Reconstitution d'un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

Résumé

Procédures pour les reconstitution complète d'un canal de de potassium tension-à déchenchements périodiques prototype dans des membranes de lipides sont décrits. Les canaux reconstitués sont adaptés à des dosages biochimiques, les enregistrements électriques, le dépistage du ligand et des études cristallographiques d'électrons. Ces méthodes peuvent avoir des applications générales aux études structurales et fonctionnelles d'autres protéines membranaires.

Résumé

Pour étudier l'interaction protéine-lipides de manière réductionniste, il est nécessaire d'intégrer les protéines membranaires en membranes de composition lipidique bien défini. Nous étudions les effets de déclenchement de lipides à charge dans un canal potassique voltage-gated prototype (Kv), et nous avons travaillé sur des procédures détaillées pour reconstituer les canaux dans différents systèmes membranaires. Nos procédures de reconstitution prennent considération à la fois la fusion détergent induite par des vésicules et la fusion de protéine / détergent micelles avec le lipide / détergent micelles mixtes ainsi que l'importance de parvenir à une distribution d'équilibre des lipides chez la protéine / détergent / lipides et le détergent / lipides micelles mixtes. Nos données suggèrent que l'insertion des canaux dans les vésicules lipidiques est relativement aléatoire dans les orientations et l'efficacité de la reconstitution est si élevé qu'aucun des agrégats de protéines détectables ont été observés dans des expériences de fractionnement. Nous avons utilisé le reconstituerd canaux pour déterminer les états conformationnels des canaux dans différents lipides, enregistrer les activités électriques d'un petit nombre de canaux incorporés dans des bicouches lipidiques planes, écran de ligands conformation spécifiques à partir d'un-s'affiche phage bibliothèque de peptides, et de soutenir la croissance des cristaux 2D des canaux dans les membranes. Les procédures de reconstitution décrites ici peuvent être adaptées à l'étude d'autres protéines membranaires dans des bicouches lipidiques, en particulier pour l'étude des effets des lipides sur les canaux ioniques voltage-dépendants eucaryotes.

Introduction

Cellules matériaux d'échange et d'information avec leur environnement par le biais des fonctions des protéines membranaires spécifiques ^1. Les protéines membranaires en membranes cellulaires fonctionnent comme des pompes, des canaux, des récepteurs, des enzymes intramembranaires, linkers et les partisans de structure à travers les membranes. Les mutations qui affectent les protéines membranaires ont été liés à de nombreuses maladies humaines. En fait, de nombreuses protéines membranaires ont été les cibles de médicaments primaires parce qu'ils sont importants et facilement accessible dans les membranes cellulaires. Il est donc très important de comprendre la structure et la fonction des différentes protéines membranaires en membranes, et permettre de concevoir de nouvelles méthodes pour atténuer les effets néfastes des protéines mutantes dans les maladies humaines.

Les lipides entourent toutes les protéines membranaires intégrées dans des bicouches ^{2, 3.} Dans les membranes eucaryotes, les différents types de lipides sont connus pour être organisés en microdomaines ^{4, 5.}Beaucoup de protéines membranaires ont été présentés à répartir entre ces microdomaines ainsi que la phase fluide volumineux de membranes ^{3, 6.} Le mécanisme sous-jacent à l'organisation des micro-domaines et la fourniture de protéines membranaires en eux et l'importance physiologique de ces distributions sont clairement importants mais restent mal compris. Une difficulté majeure technique à étudier les effets des lipides sur les protéines membranaires est la reconstitution fiable de biochimiquement purifié les protéines membranaires en membranes de composition lipidique bien contrôlée de sorte que presque toutes les protéines reconstituées sont de ⁷ fonctionnel. Au cours des dernières années, nous avons développé des méthodes pour reconstituer le canal potassique voltage-gated prototype de A. pernix (KvAP) dans différents systèmes membranaires pour les études structurales et fonctionnelles ^8-10. Les données des autres et ensemble, nous ont montré que les lipides sont probablement un facteur déterminant dans les changements conformationnels de la détection de tensiondomaines d'un canal ionique et voltage-dépendants peuvent former des structures de certains de ces canaux ^11. Dans le prochain, nous allons fournir une description détaillée de nos méthodes et offrira des conseils techniques essentiels qui vont probablement assurer le succès de la reproduction de nos résultats ainsi que l'extension de nos méthodes pour les études sur d'autres protéines membranaires.

