RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

要約

ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて大きくルシフェラーゼまたは生物発光が可能な他の酵素を発現する組換えRNAウイルスの開発により改善されてきた。ここでは、詳細な化学ライブラリーから広域スペクトルの抗ウイルス剤を単離するために麻疹およびチクングニアウイルスのような組換え菌株を組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプライン。

要約

RNAウイルスは、インフルエンザ、気管支炎、デング熱、C型肝炎やはしかなどの主要なヒト疾患の原因である。彼らはまたので、より多くの自然の生態系を貫く増加世界的な交流や人間集団の新たな脅威を表しています。このような新興状況の良い例は、インド洋での2005から2006のチクングニヤウイルスの流行である。ウイルス複製を制御する細胞経路についての我々の理解における最近の進歩は、宿主細胞の機能を標的とする化合物ではなく、ウイルス自体は、RNAウイルスの大きなパネルを阻害し得ることを示唆している。いくつかの広域スペクトル抗ウイルス化合物は、宿主標的指向アッセイで同定されている。読み出しは依然として最も重要スクリーニング戦略を表すしかしながら、細胞変性効果の低減を用いて細胞培養物におけるウイルス複製の阻害を測定する。このような機能の画面が大幅にレポーターを発現する組換えウイルスの開発によって改善されているCA酵素ルシフェラーゼなどの生物発光のpable。本報告では、我々の詳細を広域スペクトル抗ウイルス性プロファイルを有する化合物を同定するために、組換え麻疹および細胞生存率アッセイとチクングニアウイルスを組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプラインを、。

概要

RNAウイルスはヒト感染の多種多様のために責任があり、両方の公衆衛生および経済的なコストの面で世界的に個体数に大きな影響を与える。効率的なワクチンは、いくつかのヒトRNAウイルスに対して開発され、広く予防的処置として使用される。しかしながら、RNAウイルス感染症に対する治療薬の重大な欠如が依然として存在する。確かに、効率的なワクチンは、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルスやヒトRSウイルス（はhRSV）などの主要なヒト病原体に対して使用できません。また、RNAウイルスは世界的な取引所や生態系に対する人間の影響の頻度が増加している新興疾患の大部分を担当している。 RNAウイルスを表し、この脅威に対して、我々の治療の武器は非常に限られており^、1月3日は比較的非効率的である。現在の治療法は、基本的に、自然免疫を刺激するため、組換えI型インターフェロン（IFN-α/β）に基づいていますまたはリバビリンを投与する。このリボアナログの作用機序は、議論の余地がある、おそらくさまざまなメカニズムに依存していますが、細胞内のGTPプールを枯渇携帯IMPDH（イノシン一リン酸脱水素酵素）の阻害は^、4明らかに必要不可欠である。リバビリンは、ペグ化IFN-αと組み合わせて、C型肝炎ウイルスに対する主な治療法である。彼らは効率的に鈍い、IFN-α/βは^5因子の毒性の発現を介したシグナル伝達と、多くの場合、リバビリン^3をエスケープしかし、IFN-α/βとリバビリンの治療は、ほとんどのRNAウイルスに対する生体内で比較的乏しい有効性のある。それが最近、論争のメリット⁶で重度のはhRSVの疾患に対して承認されたが、これは、リバビリン治療が重要な毒性の問題を発生させているという事実に追加しました。より最近では、いくつかのウイルス特異的治療が開発oでインフルエンザウイルスに対して特に市販されているFノイラミニダーゼ阻害薬^3。しかしながら、大きな多様性RNAウイルスの永続的な出現は、比較的近い将来、それらの各々に対する特異的治療の開発を妨げる。全体として、これは近い将来に強力な抗ウイルス分子を同定し、開発するための効率的な戦略の必要性を強調している。

