Corp.	Y20020
NaCl	Fisher	S271-3
Tris Base	RPI Corp.	T60040
Potassium Chloride	Fisher	BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside	Affymetrix	D322S	Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside	Affymetrix	O311	Ana-grade
Aprotinin	RPI Corp.	A20550-0.05
Leupeptin	RPI Corp.	L22035-0.025
Pepstatin A	RPI Corp.	P30100-0.025
PMSF	SIGMA	P7626
Dnase I	Roche	13407000
Bio-Bead SM-2	Bio-Rad	152-3920
HEPES	RPI Corp.	H75030
POPE	Avanti Polar Lipids	850757C
POPG	Avanti Polar Lipids	840457C
DOGS	Avanti Polar Lipids	870314C
DMPC	Avanti Polar Lipids	850345C
Biotin-DOPE	Avanti Polar Lipids	870282C
DOTAP	Avanti Polar Lipids	890890C
NeutrAvidin agarose beads	Piercenet	29200
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories, Inc	132-570
Pentane	Fisher	R399-1
Decane	TCI America	D0011
MTS-PEG5000	Toronto Research Cemicals	M266501