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Protocole

1. Expression et purification de KvAP Channel (Figure 1)

1. Préparation travail - Jour 0
   1. Rincer les flacons en verre pour la culture bactérienne avec de l'eau déminéralisée (diH ₂ O) et MiIIiQ H ₂ O (MQH ₂ O) pour éliminer les traces de détergent à vaisselle général.
   2. Autoclave 1000 ml de milieu LB à 2,8 L Erlenmeyer (total de deux litres culture comme un exemple ici). Faible dureté de l'eau a été jugée importante pour la culture réussie des bactéries transformées.
   3. Autoclave de 100 de milieu LB ml dans des flacons de 500 ml
   4. Transformer 60 pl de cellules compétentes XL1-Blue avec 200 ng du pQE60 plasmide contenant le gène de la KvAP avec un site de coupure de la thrombine et un _His6 étiquette à son extrémité C-terminale, la plaque de la bactérie sur deux plaques de gélose LB contenant 100 pg / ml d'ampicilline, et les incuber pendant 14-16 heures dans un 37 ° C incubateur.
2. Expression de KvAP - Jour 1
   1. Vérifier l'applicationearance des colonies bactériennes sur les plaques après une nuit d'incubation. Les colonies sont habituellement seulement environ 0,2-0,5 mm de diamètre, et il y avait beaucoup d'entre eux. Nous ne voulons pas les plaques qui abritent de grandes colonies entourées d'un grand nombre de colonies satellites.
   2. Ajouter 5,0 ml de milieu LB à chaque plaque LB-agar incubé pendant une nuit et débris au large des colonies. Transférer la suspension de bactéries dans un milieu LB 100 ml autoclave dans un flacon de 500 ml. Ajouter l'ampicilline à une concentration finale de 100 pg / ml, incuber la petite culture pour ~ 1 heure à 37 ° C ou jusqu'à DO600 atteint 0,60.
   3. Dans le même temps, placez deux flacons avec 1,0 L milieu dans un 37 ° C incubateur agitateur à réchauffer le support, et de préparer 20 ml de _BaCl2 (1,0 M; 10 concentration finale mM dans chaque L culture 1.0), 2,0 ml 0,4 M IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) et 2,0 ml de 100 mg / ml d'ampicilline actions dans l'eau.
   4. Une fois que la petite culture est prête, ajouter 10 ml de _BaCl2, 1,0 ml de ampicillin actions, et 50 ml de petite culture de l'étape 1.2.2 pour les milieux LB préchauffées. DO600 devrait être d'environ 0,05. Surveillez les précipitations possible en raison de la dureté élevée de l'eau et les contre-ions dans les milieux LB. Ba ^{2 +} est connu pour se lier au domaine de pores du canal du potassium et bloque le courant ionique, et diminue donc la toxicité du niveau élevé d'expression des canaux vers les bactéries.
   5. Prenez DO600 toutes les heures jusqu'à ce qu'il atteigne 0,70, et toutes les quinze minutes jusqu'à ce qu'il atteigne 0,8 à 0,9. Dans notre set-up, cela prend habituellement environ 5 heures pour atteindre 0,8.
   6. Ajouter 0,40 mM IPTG pour démarrer l'expression induite par la protéine de canal, et incuber la culture pour un autre 4,0 heures à 37 ° C avec 225 rpm trembler.
   7. bactéries sur les récoltes dans des flacons de centrifugation de 1,0 litre par centrifugation à 4000 g, 4.0 ° C pendant 15 min. Décanter le surnageant autant que possible dans un bécher de déchets, ajouter 10 tampon phosphate de Na ml 1,0 M pour précipiter tout Ba ^{2 +,} puis sur Ajouter unepetit volume d'eau de Javel pour tuer les bactéries. Gardez les bactéries récoltées dans les bouteilles de centrifugation enfouis dans la glace dans un 4,0 ° C chambre froide pendant la nuit.
3. Purification des protéines KvAP (Jour 2 et 3, figure 1B)
   1. Reprendre le culot des bactéries dans 15 ml de tampon de lyse IMAC par 1,0 L culture. Ajouter environ 1,0 U DNase I, et trois inhibiteurs de la protéase de leupeptine, aprotinine et pepstatine A à 1,0 pg / ml. Le volume total pour la culture de deux litres était d'environ 35 ml.
   2. Soniquer les bactéries remises en suspension dans un bécher de métal enfoui dans la glace pendant 10 min total de ON-temps. L'appareil à ultrasons à la microsonde a été mis en 5 sec ON / OFF cycle de 10 sec avec une puissance de sortie de 40% en 4,0 ° C chambre froide. Le réglage de la puissance de sortie a été déterminée empiriquement de sorte que la plupart des bactéries sont lysées sans trop de chauffage dans la solution.
   3. Ajouter 0,50 g de n-décyl-β-D-Maltoside (DM; Sol-Grade de Anatrace) sous forme de poudre sèche pour le lysat cellulaire sonique et incuber le mélange pendant 30,5 heures à température ambiante (RT) avec une agitation horizontale constante (~ 100 rpm) afin d'en extraire les protéines de canal autant que possible. Il est important de s'assurer que la poudre de détergent est entièrement dissous sur une période de 30-50 minutes.
   4. Après extraction par détergent, éliminer les débris cellulaires à partir du lysat par centrifugation à 20 000 xg pendant 30 min à température ambiante. En attendant la centrifugation à la fin, préparer une colonne LC His-tag basé (chromatographie en phase liquide à basse pression) comme indiqué dans l'encadré 1.
   5. Charger le surnageant de l'étape 1.3.4 sur le IMAC pré-emballé (i mmobilized m étal un ion ffinity hromatography c) la colonne à un débit de 2.1 ml / min qui est entraînée par une pompe péristaltique. Alternativement, la protéine extraite marquée par His peut être incubé avec la résine IMAC pour discontinu contraignant.
   6. Laver la résine IMAC en exécutant 5 volumes de lit de tampon de lavage IMAC, et 10 volumes de lit de buff de lavage IMACer plus 20 mM imidazole. Un moniteur d'UV en ligne est utilisée pour s'assurer que le linge est propre.
   7. On élue la protéine KvAP en appliquant un tampon d'élution IMAC contenant 300 mM imidazole. La plupart des KvAP lié est élue au sein de 6 ml de tampon d'élution à travers la colonne. Ajouter thrombine (1,0 U par 2-3 mg de protéine) dans les fractions d'élution communs et incuber la protéine du jour au lendemain sur le banc de cliver le tag His _6.
   8. Le lendemain, concentrer la solution de protéines thrombine digéré dans un Centricon (MWCO = 30K) jusqu'à 600 pi pour FPLC d'exclusion stérique (chromatographie liquide rapide des protéines). Lors de la centrifugation, mélanger l'échantillon toutes les cinq minutes pour réduire l'agrégation des protéines. Comme la protéine est concentrée, la concentration locale au niveau du filtre à membrane devient plus élevée, et il est clair parfois un précipité blanc qui, autrement, pourraient obstruer la membrane filtrante. Aussi la forte concentration de protéines (~ 5-10 mg / ml) dans le bas du concentrateur conduit à un frontNish couleur et le mélange est vraiment utile pour minimiser la perte de l'échantillon.
   9. Exécuter le KvAP concentré à travers une colonne Superdex 200 qui est pré-équilibrée avec un tampon d'équilibrage FPLC. En général, le pic de la chaîne de KvAP tétramérique dans élue DM avec un volume de rétention de 12,3 ml. Il existe une petite queue de fuite à environ 13,6 ml, qui a une petite quantité de monomère KvAP. Le vide de la colonne, nous avons utilisé est de 7,0 ml, et le plus souvent de l'échantillon donne lieu à un petit pic dans le vide, qui ne contient que très peu de protéines de KvAP. L'imidazole vient à la fin de l'élution (~ 24 ml). Réunir les fractions contenant tétramères KvAP ensemble et concentrer la solution de protéine à 0,5 ml. Déterminer la concentration de l'échantillon en utilisant un coefficient d'extinction estimé (~ 1.2E-5.0 M ^-1 cm ^-1, qui a été calculé sur la base du nombre de résidus aromatiques) de KvAP à 280 nm [ref ^12; URL: http:// web.expasyorg / protparam /].
      A température ambiante, le KvAP purifiée dans DM est stable pendant au moins une semaine sans perte importante de protéines. À 4 ° C, cela pourrait durer encore plus longtemps. Ne congelez jamais la protéine dans les détergents. Il est recommandé de stocker la protéine en DM à 4 ° C, et la protéine dans β-OG à la température ambiante. Mais nous n'attendons pas normalement, et passer à l'étape de reconstitution immédiatement après les protéines sont prêts.
   10. Doser les échantillons dans un 12% de réduction gel SDS-PAGE.
       Les échantillons de chaque étape décrite ci-dessus ont été préparées en mélangeant les 20 microlitres d'échantillons avec le tampon SDS-échantillon 5x (tableau 3 pour les tampons) supplémenté avec 1,0% de β-ME. Les échantillons n'ont pas été bouillie. Après gels étaient prêts, les échantillons avaient été généralement en SDS-tampon pendant plus de 10 min à température ambiante. Après le gel a été exécuté et coloré au bleu de Coomassie, le KvAP type sauvage apparu comme une seule bande à environ 26 kDa (figure 1B ). L'échantillon a été purifié biochimiquement homogène et au moins 95% pure.