これは、RNAウイルスの大きなパネルに対して活性広域スペクトル阻害剤は、この問題を解決するだろうと言うことは自明である。このような分子は、まだウイルス学者の夢ではあるが、細胞防御メカニズムと自然免疫系の我々のより良い理解は、いくつかの可能性が^7,8存在することを示唆している。いくつかの学術および産業の研究室は現在、ウイルスの複製を鈍らせる細胞防御メカニズムや代謝経路の特定の側面を刺激する分子を求めている。このような化合物は、おそらく重大な副作用が表示されますが、急性ウイルス感染に対する治療はの管理となります長期的にいくつかの潜在的な毒性にもかかわらず、それらを許容すること、比較的短時間のED。様々な戦略は、例えば、広域スペクトル抗ウイルス分子を同定するために開発されてきた。いくつかの研究プログラムは、特定の防御または代謝経路を標的とする分子を発見することを目的としている。これには、は、例えば、ウイルス遺伝子発現^9を誘発し、そのようなRNASEL ^10、ウィルス分解^11を促進するためにオートファジー機械などの抗ウイルス因子を活性化する病原体認識受容体は、ヌクレオシドの合成は、ウイルス感染細胞の死を沈殿させ^12,13、またはアポトーシスカスケードをパスウェイ^14。他のグループは、ターゲットベースではない^13,15-17表現型スクリーンを開発しました。その場合には、抗ウイルス分子は、単に所与の細胞系においてウイルス複製をブロックするそれらの能力によって同定される。一般的な仮定は2-3無関係のRNAウイルスを阻害する化合物は、広い種に適したプロファイルを有するであろうということである抗ウイルス分子をectrum。そのような経験的アプローチを選択したヒット化合物の作用のモードは、第即座に決定され、最終的には、抗ウイルス剤のための新規細胞標的の同定につながる可能性がある。興味深いことに、1999年から2008年の間に米国食品医薬品局（FDA）によって承認された新薬のレトロスペクティブ分析では、一般的に、このような表現型の上映は、ファースト·イン·クラスの低分子薬^18を発見するために、ターゲットベースのアプローチよりも良いを実行する傾向があることが示されている。

ハイスループット細胞ベースのアッセイでのウイルス複製は、通常、ウイルス細胞変性効果から決定される。試験化合物の存在下で、または384ウェルプレート - 細胞を96で感染させ、培養する。数日後、細胞層は、例えば、クリスタルバイオレットなどの染料で固定し、染色する。最後に、吸光度をプレートリーダーで測定すると、ウイルス複製を阻害する化合物は、あちこちに細胞層を維持する能力によって同定されるm個のウイルス誘導細胞変性効果。あるいは、ウイルス媒介性細胞変性効果は、MTS還元などの標準的な生存率アッセイを用いて評価される。このようなアッセイは、非常に扱いやすく、コスト効果的であるが、3つの主要な制限を受ける。第一に、彼らはこのように¹⁹に^近づくの代替を求めて、ウイルス複製がわずか数日で細胞変性であるが、これは必ずしも可能ではないウイルス-細胞の組み合わせを必要とする。第二に、それらは、ウイルス複製の間接的な測定に基づいているため難定量的である。最後に、毒性化合物は、陽性ヒットとしてスコアすることができるので、細胞生存率を測定するカウンタースクリーンで除去されなければならない。これらの障害のいくつかを克服するために、組換えウイルス又はレプリコンは、追加の転写単位から、またはウイルスタンパク質遺伝子（いくつかの例は^20〜23である）とインフレームで、例えば、EGFP又はルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を発現するために逆遺伝学によって操作されている。これらのウイルスは複製し、レポーターPRoteinsは、ウイルスタンパク質自体と一緒に生産されています。これは、ウイルス複製を測定し、候補分子の阻害活性を評価するための非常に定量的なアッセイを提供する。これは、このレポーターシステムは、高感度、事実上の背景を持つ広いダイナミックレンジを発揮するため、ルシフェラーゼ（または生物発光が可能な他の酵素）を発現する組換えウイルスに特に当てはまります。また、全く励起光源は、このように、化合物²⁴の蛍光の干渉を防止する、存在しない。

ここでは、詳細なハイスループットプロトコルは、RNAウイルスの広域スペクトル阻害剤の化学ライブラリーをスクリーニングする。化合物は、ホタルルシフェラーゼ^{25（rMV2/Luc、} 図1、一次スクリーニング）を発現する組換え麻疹ウイルス（MV）に感染したヒト細胞で最初にテストされています。 MVは、注文をモノネガウイルス目に属する、多くの場合、マイナス鎖RNAウイルスの原型メンバーとして考えられているES。このように、MVゲノムはウイルスタンパク質をコードするmRNA分子を合成するために、ウイルスポリメラーゼにより鋳型として使用する。 rMV2/Luc呼ばれる組換えMV株におけるルシフェラーゼ発現は、PとM遺伝子（ 図2A）との間に挿入された追加の転写単位から発現される。並行して、化合物は、ATPの定量によって、培養物中の代謝活性のある細胞（ 図1、一次スクリーニング）の数を評価する商業ルシフェラーゼベースの試薬 ​​を用いてヒト細胞に対するそれらの毒性について試験する。全体の化学ライブラリーを容易に有毒ではなく、効率的にMV複製を遮断する化合物を選択するために、これら2つのアッセイを用いてスクリーニングすることができる。その後、ヒットはチクングニヤウイルス（CHIKV）の複製（ 図1、二次スクリーニング）を損なうする能力についての用量反応MV複製の阻害、毒性がないだけでなく、について再試験されています。 CHIKVはトガウイルス科のメンバーであり、そのゲノムは、APであるositive一本鎖RNA分子。このように、それははしかとMVとCHIKVの両方がRNAウイルスの大きなパネルを阻害する大きなチャンスが阻害化合物とは全く無関係である。構造タンパク質は、サブゲノムmRNA分子の転写および翻訳によってコードされているのに対し、CHIKV非構造タンパク質を直接、ウイルスゲノムから翻訳されています。 CHIKVのための私たちのin vitroでの複製アッセイは、NSP3とのnsP4シーケンス^26（ 図2B）との間にレポーター遺伝子を挿入することによって非構造ポリタンパク質の切断された部分としてウミシイタケルシフェラーゼ酵素を発現CHIKV /漣と呼ばれる組換え株に基づいています。ウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定は、CHIKVのライフサイクルの初期段階においてウイルス複製の監視を可能にする。

このハイスループットプロトコルを迅速万molecの市販のライブラリーにおいて、広域スペクトル抗ウイルス剤に適したプロファイルを有する化合物を同定するために使用された化学的多様性について濃縮ULES。化合物は、基本的には250〜600ダルトンの範囲の分子量で、5のリピンスキーのルールを次の、そして5以下のD値を記録した。これらの分子のほとんどは、他の商用ライブラリで利用可能な新しい化学物質ではなかった。

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プロトコル

化合物を用いた96ウェル娘プレートの1。準備

1. 室温-20℃からDMSO中の化学化合物の10mMストック溶液を含む96ウェルの母プレートを移動させる。 2mMの中間の96ウェル希釈プレートを得るためにDMSO中の化合物5倍に希釈する。希釈のDMSO 20μLに5μlのピペットで混合することによって達成される。
2. ピペットホワイト、バーコード化された組織培養96ウェルプレートのドライウェルに希釈プレートから1μL。娘プレート（D1）のこの最初のセットは、20μMの最終濃度で化合物の毒性を評価するために使用される。使用するまで-20℃で娘プレートを保管してください。
3. DMSOおよび混合の36μLに希釈プレートから4μLをピペットで再び1:10に化合物を希釈する。ホワイト、平底、バーコード化された組織培養96ウェルプレートのドライウェルにピペット1μL。娘プレート（D2）は、この第2のセットは、MV replicatioの阻害を評価するために使用される2μmの最終濃度での化合物によるN。使用するまで-20℃で娘プレートを保管してください。