2. Ion Reconstitution de la Manche

2.1. Préparation de liposomes et à la fusion induite par détergent de vésicules

Avant la préparation lipidique, un lavage de 14 ml en verre jetable tube à essai, un tube en verre avec bouchon à vis, et une seringue de 250 ul de verre avec du chloroforme. Verser ~ 10 ml de chloroforme dans le tube à essai.

1. Préparation de palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-éthanolamine (PAPE) et palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-glycérol (POPG) liposomes.
   1. Transfert de 3,75 mg du pape et 1,25 mg de POPG (PAPE: POPG 3:1 ratio de poids) dans le chloroforme dans le tube de verre à bouchon à vis préalablement nettoyé et sécher les lipides sous un flux continu de gaz argon. En l'absence de chloroforme visible est à gauche, sécher le lipide encore sous vide ambiante pendant une heure.
   2. Ajouter 440 ul de faible teneur en sel-tampon (HEPES 10 mM, pH 7,4) Ou d'eau dans le lipide séché et le tube vortex pour hydrater les lipides. La suspension lipidique est blanchâtre et trouble.
   3. Soniquer la suspension de lipides dans un bain sonique glacée jusqu'à ce que la solution de la vésicule devient translucide (OD410 <0,2).
      Typiquement, pour la solution à 10 mg / ml Pape / POPG dans l'eau ou un tampon faible teneur en sel, nous avons opéré le sonicator avec 30 secondes ON et OFF 30 sec (sur la glace) pour un total de 15-20 min. En raison de la chaleur générée lors de traitement par ultrasons, il est conseillé d'ajouter 1,0 mM de DTT dans la solution lipidique afin de minimiser l'oxydation des lipides, et pour refroidir le bain d'eau de l'appareil à ultrasons à 10 ° C ou moins. L'OD410 final est de lipides dépend. Pour certains lipides, il peut être très difficile à atteindre si faible OD. Si cela se produit, nous utilisons habituellement détergents pour solubiliser complètement les lipides et permettre à long incubation pour atteindre une bonne répartition des lipides autour des micelles contenant des protéines (voir plus loin).
      Un bain sonique à haute capacité est importante dans order à atteindre OD410 <0,2. Nous utilisons un système constitué par le Laboratoire Supplies Co., Inc (Modèle # G112SPIG, Hicksville, NY). La clé pour le bon traitement aux ultrasons des vésicules est de s'assurer que le centre de résonance dans le milieu du tube a une forte vibration. La vibration varie avec le volume de l'eau et peut donc être ajustée. En outre, il est empiriquement constaté que l'augmentation de la viscosité de l'eau en ajoutant une petite quantité de glycérol peut améliorer l'efficacité du traitement par ultrasons.
      Sinon, nous avons trouvé que l'utilisation d'un appareil à ultrasons à la microsonde en contact avec la suspension de lipides dans un plastique ou un tube de métal peut produire les mêmes résultats. La microsonde besoin d'être nettoyé et que la pointe est plonger dans la solution de lipide. Parce que les particules lipidiques sont cassés en petits morceaux sur la surface de la microsonde, il est très important de garder refroidi l'échantillon, et ont certains agents réducteurs autour pour empêcher l'oxydation des lipides insaturés.
      Sous cryo-électronique MICRoscopy, la majorité des vésicules unilamellaires soniqués sont de 30-50 nm de diamètre (données non présentées). La courbure des petits VUS est si élevé qu'une petite perturbation est suffisante pour induire la fusion dynamique de ces vésicules dans les plus grands qui sont 80-200 nm de diamètre (voir plus loin).
   4. Ajouter 50 ul de 3,0 M KCl et 10 pi de 0,50 M DM au mélange de sorte que la suspension finale de lipide a 300 mM de KCl et 10 mM DM. Incuber la solution avec rotation horizontale pendant 2 heures à la température ambiante pour former des lipides / détergent de micelles mixtes. Après l'incubation, la suspension doit être un peu turbide binaire (Figure 2A), ce qui est dû à la fusion détergente induit des petites vésicules unilamellaires.
   5. Lorsque la protéine est concentrée à plus de 2,0 mg / ml, ajouter 0,50 mg de protéine KvAP, 50 ul de 3,0 M KCl, 16 ul de 0,50 M DM actions dans l'eau, et 10 mM d'HEPES, pH 7,4 pour le mélange lipide / détergent faire 1 ml de volume final. Le lipide finale: rapport en poids de protéine est de 10:1et la concentration finale de la MS est de 18 mm (figure 2A). Incuber le mélange protéine / lipide / détergent dans le tube de verre avec une rotation horizontale pendant 2 h.
      Le choix de la concentration en détergent est guidé par la fusion des vésicules détergent induite et vésicule solubilisation ^13. Lorsque les vésicules sont formées par sonication forte, leur diamètre moyen est de l'ordre de 30 à 50 nm sous SE. Ces vésicules ont une très faible diffusion à 410 nm. A faible concentration, les détergents sont d'abord introduits dans les vésicules, déstabiliser les vésicules, et induire la fusion des vésicules détergent saturés (OD410 monte; voir Figure 2A). fusion des vésicules conduit à l'augmentation des OD410 nm. Pour 10 mg / ml Pape / POPG vésicules, les OD410 pics à environ 15 mM DM. Lorsque plus de détergents sont introduits, les vésicules commencent à se briser en morceaux et les lipides deviennent partitionné en détergent / lipides des micelles mixtes. Ce dernier processus est accompagné par l'diminuer de OD410 jusqu'à un faible niveau final (<0,1).
      En raison des événements de fusion actives dans la phase ascendante de la densité optique due à la fusion détergent induite par de petites vésicules, il est fort probable que la protéine / détergent micelles seront fusionnés activement avec les vésicules lipidiques détergent saturés. C'est la raison de la sélection de 18 mM de DM au moment de la préparation de la protéine / lipide / mélange de détergents. Si le détergent est concentrée par plus de 4 plis, le montant des besoins DM à être ajustée de sorte que la concentration finale est toujours autour de 18-20 mm. Lorsque le rendement en protéines est très faible, il est difficile d'évaluer combien de détergents concentrés sont dans l'échantillon, nous serions plutôt mélangeons la protéine avec des lipides entièrement solubilisés, et utiliser le mélange entièrement équilibrée pour la reconstitution. Dans nos mains, si on laisse pas assez de temps pour atteindre une bonne répartition de l'équilibre des lipides entre contenant des protéines et des micelles sans protéines, le reconstitutefficacité ion a considérablement diminué. On teste généralement l'efficacité de reconstitution par deux expériences: 1) examiner la co-migration de la protéine avec la fraction de vésicules dans une ultracentrifugation sur gradient de sucrose de densité; 2) extraire les protéines de vésicules reconstituées, et fractionner dans un gel colonne de filtration pour trouver la quantité de protéines (KvAP dans notre cas) reste à tétramérique. Délai minimum d'incubation de la protéine / lipide / détergents est une couple d'heures à la température ambiante ou une nuit à 4 degrés.
      Pour une nouvelle protéine de la membrane qui est stable dans un autre détergent, la première étape consiste à déterminer la propriété de solubilisation des lipides par un tel détergent, similaire à ce qui est montré sur la figure 2A. Ensuite, il est conseillé de commencer avec les extraits de PC, comme le E. coli polaire extrait PC, le PC soja extrait etc, de sorte que si la protéine spécifique a besoin de certains phospholipides pour sa fonction, il peut être déjà inclus dans l'extractionmélange de lipides TED.
2. Préparation de la KvAP en mélange avec un détergent solubilisé dans du 1,2-dioléoyl-3-triméthylammonium-propane (DOTAP) ou le 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-succinate (DOGS) --- un exemple de solubilisation des lipides complet pour la reconstitution
   1. La préparation de lipides est la même que pour le pape / POPG vésicules. Le traitement par ultrasons de lipides hydratés dans de petites vésicules unilamellaires a besoin plus de temps (généralement 45-60 minutes) que pour Pape / POPG lipides (généralement 5-10 min). Les DOGS vésicules peuvent fondre lentement avec l'autre et former de petites gouttelettes huileuses.
      En raison de la difficulté à faire VUS de haute qualité sur DOTAP et chiens de façon reproductible, nous solubiliser généralement ces deux lipides complètement avant de les mélanger avec les protéines.
   2. Pour solubiliser le DOTAP ou DOGS complètement, les vésicules soniquées sont mélangés avec 10 mM de DM et 40 mM de n-octyl-β-D-glucoside (β-OG). Le mélange de lipides / détergent est incubé pendant une nuit (> 15 h)à la température ambiante, et le mélange ne doit pas avoir de petites particules ou des gouttelettes. Mais à la place, il est assez clair. Impossibilité de parvenir à un équilibre complet dans cette étape va conduire à la formation d'une fraction importante de vésicules multilamellaires.
   3. Mélanger la protéine avec le DOTAP KvAP détergents ou solubilisé dans une protéine DOGS: rapport de lipide qui est inférieur ou égal à 01:10. Le mélange protéine / détergent / lipide est laissé à incuber à température ambiante pendant 2 à 3 heures avec une rotation bout à l'autre extrémité.

2.2. Suppression des détergents pour former protéoliposomes

1. Dialyse --- élimination lente des détergents, tels que DM et β-OG, qui ont des concentrations micellaires critiques relativement élevés (CMC ≥ 1,0 mM)
   Préparer un tampon de dialyse à 2 litres (tableau 3) pour chaque mélange de 1,0 ml.
   Découpez une longueur suffisante de tube de dialyse (MWCO = 10K, 0,70 cm de large), et le laver avec de l'eau DI. Il est important de vérifier et des'assurer qu'il n'y a pas de fuite dans le tube. Pour les échantillons sensibles, le tube pourrait être traité d'abord avec un tampon de 10 mM Tris-HCl pH 8,0 et 2,0 mM EDTA, puis être nettoyé à l'eau bouillante pendant 3-5 min. Le tube est ensuite serré à une extrémité, et on le rince avec du tampon de dialyse.
   Chargez le mélange de protéines lipides détergent dans un tube de dialyse. Fixer les deux extrémités du tube avec un minimum d'espace laissé au-dessus de la solution. Mettre le tube chargé dans le tampon de dialyse, et en utilisant une plaque d'agitation afin que le tube tourne lentement en solution. Changer le tampon de dialyse une fois toutes les 8 heures. Après le premier changement de tampon, la solution doit devenir trouble si le mélange de protéines lipides détergent était tout à fait clair. Si la dialyse est trop rapide, il peut y avoir un solide blanc précipite au fond du tube de dialyse. Il est recommandé que, au moment du changement de tampon, le tube doit être frotté et retourné plusieurs fois. Après cinq changements de tampon de dialyse, les vésicules sont généralement prêts.
   Nous vérifions le montant résiduel de détergents en tirant sur les vésicules sur la bicouche lipidique. Quand il ya une quantité encore importante de détergents gauche, la bicouche est cassé presque instantanément. Il est également possible de mesurer le détergent résiduel en utilisant la méthode colorimétrique ou de mesure de la tension superficielle de la suspension de vésicules.
2. L'utilisation de billes de polystyrène pour aider à éliminer les détergents qui ont une faible CMC
   Dans de nombreux cas, nous devons utiliser des détergents CMC faible, comme DDM (CMC ~ 0,17 mM dans l'eau). Perles avec de minuscules pores hydrophobes sont utilisés pour éliminer ces détergents ^14.
   1. Préparation des billes. Poids à 0,5 g de billes sèches et les mettre dans un tube Corning 50 ml, ajouter 20 ml de méthanol, Soniquer la solution dans un bain sonique pendant 5 min pour éliminer les bulles emprisonnées, ralentit les perles à 5000 rpm pendant 5 min, puis décanter plus méthanol. Répétez le lavage avec de l'éthanol et de l'eau MilliQ. Les billes lavées sont stockées dans l'éthanol à 20% à 4 ° C, etdoivent être modifiés dans une mémoire tampon sans détergent avant l'utilisation.
   2. Estimer la quantité de détergents dans le mélange protéine / lipide / détergent à traiter, et de calculer la quantité de perles nécessaires pour éliminer les détergents. Pour DDM et DM, la capacité de liaison est d'environ 100 perles mg pour 10 mg de détergents. Les perles humides sans excès d'eau sont pesés et ajoutés directement au mélange de protéines. Au moins 15-20 minutes est nécessaire pour les perles pour être pleinement efficace et la diminution de la concentration de détergent atteint un niveau stable ^14-16. Pour retirer 8,7 mg de DDM (dodécyl-maltoside) dans 1,0 ml de solution, ce qui équivaut à ~ 18 mm, un total de 87 mg de billes de polystyrène, comme Bio-Beads SM2, est utilisé en cinq fractions égales. Mélanger le mélange protéine / lipide / détergent à chaque fraction de 20 à 30 min avec une rotation bout à l'autre extrémité constante à température ambiante, centrifuger les billes, transférer le surnageant à l'autre fraction de perles, et répéter jusqu'à la fin.
      Lorsque le concentr de détergentation atteint son CMC, nous étendons intentionnellement la période de temps pour cela une heure pour que la petite quantité de détergent dans la solution facilitera la fusion de petites vésicules dans les grands.
   3. Pour supprimer la trace de détergents après la dernière étape, ajouter 35 mg de Bio-Rad SM2 perles et incuber avec les vésicules pendant 4 heures.
      Lorsque les procédures de retrait de détergent décrites ci-dessus doivent être appliquées à une nouvelle protéine, il est généralement conseillé de commencer par le rapport protéines / lipides (poids / poids) d'environ 1:10. Le mélange lipide / détergent doit être soigneusement préparée de telle sorte que suffisamment de détergents sont ajoutés pour solubiliser complètement les lipides (Figure 2A). Il est important d'incuber le mélange de lipides détergent pendant plus de 2 heures à température ambiante (avec 1-2 mM DTT) avec une agitation constante (400 rpm) ou rotation extrémité à l'autre extrémité. Lorsque la protéine est mélangée avec des lipides, le mélange protéine / lipide / détergent doit être incubé suffisamment longtemps (pendant la nuit, si la protéine est Stable) soit à la température ambiante ou dans une chambre froide de sorte que la distribution des détergents et des lipides entre les micelles de protéines contenant des micelles de protéines libres est relativement uniforme. En outre, si rapide élimination des détergents en utilisant BioBeads est utilisé, il est important de savoir la capacité détergent liaison des perles. L'élimination lente de détergents assure probable que les protéines auront suffisamment de lipides pour maintenir leur intégrité et leur devenir inséré dans des vésicules relativement considérables.

2.3. Stockage de l'protéoliposome et le contrôle de qualité

1. Une fois que les vésicules sont prêts, les préparer en 50 aliquotes et flash-congeler les portions en les plongeant directement dans l'azote liquide. Les vésicules congelés sont ensuite stockés dans un congélateur à -80 ° C. Pour les dosages biochimiques, nous n'utilisons pas de vésicules gelés parce que le cycle de gel-dégel parfois été trouvé pour introduire des artefacts dans notre réaction cys-spécifique. Pour l'enregistrement électriques, nous n'utilisons que des vésicules qui sont stockés dans -80 ° C pendant moins de 6 mois.
2. Flottaison des vésicules dans un gradient de densité (figure 2B)
   1. Charge de 50 pi de la suspension de vésicules au-dessus des couches de gradient de saccharose contenant 0,3 ml chacune des 10, 35 et 55% de saccharose réalisés dans HEPES 10 mM et de spin à 200.000 g pendant 4 heures à 4 ° C. Accélérer et décélérer lentement pour éviter l'interruption de l'interface entre les couches.
   2. Collecter des fractions de 100 pi de haut en bas et de les exécuter sur un SDS-PAGE non réductrice (figure 2B). Le KvAP est bien coloré avec le bleu de Coomassie tel qu'une bande de 0,5-1,0 protéines microgramme est clairement visible. La protéine KvAP doit être trouvé à l'interface comprise entre 10 et 35% de saccharose. Aucun lourds agrégats de protéines sont vus à la plage de haute densité, ce qui indique que la plupart des protéines sont dans les membranes.
3. Vérifier la bonne conformation du canal KvAP dans des vésicules.
   Nos données antérieures ont établi qu'un seul mutant cystéine (L125C/C247S) KvAP, lorsqu'il est correctement intégrée dans les bicouches, est entièrement enterré dans les membranes, et ne peut pas être consulté par des réactifs spécifiques ^cystéine-8. Les procédures de reconstitution ont été testés avec ce canal mutant, et vérifiés par un réactif Cys-spécifique, MTS-PEG5000. La modification à L125C avec 1,0 uM MTS réactif à la température ambiante introduit un décalage 5 kDa à la bande de KvAP dans un gel SDS-PAGE non réductrice. Mise en œuvre réussie de nos procédures de reconstitution devrait conduire à aucune réaction détectable pour les canaux mutants L125C dans les membranes de phospholipides, suggérant l'insertion presque complète de tous les canaux dans les bicouches. A titre de contrôle positif de la réaction, 5,0 mM DM est introduit pour rendre presque tous les résidus L125C dans les canaux mutants accessibles au réactif MTS.
   Alternativement, une toxine pores contraignant, comme chrybdotoxin, peut être utilisée pour compter les canaux tétramériques. Une base d'anticorps contraignantdire (voir encadré 2, où Fv est préparé comme un ligand conformation spécifique pour KvAP) pourrait être utilisé pour quantifier les sites de liaison disponibles dans les vésicules reconstituées. Ces dosages de liaison peuvent alors être comparés avec un dosage quantitatif de mesure des protéines totales dans le but de comprendre ce qui fraction des canaux reconstitués sont tétramères et quelle fraction de la protéine a la pagaie tension capteur (S3/S4 du capteur de tension) correctement repliée.
   Pour d'autres protéines qui doivent être reconstituées, il est conseillé d'introduire une méthode quantitative pour évaluer la fraction des protéines reconstituées est bien plié. Examen fonctionnel attention est donc un préalable à l'élaboration de contrôle de qualité pour la reconstitution réussie.

3. Applications des reconstitués vésicules contenant de la Manche

3.1. L'étude fonctionnelle des activités des canaux ioniques dans les membranes lipidiques noires.

Préparation de Nmatériaux eeded.

1. préparation lipidique
   1. Nettoyer un verre de tube à essai, un flacon ambre avec bouchon à vis Téflon à surface, et un ensemble de seringues en verre avec du chloroforme. Sécher le flacon ambré sous un courant d'argon.
   2. Transfert de 0,75 mg et 0,25 mg POPE POPG dans le chloroforme dans le flacon ambré et évaporer le chloroforme avec du gaz argon.
   3. Laver les lipides séchés avec 0,20 ml de pentane et sécher complètement pour éliminer le chloroforme résiduel. Enfin dissoudre les lipides dans 50 décane ul. Les lipides dans le décane (20 mg / ml) seront utilisés pour peindre une bicouche lipidique à travers un trou de 150 à 250 microns (Figure 3B) percé dans la partie amincie d'un côté d'une coupelle de bicouche expérimental (Figure 3A).
2. préparation de la solution
   1. Solution intracellulaire (trans): 10 HEPES / KOH, pH 7,4, 15 mM KCl
   2. Solution extracellulaire (cis): 10 HEPES / KOH, pH 7,4, 150 mM KCl
   3. Sel pont: Bend capillaires en verreen ponts en forme de U, et les remplir avec 1,0% d'agar fondu dissous dans une solution extracellulaire.
      Le gradient osmotique établi entre les solutions trans et cis s'est révélé être le principal moteur de la fusion des vésicules sur la bicouche lipidique ^17. Pour lipides chargés négativement, 15 mM _CaCl2 ou peptides poly-arginine chargés positivement se sont avérés capables d'induire des événements de fusion. Lipides fusogènes, tels que DOTAP et les chiens, etc, peuvent être introduits dans les vésicules lipidiques de sorte que le risque d'événements de fusion est plus élevé.

Enregistrements électriques de canaux KvAP dans des bicouches lipidiques

1. Pré-peindre le trou rond (diamètre ~ 0,25 mm) qui est foré à la surface cylindrique de la Coupe bicouche (figure 3B). Les lipides sont transférées avec un pilon capillaire qui est faite dans le laboratoire. La tête ronde du pilon capillaire est polie et ne raye pas la surface de la tasse. The petite quantité de lipides portés par le pilon capillaire se propage autour du trou dans la coupelle bi-couche, et séché à l'air.
2. Attendez 1-2 min pour que le décane va s'évaporer complètement. Des précautions doivent être prises pour éviter la solution lipidique de tomber dans le trou.
3. Insérez la coupe dans la chambre d'enregistrement, et mettre dans les ponts de sel et de connecter les électrodes sur les deux côtés de la coupe d'enregistrement (figure 4A). Ajouter le cis-et trans-solution aux deux côtés du trou. Un gradient osmotique est créé pour faciliter la fusion des vésicules dans la bicouche lipidique.
4. Réglez le décalage entre les deux côtés de la tasse à ~ 0 (normalement <2 millivolts) potentiel. Utilisation du pilon capillaire pour transférer une petite quantité du mélange des lipides dans le décane, et de peindre le lipide à travers le trou jusqu'à ce que se forme une membrane à double couche. La formation de la double couche d'enregistrement est détectée par le courant de la capacité au cours de la délivrance d'une impulsion de rampe.
5. Attendez jusqu'à ce que la membranes'amincit et devient relativement stable. Nous attendons jusqu'à ce qu'il n'y a pas plus de changement dans la capacité de la membrane pendant 3-5 min.
   L'idée générale de la bicouche plane formée à travers un grand trou, c'est que la partie très milieu de la membrane est proche d'être ~ 4,0 nm d'épaisseur en tant que double couche régulière, et la membrane devient plus épaisse lorsqu'elle se rapproche du bord du trou, où il ya un espace annulaire autour et la majeure partie du solvant est du décane ^{18, 19.} Il est inévitable qu'il y ait decane résiduelle dans la partie centrale de la bicouche de la membrane. Passé estimation du ratio de volume de n-décane contre PC était 0,35-0,45 après l'amincissement de la bicouche ^{18, 20-22.} EM examen de la bicouche amincie a montré qu'il y avait des lentilles de décane en sandwich entre les deux feuillets d'un bicouche ^22. Ces données suggèrent que les protéines membranaires insérées dans les membranes bicouches lipidiques coexistent avec les petites îles (jusqu'à 50 nm de diamètre) de décane. Le décane résiduelle in la bicouche diminue également la constante de 0,4 à 0,5 pF / cm ^2, qui peut être utilisé pour obtenir une estimation grossière de la taille de la double couche amincie sur la base de la capacité mesurée capacité électrique. Une bi-couche de 100 pF capacité provient d'une membrane bicouche circulaire de ~ 180 pm de diamètre.
   Pour KvAP, le décane résiduel n'a pas altéré son déclenchement dépendant de la tension, même si la fonction de canal n'a pas été examiné avec soin dans une bicouche sans solvant. La même chose semble être vrai pour les chaînes NaChBac et les Kv1.2 canaux insérés dans le BLM ^23. Il est encore difficile de savoir si la gauche changement significatif de la courbe GV mesurée à partir des Kv1.2 canaux dans le décane bicouche lipidique par rapport aux canaux dans les ovocytes n'a rien à voir avec le décane résiduel ^23. Selon les lipides utilisés pour la formation des bicouches, le montant de la décane résiduelle dans la bicouche peut varier. Par exemple, il a été signalé que la formation des membr lipidique planeanes de MGDG (mono-galactosyl-diacylglycérol) exige que le décane, probablement en raison des crevasses entre le MGDG conique étant rempli de molécules décane. Que le décane résiduelle a des effets sur les protéines à étudier est purement empirique, et l'essai expérimental est nécessaire de dire si l'effet est significatif ou non.
6. Dès que la membrane devient stable, tirer 0,5-1,0 canal contenant ul vésicules en positionnant le côté fin d'une pointe P2-pipette juste au-dessus du trou. Les vésicules tombent vers le bas à travers le trou au fond de la tasse.
   Pendant ce processus, plusieurs vésicules sont attachés à la membrane à travers le trou. Avec le temps, certains sont fusionnés dans la partie bicouche de sorte qu'un petit nombre de canaux KvAP sont correctement insérée dans la bicouche plane dans la partie centrale de la membrane. Les deux gradient osmotique et l'interaction électrostatique sont importants dans la fusion des vésicules lipidiques bicouches dans le ^{17, 24.}
7. Pour testerles canaux de KvAP dans la bicouche, une brève impulsion de 80 mV est livré à partir du potentiel de maintien de -80 mV. En raison de l'inactivation rapide et lente reprise de l'inactivation, un long intervalle (~ 120 sec pour les canaux dans les membranes PE / PG) est donnée entre deux impulsions. Un enregistrement courant typique des canaux dans une membrane Pape / POPG est montré dans la figure 3C. Si le courant est faible, tirer plus de vésicules. Une fois le courant semble de bonne taille, un équilibre entre les concentrations d'ions dans les solutions des deux côtés de la membrane. Les canaux sont prêts pour des expériences électrophysiologiques.

3.2. Dépistage des ligands spécifiques à la conformation des canaux dans des vésicules

1. Présentation de la bibliothèque de phages affiché.
   Le phage affiché bibliothèque peptide 20-mer est présente à l'extrémité N-terminale des cinq-copies de protéines pIII à une extrémité du bactériophage filamenteux fd-tet ^25. La bibliothèque présente env. 1 x 10 ⁸ diffèrentrents types de séquences peptidiques 20-mer aléatoires, et a été gracieusement fournie à nous par le laboratoire du Dr Kathlynn Brown à l'UT Southwestern Medical Center ^26. L'infection phage dans le E. coli K91 rend les bactéries résistantes à 12 pg / ml tétracycline.
   Une procédure détaillée pour la culture bactérienne, l'amplification et le titrage des phages et le séquencement des colonies phage a été décrite par McGuire et al. ²⁶ Nous allons donner une brève description des opérations de base dans la section suivante. Les lecteurs peuvent trouver plus de détails dans le document McGuire. Nous allons plutôt mettre l'accent sur ​​l'isolement des clones spécifiques qui se lient étroitement aux canaux ioniques dans des vésicules reconstituées (figure 4A).
   L'idée de base derrière notre écran, c'est que les phages liés aux canaux reconstitués spécifiquement peuvent être tirés vers le bas avec les vésicules. Le phage lié peut être amplifié et testé contre les canaux dans les membranes lipidiques. Notre étude deles changements de conformation des capteurs de tension KvAP dans différentes membranes lipidiques ⁸ ont montré qu'il est possible de conserver les capteurs de tension en mode «activé» ou états "repos" en commutant les lipides des phospholipides réguliers pour ceux qui ne contiennent pas de phosphates dans les régions du groupe de tête (DOTAP et chiens dans nos expériences). Ces deux conformations lipides déterminés sont utilisés dans notre sélection de ligands spécifiques de conformation. La banque de phages est d'abord saturée par les canaux dans les vésicules phospholipidiques (sélection négative) avant d'être sélectionné pour des liants étanches aux canaux dans le DOTAP et le chien membranes (sélection positive).
2. Les procédures de base derrière la sélection de phages
   La croissance des bactéries K91 en milieu LB: Le temps de doublement des bactéries est d'environ 20 min à 37 ° C avec 200 rpm trembler.
   Amplification de la bibliothèque: Mélanger la solution phage par la bactérie K91 à OD0.4. Après 15 min d'incubation à 37° C, les mélanges sont répartis uniformément sur ​​-9.5 x ² pouces plaques d'agar contenant 9,5 12 pg / ml tétracycline, l'utilisation de grandes plaques empêche la domination de la culture par des bactéries qui ont plus de taux de croissance. Une fois la diversité de la bibliothèque est plus petit, 10 cm boîtes de Petri sont utilisés pour la sélection et l'amplification à petite échelle.
   Amplification à grande échelle des clones individuels: inoculer une petite aliquote de phages (~ 100 millions d'euros) dans 250 ml de LB + 5 mM MgSO ₄ et 12 ng / ml tétracycline, pousser une nuit à 37 ° C. Recueillir des cellules par 6.000 spin rpm pendant 10 min. Recueillir le surnageant et ajouter dans ce volume / volume du tampon 0,2 précipitation (2,5 M de NaCl, 20% PEG8000). Après incubation sur la glace pendant 1,0 heures, centrifuger la solution à 17.000 g pendant 30 min à granulés tous phages. Retirez tous les surnageant, ajouter 1,0 ml de PBS, incuber sur de la glace pendant 30 min, remettre en suspension doucement le culot (pas vortex). Transférer la suspension dans un nouveau tube et centrifuger à 14,000 rpm pendant 2 min. Transférer le surnageant dans un autre tube et incuber à 65 ° C au bain-marie pendant 15 min pour tuer toutes les bactéries. Centrifuger le tube pendant 2 min à 13000 rpm. Jeter le culot, et de stocker aliquote de la solution de phages à -80 ° C.
3. Panoramique des phages contre KvAP canaux dans des vésicules lipidiques.
   1. Les phages peptides présentant besoin d'être amplifié et titré avant nos expériences de sorte que le nombre de phages par unité de volume est connu. KvAP a été reconstitué en POPE / POPG (3:1) majoré de 0,50% vésicules biotine-DOPE comme contrôle négatif, et en CHIENS: biotine-DOPE (199:1; même été fait pour DOTAP vésicules) est utilisé comme cible de choix. La concentration finale de KvAP dans des vésicules est de 0,50 mg / ml, et les lipides sont 5,0 mg / ml. Le tampon de panoramique contenait 500 mM KCl, 100 mM de HEPES / KOH pH 7,4 et 0,10 mg / ml de BSA.
      Pour la première manche, ~ 10 ¹⁰ phages (100 exemplaires pour chaque type) ont été dilués à 0,050 milieu LB ml. Pour les étapes ultérieures panoramique, le STarting phage a été ajustée pour être à l'intérieur de ¹⁰ juin à 10 août.
   2. La sélection négative:
      Incuber les phages dilués dans 50 ul LB avec 100 pi de billes d'agarose neutravidine (capable de se lier 1-2 mg BSA biotinylé par ml de résine; Pierce) dans 1,0 ml de tampon panoramique. Après 10 minutes d'incubation, séparer les perles en les faisant tourner à 100 g pendant 1,0 min. Répétez cette étape deux fois pour éliminer les phages qui se lient directement aux billes.
      Mélanger les restes de phages à partir de l'étape précédente avec 50 pi vésicules vides (PAPE / POPG majoré de 0,5% biotine-DOPE) qui ne contiennent pas de protéines. Ajouter 100 ul de perles de neutravidine qui ont été lavés avec le tampon de panoramique sur le mélange des phages vésicule. Après avoir fait tourner le mélange à la température ambiante pendant 5 min, retirer les billes de 100 spin g pendant 30 sec. Cette étape est répétée pour les vésicules vides de chiens: biotine-DOPE (199:1) ainsi que pour les canaux KvAP à Pape / POPG vésicules (avec 0,5% de biotine-DOPE). Le surnageant après ces traitements des contens le phages entièrement effacée. Après les deux premiers cycles de l'écran, le contrôleur pourrait être effectuée que contre KvAP au Pape / POPG vésicules.
   3. La sélection positive
      Incuber les phages entièrement compensés avec les chaînes KvAP chez les chiens: biotine-DOPE (199:1) vésicules (de même pour les vésicules DOTAP) en présence de 100 pi de billes de neutravidine à la température ambiante pendant 10 min. Porter le volume du mélange à 15 ml à l'aide du tampon de panoramique avant la centrifugation à 100 g pendant 10 min. Collecter les perles et les laver trois fois avec 45 ml tampon panoramique.
   4. Resuspendre les billes dans 500 ul de milieu LB contenant 5,0 ng / ml de biotine, et incuber le mélange à température ambiante pendant deux heures afin de libérer une partie des phages liés de neutravidine, qui a une affinité plus faible que la biotine natif. On sépare les billes par centrifugation à 100 g pendant de une minute. Recueillir le surnageant et les perles dans deux tubes différents pour titrage.
   5. Pour amplifier les phages sélectionnés, mix 200 pi du surnageant ou les billes en suspension dans la dernière étape avec 500 pi K91 culture bactérienne (DO600 ~ 0.4-0.6, cultivée ~ 4 heures avant qu'elle ne soit utilisée). Après incubation à 37 ° C pendant 15 min, plaque 50 pi de chaque sur des plaques tétracycline pour la culture du jour au lendemain.
      Au cours des deux premiers cycles de l'écran (figure 4A), de recueillir les 500 pi de surnageant et les perles de la dernière étape, les mélanger avec les 5 ml de culture de bactéries et la plaque dans 9,5 assiettes carrées pouces afin de récupérer et amplifier toutes les colonies de phages . Cette étape est importante pour la récupération de ces phages qui rendent les bactéries se développent plus lentement que d'autres.
   6. Les colonies des plaques sont amplifiés et titrés avant le prochain cycle de panoramique et de sélection (voir McGuire, et al., ^26).
   7. Examiner les activités des phages sélectionnés positivement sur les canaux.
      Après 10-12 cycles de sélection, de tester l'ensemble des phages amplifiés sur les canaux KvAP en lipides bilayers faits de Pape / POPG. S'il ya une fraction importante de clones positifs, les phages sélectionnés à 100-500 nM doit bloquer une fraction significative des canaux dans la bicouche (figure 4B) que nous choisissions contre canaux stabilisés dans l'état de repos. Les données positives suggèrent qu'il existe des clones qui montreront contraignant fortes pour les canaux dans l'état de repos. Après 16 cycles de sélection, choisissez 50 colonies positives pour le séquençage simple colonie. Les dominantes clones de phages identifiés sont sélectionnés à partir de la comparaison des séquences, et sont amplifiés et testés contre canaux dans les bicouches. Une fois que les clones positifs sont confirmés, la synthèse des peptides portés par les fortes clones positifs et de les tester sur les canaux ainsi de confirmer leurs activités conformation spécifiques.

3.3. La cristallisation des chaînes KvAP dans les membranes pour la détermination de la structure ^27-29

1. Pour stabiliser la conformation desle canal, d'un liant spécifique à la conformation de la voie, de la protéine Fv 33H1, est utilisé pour former le complexe KvAP / Fv. La préparation de la protéine Fv est détaillée dans l'encadré 2. Purifier le complexe dans une colonne Superdex 200. Les élue complexes à environ 11,4 ml dans notre système.
2. Pour l'écran initial, mélanger la protéine avec DMPC ou POPC qui est complètement solubilisé dans DM ou β-OG. Le mélange protéine / lipide / détergent est mélangé pendant plus de 15 heures pour atteindre un équilibre thermodynamique dans la distribution des trois composantes parmi les micelles mixtes. Habituellement, nous testons d'abord trois ratios de lipides / protéines différentes (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) et trois niveaux de pH différents (6.0, 7.0 et 8.0). Le tampon de dialyse contient un tampon de 20 mM de K-phosphate, 100 mM KCl et 3,0 mM NaN3. Le tampon de dialyse est changée tous les 2-3 jours. Une petite partie aliquote des cristaux sont sortis tous les deux à trois jours afin d'examiner la formation de vésicules et l'apparition éventuelle de réseau cristallin.
   Une liste tabloïdde LPR en fonction du pH est utilisé pour déterminer le comportement de la protéine dans les deux types de lipides. Nous voulons obtenir des vésicules de taille relativement grande (plus de 150 nm) ou des feuilles de membrane lorsque les échantillons de dialyse sont examinés par EM à coloration négative. Un petit schéma régulier dans les membranes suggère un succès et sera utilisé pour guider l'optimisation.
   EM coloration négative: des grilles de cuivre recouvertes de films de carbone (épaisseur ~ 3-5 nm) sont lueur déchargée dans l'air pour rendre la surface de carbone hydrophile. Un petit volume (2-3 microlitres) de la suspension de cristaux est chargé sur la surface du charbon, et on incube pendant 0,5 à 1,0 min. Sécher les grilles à partir du côté d'un bord déchiré d'un morceau de papier filtre Whatman n ° 4. Retourner la grille et incuber pendant environ 15 secondes sur le sommet d'une goutte de solution de coloration 150 microlitres (2,0% PTA / KOH, pH 8,0 dans l'eau, plus 0,5% de tréhalose, ou de 6,0% de molybdate d'ammonium / KOH, pH 6,3, 6,5 , dans l'eau, plus 0,5-1,0% tréhalose). Blot autant que possible la solution à partir de til surface de la grille, et laissez la grille pour sécher avant de l'insérer dans un TEM pour examen. Images de vésicules sont prises dans des conditions de faible dose pour éviter le dommage de tout emballage cristallin par les électrons.
3. L'écran est ensuite étendu à examiner petites étapes de LPR dans le but de parvenir à un LPR correct. Si les protéines sont adaptés pour la cristallisation, un réseau de petites protéines dans les membranes peuvent devenir visibles. Autour de ces conditions initiales, d'optimiser la cristallisation en faisant varier les types de sel et la concentration, la température, la vitesse et les méthodes d'élimination des détergents, des cations bivalents, les détergents utilisés pour préparer les protéines, facteurs déclenchants, la composition des lipides etc
   Les cristaux 2D optimisées de complexe KvAPΔ36/Fv grandissent dans de grandes feuilles qui vont de quelques microns à 20-30 microns (figure 5A). Dans des conditions de cryoEM, les cristaux montrent réseau carré clair avec évident symétrie quadruple comme prévu à partir du quadruple symétrique channels (figure 5B et C).

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Résultats

Le flux général des expériences de purification du canal KvAP en homogénéité biochimique est décrit dans la figure 1A. Des échantillons typiques pendant l'expression et la purification de la protéine est montré dans le gel SDS-PAGE à la figure 1B. La protéine après la purification IMAC est relativement pure. Le rendement du canal KvAP est d'environ 1,0 mg / litre de culture.

Solubilisation des vésicules lipidiques avec des détergents d...

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Discussion

La reconstitution de les canaux KvAP en différentes membranes a été utilisé dans plusieurs études ^8-10. Suite à l'idée d'assurer la distribution des lipides entre détergent / lipides micelles mixtes et la protéine / détergent / lipides micelles mixtes, nous sommes en mesure d'atteindre reconstitution presque complète de la KvAP dans des membranes en très différents lipides. Chaque canal KvAP tétramérique a besoin d'~ 100 molécules lipidiques pour couvrir pleinement son domaine ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	RPI Corp.	T60060
Yeast Extract	RPI Corp.	Y20020
NaCl	Fisher	S271-3
Tris Base	RPI Corp.	T60040
Potassium Chloride	Fisher	BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside	Affymetrix	D322S	Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside	Affymetrix	O311	Ana-grade
Aprotinin	RPI Corp.	A20550-0.05
Leupeptin	RPI Corp.	L22035-0.025
Pepstatin A	RPI Corp.	P30100-0.025
PMSF	SIGMA	P7626
Dnase I	Roche	13407000
Bio-Bead SM-2	Bio-Rad	152-3920
HEPES	RPI Corp.	H75030
POPE	Avanti Polar Lipids	850757C
POPG	Avanti Polar Lipids	840457C
DOGS	Avanti Polar Lipids	870314C
DMPC	Avanti Polar Lipids	850345C
Biotin-DOPE	Avanti Polar Lipids	870282C
DOTAP	Avanti Polar Lipids	890890C
NeutrAvidin agarose beads	Piercenet	29200
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories, Inc	132-570
Pentane	Fisher	R399-1
Decane	TCI America	D0011
MTS-PEG5000	Toronto Research Cemicals	M266501