2。細胞培養の調製化合物の毒性を調べる方法

1. 37℃で、HEK-293T細胞を成長させ、5％CO ₂ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で安定化されたL-グルタミンおよび10％ウシ胎児血清（FCS）、ストレプトマイシン（100μg/ ml）を、およびペニシリン（100でIU / ml）を。細胞は、4〜5日毎にトリプシン処理により継代し、新鮮なフラスコに1:10に希釈されています。細胞は実験のために対数期にあるべきである。
2. 実験の日に、トリプシン処理により細胞を回収し、細胞計数を行う。ペレットを遠心分離により細胞を、培養培地中に3×10 ⁵細胞/ mlで再懸濁。細胞懸濁液を12.5ミリリットルを各スクリーニングプレートに必要であることを考慮してください。
3. 転送トラフに細胞、およびスパイク化学部品を含むD1のプレートに細胞懸濁液100μlを分注unds。トラフ内の細胞懸濁液を定期的に沈降を避けるために攪拌される。
4. DMSOを1μlの対照ウェルA1、C1、E1、G1、A12、C12、E12とし、G12スパイク。対応するウェルは、生細胞のための基準（非毒性）として使用される。細胞を殺すために、DMSOの1μL及び0.5％IGEPAL溶液を2.5μlの対照ウェルB1は、D1、F1、H1、B12、D12、F12キーおよびH12スパイク。対応するウェルを、死細胞（高毒性）のための基準として使用される。
5. 37℃で24時間、細胞をインキュベートし、5％CO _2。

rMV2/Lucによって感染細胞培養の3。準備

1. 成長し、2.1と2.2で説明したように細胞を回収する。再度、培養培地中の3×10 ⁵細胞/ mlで再懸濁細胞。細胞懸濁液を12.5ミリリットルを各スクリーニングプレートに必要であることを考慮してください。
2. オプション：20μg/ mlのでウリジンとサプリメントの培地。
   注意：ウイルスreplicatioための化学ライブラリーをスクリーニングする場合N阻害剤は、ピリミジン生合成経路の初期段階を対象とした化合物が頻繁に^{13,16,27,28が}隔離されているようです。培養培地へのウリジンの添加は、そのような抗ウイルス分子を除去するために使用される。確かに、これは効率的に、ピリミジン生合成経路の上流の酵素がブロックされているウイルスの複製を復元します。
3. 非感染細胞と対照ウェルのために細胞懸濁液の1:10に保存し、残りの容量の感染に進みます。
4. rMV2/Luc原液の適切なボリュームを解凍する。 MVストック溶液、1mlあたり10 ^{6〜10 8}感染粒子で、通常です。文化は、感染の0.1多重度（MOI）に対応して、標的細胞あたりのrMV2/Lucの0.​​1感染性粒子に感染している必要があります。注：rMV2/LucはMVワクチン（Schwarz株）に由来し、BSL2環境で操作される。
5. 細胞懸濁液にウイルスを追加し、穏やかに混合する。トラフに感染した細胞を移し、そして100を分配スパイクされた化学化合物を含有D2プレートの列2〜11中の感染細胞懸濁液の液。トラフ内の細胞懸濁液を定期的に穏やかに混合する。
6. 列1および12では、100の非感染細胞の液Aよく上の2を分配する。感染した細胞は、他のウェル中に分配される。
7. 37℃で24時間、細胞をインキュベートし、5％CO _2。

4。ル​​シフェラーゼ活性を測定し、データ解析

1. インキュベーターからD1プレートを外し、直接培養ウェルにルシフェラーゼに基づく生存能力試薬50μLを追加することによって、細胞の生存率を決定。混合し、室温で10分間インキュベートする。ルミノメーターでプレートを読んでください。積分時間は、ウェルあたり100ミリ秒に設定されている。
2. インキュベーターからD2のプレートを外し、直接培養ウェルにルシフェラーゼ基質50μlのを追加して、ルシフェラーゼ活性を測定。室温で6分間インキュベートし、descriなどのルミノメーターでプレートを読む上記ベッド。
3. 画面²⁹の品質を保証するために、毒性アッセイの各D1のプレートのためのZ '因子を計算します。 Z '= 1-3 *（σ+σ-）/（μ+ - μ-）、μ+とσ+がDMSO単独（無毒性）で発光する手段およびHEK-293T細胞の標準偏差に対応している場合、およびμ-と発光して細胞を殺すためにIGEPALで処理された培養ウェルの標準偏差を用いてσ-です。 Z 'は0.5以上であることが期待される、または対応するプレートは廃棄される。
4. μ+ / 2で毒性閾値を設定します。このカットオフ（ 図3A）以下の発光値を有する化合物を捨てる。
5. 抗ウイルスアッセイの各D2のプレートのためのZ '因子を計算します。ここで、μ+とσ+発光とDMSOのみとともに培養し、感染した細胞のための標準偏差の手段に相当し、μ-、発光と非感染細胞の標準偏差を用いてσ-です。 Z＆＃で再度、プレート39; 0.5未満の値は破棄されます。
6. - /（μ+ - μ-）* 100 =（化合物Xのためのルシフェラーゼ活性μ+）阻害の割合：以下のようにウイルス複製の阻害を計算します。 75パーセントの阻害のしきい値を設定し、両方がこのカットオフ以下の発光値（ 図3B）を低減し、4.4で説明した基準に従って毒性ではない化合物を選択。

毒性および広域スペクトル抗ウイルス活性5。二次スクリーニング

1. それぞれに1:2連続希釈を500〜4μmで（8希釈液）から開始し、DMSOに化合物を打っていることを確認します。培養液50μlと白、バーコード化された組織培養プレートを埋める。培養ウェル中の各化合物希釈液1を添加する。各ヒット化合物の重複連続希釈物と3培養プレートを持っている二回繰り返します。
2. 上記のように2.1及び2で（培養培地中6×10 ⁵細胞/ mlのHEK-293T細胞懸濁液を37.5mlの調製0.2）。ファルコンチューブに2X 12.5ミリリットルを分配し、MOI = 0.2でのウミシイタケルシフェラーゼ（CHIKV /レン）を発現し、MOI = 0.1または組換えCHIKVでrMV2/Lucのいずれかで細胞に感染。転倒混和する。
   注：CHIKV /漣はCHIKVの野生型株に由来するため、BSL3環境で操作する必要があります。ウミシイタケ基質が培養ウェルに添加された後、プレートを（下記参照）BSL1にBSL3から移動させることができる。
3. 50感染していない、rMV2/Luc-infectedμlの、又は、ヒット化合物の連続希釈液を含有する培養プレート中CHIKV /レン感染細胞を分注する。 37℃で24時間インキュベートする
4. rMV2/Luc-infectedウェル中のホタルルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ基質50μlを加える。 CHIKV /漣感染ウェル内のウミシイタケルシフェラーゼ活性を決定するために、ウミシイタケルシフェラーゼ基質50μlを加える。最後に、細胞の生存率を決定するために非感染細胞にルシフェラーゼに基づく生存率アッセイ試薬50μlを加える。
5. プロットデータ（FIグレ4）および50％MVとCHIKV複製を阻害ヒット化合物の濃度を決定する。このアッセイにおいて、いくつかの毒性を示す化合物は無視してください。

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結果

このスクリーニングパイプラインは、MV複製を阻害する化合物の選択に依存しており、最初の重大な細胞毒性（ 図1、一次スクリーニング）を示していない。それは、細胞毒性およびウイルス複製の阻害を決定するために、ルシフェラーゼに基づくアッセイを利用する。全てのピペッティング工程およびデータ取得は、ロボットプラットフォームでハイスループット設定で行うこ?...

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ディスカッション

ここに記載のスクリーニングパイプラインは、RNAウイルスの広域スペクトル阻害剤として適切なプロファイルを有する化合物を選択することを目的とする。万化合物のライブラリーは、このプロトコルでスクリーニングし、前述のフィルタリング基準が適用された場合には、75パーセントよりも優れたMV複製の阻害、 すなわち 40の化合物（0.4％）が陽性と。加えて、それらの約半分は?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity.