Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

Resumo

Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas.

Resumo

Vírus de RNA são responsáveis ​​por importantes doenças humanas, tais como a gripe, bronquite, dengue, hepatite C ou sarampo. Eles também representam uma ameaça emergente devido ao aumento das trocas em todo o mundo e as populações humanas penetrantes ecossistemas mais e mais naturais. Um bom exemplo desse tipo de situação emergente é epidemias de vírus chikungunya de 2005-2006, no Oceano Índico. Avanços recentes em nossa compreensão de caminhos celulares que controlam a replicação viral sugerem que os compostos que visam funções da célula hospedeira, em vez de o próprio vírus, poderia inibir um grande painel de vírus RNA. Alguns compostos anti-virais de amplo espectro têm sido identificados com ensaios orientados-alvo do hospedeiro. No entanto, a medição da inibição da replicação do vírus em culturas de células utilizando a redução de efeitos citopáticos como uma leitura ainda representa uma estratégia de rastreio primordial. Esses rastreios funcionais foram significativamente melhoradas pelo desenvolvimento de vírus recombinantes que expressam as enzimas repórter cazes de bioluminescência, tais como a luciferase. No presente relatório, detalhamos um gasoduto high-throughput screening, que combina o sarampo recombinante e vírus chikungunya com ensaios de viabilidade celular, para identificar compostos com um perfil antiviral de amplo espectro.

Introdução

Vírus de RNA são responsáveis ​​por uma grande variedade de infecções humanas, e têm um enorme impacto sobre as populações de todo o mundo, tanto em termos de saúde pública e de custo econômico. Vacinas eficazes têm sido desenvolvidos contra diversos vírus de ARN humano, e são amplamente utilizados como tratamentos profiláticos. No entanto, ainda existe uma falta crítica de medicamentos terapêuticos contra infecções por vírus RNA. Na verdade, as vacinas não estão disponíveis eficientes contra as principais patógenos humanos, tais como o vírus da dengue, vírus da hepatite C ou vírus respiratório sincicial humano (HRSV). Além disso, os vírus de RNA são responsáveis ​​pela maioria das doenças emergentes, que aumentaram em freqüência por causa de trocas globais e impacto humano sobre sistemas ecológicos. Contra esta ameaça que representam os vírus de RNA, nosso arsenal terapêutico é extremamente limitado e relativamente ineficiente ^1-3. As terapias atuais são, essencialmente, com base no tipo recombinante interferons I (IFN-α / β) para estimular a imunidade inata,ou a administração de ribavirina. Embora o modo de ação deste analógico ribonucleosido é controverso e, provavelmente, depende de vários mecanismos, a inibição da IMFDH celular (inosina monofosfato desidrogenase), que esgota intracelulares piscinas GTP, é claramente essencial ^4. Ribavirina, em combinação com IFN-α peguilado, é o principal tratamento contra o vírus da hepatite C. No entanto, os tratamentos de IFN-α / β e ribavirina são de relativamente fraca eficácia in vivo contra a maioria dos vírus de ARN em que a sinalização eficiente romba IFN-α / β através da expressão da virulência ⁵ e frequentemente escapar ribavirina ^3. Isso, somado ao fato de que a ribavirina está levantando questões importantes de toxicidade, embora tenha sido aprovado recentemente contra a doença hRSV grave com benefícios controversos ^6. Mais recentemente, alguns tratamentos específicos do vírus têm sido comercializados, em particular contra o vírus influenza, com o desenvolvimento of inibidores da neuraminidase ^3. No entanto, a grande diversidade e emergência permanente de vírus RNA impede o desenvolvimento de tratamentos específicos contra cada um deles em um futuro relativamente próximo. Ao todo, este sublinha a necessidade de estratégias eficientes para identificar e desenvolver moléculas antivirais potentes em um futuro próximo.

É trivial para dizer que um inibidor de largo espectro activo contra um grande painel de vírus de ARN resolveria este problema. Embora tal molécula ainda é o sonho de um virologista, a nossa melhor compreensão dos mecanismos de defesa celular e sistema imune inato sugerem que algumas possibilidades existem ^7,8. Vários laboratórios acadêmicos e industriais estão agora a procurar moléculas que estimulam facetas específicas de mecanismos de defesa celular ou vias metabólicas para diminuir a replicação viral. Embora tais compostos provavelmente mostram efeitos colaterais significativos, tratamentos contra infecções virais agudas serão administrared por um tempo relativamente curto, tornando-as aceitáveis, apesar de alguma toxicidade potencial no longo prazo. Várias estratégias têm sido desenvolvidos para identificar estas moléculas antivirais de largo espectro. Alguns programas de pesquisa visam encontrar moléculas que têm como alvo as vias de defesa ou metabólicas específicas. Isso inclui, por exemplo, receptores de reconhecimento de patógenos, para esclarecer a expressão do gene antiviral ⁹ e ativam fatores antivirais como RNaseL ^10, máquinas autofagia para promover a degradação do vírus ^11, a síntese de nucleosídeos vias ^12,13, ou cascatas apoptóticos para precipitar a morte de células infectadas por vírus ^14. Outros grupos têm desenvolvido telas fenotípicos que não são baseadas em alvo ^13,15-17. Nesse caso, as moléculas antivirais são simplesmente identificados pela sua capacidade para bloquear a replicação do vírus em um determinado sistema celular. A suposição é de que em geral um composto inibidor de 2-3 vírus RNA não relacionadas que têm um perfil apropriado para um amplo spectrum molécula antiviral. O modo de acção dos compostos seleccionados de golpes com uma tal abordagem empírica é determinado apenas em um segundo tempo e, eventualmente, pode levar à identificação de novos alvos celulares para antivirais. Curiosamente, uma análise retrospectiva de novas drogas aprovadas pelo os EUA Food and Drug Administration, entre 1999 e 2008 mostrou que, em geral, esses exames fenotípicas tendem a ter melhor do que as abordagens por objectivo realizar a descobrir primeiro-in-class drogas de pequenas moléculas ¹⁸ .

A replicação viral em ensaios baseados em células de alto rendimento geralmente é determinada a partir de efeitos citopáticos do vírus. As células são infectadas e cultivadas em 96 - ou placas de 384 poços na presença dos compostos testados. Depois de alguns dias, as camadas celulares são fixadas e coradas com corantes, tais como violeta de cristal. Finalmente, a absorvência é determinada com um leitor de placas e os compostos que inibem a replicação viral são identificados pela sua capacidade para preservar as camadas celulares from efeito citopático induzido pelo vírus. Alternativamente, os efeitos citopáticos mediados por vírus são avaliados utilizando ensaios de viabilidade de padrão, tais como a redução de MTS. Tais ensaios são altamente tratável e de baixo custo, mas sofrem de três grandes limitações. Primeiro, eles exigem uma combinação vírus-célula, onde a replicação viral é citopático em apenas alguns dias, mas nem sempre isso é possível, chamando, assim, para abordagens alternativas ^19. Em segundo lugar, eles são mal quantitativa, uma vez que são baseados em uma medida indireta da replicação viral. Finalmente, os compostos tóxicos podem ser classificados como resultados positivos, e, portanto, deve ser eliminado, com um ecrã de contador que mede a viabilidade celular. Para ultrapassar algumas destas dificuldades, os vírus recombinantes, ou replicões foram projectadas por genética reversa para expressar proteínas repórter, tal como luciferase ou EGFP, a partir de uma unidade de transcrição adicional ou em grelha com genes de proteínas virais (alguns exemplos são ^20-23). Quando estes vírus se replicar, pr repórteroteins são produzidos em conjunto com as proteínas virais próprios. Isto proporciona um ensaio muito quantitativa para medir a replicação viral e avaliar a actividade inibidora de moléculas candidatas. Isto é particularmente verdadeiro para os vírus recombinantes que exprimem a luciferase (ou outras enzimas capazes de bioluminescência) uma vez que este sistema repórter apresenta uma vasta gama dinâmica, com uma elevada sensibilidade e praticamente sem fundo. Além disso, não há uma fonte de luz de excitação, evitando assim a interferência com fluorescência composto ^24.

Aqui, detalhes de um protocolo de alto rendimento para a tela bibliotecas químicas para inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Os compostos são testados em células de seres humanos infectados com um vírus de sarampo recombinante (MV) que expressam a luciferase do pirilampo ²⁵ (rMV2/Luc, Figura 1, a tela de primário). MV pertence Mononegavirales ordem, e é muitas vezes considerado como um membro protótipo de vírus RNA de cadeia negativaes. Como tal, MV genoma é utilizada como um modelo de polimerase viral para sintetizar moléculas de mRNA que codificam para as proteínas virais. Na estirpe recombinante denominado MV rMV2/Luc, a expressão da luciferase é expressa a partir de uma unidade de transcrição adicionais inseridos entre os genes P e M (Figura 2A). Em paralelo, os compostos são testados quanto à sua toxicidade em células humanas utilizando um reagente à base de luciferase comercial que avalia, por quantificação de ATP, o número de células metabolicamente activas na cultura (Figura 1, o ecrã primário). Bibliotecas químicas inteiras podem ser facilmente rastreados com estes dois ensaios, a fim de seleccionar os compostos que não são tóxicos e bloqueiam eficazmente a replicação MV. Em seguida, os hits são testados para a inibição de dose-resposta de replicação MV, a falta de toxicidade assim como quanto à sua capacidade para afectar o vírus Chikungunya (CHIKV) replicação (Figura 1, o ecrã secundário). CHIKV é um membro da família Togaviridae e seu genoma é apmolécula de RNA de fita simples ositive. Como tal, é completamente alheios ao sarampo e compostos que inibem tanto MV e CHIKV tem uma chance grande de inibir um grande painel de vírus RNA. Proteínas não estruturais são CHIKV directamente traduzido a partir do genoma viral, enquanto que as proteínas estruturais são codificadas através de transcrição e tradução de uma molécula de ARNm subgenómico. O nosso ensaio de replicação in vitro para CHIKV baseia-se uma estirpe recombinante denominado CHIKV / Ren, que expressa a enzima luciferase de Renilla como uma parte clivada da poliproteína não estrutural por meio de uma inserção do gene repórter entre NSP3 e NSP4 sequências de ²⁶ (Figura 2B). A medida da atividade da luciferase Renilla permite o monitoramento da replicação viral na fase inicial do ciclo de vida CHIKV.

Este protocolo de alto rendimento foi usada para identificar rapidamente os compostos com um perfil adequado para os antivirais de largo espectro de uma biblioteca comercial de 10.000 Molecules enriquecido pela diversidade química. Os compostos foram essencialmente seguinte regra de cinco de Lipinski, com pesos moleculares variando 250-600 daltons, e registrar valores de D abaixo de 5. Maioria dessas moléculas eram novas entidades químicas não disponíveis em outras bibliotecas comerciais.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Preparação de placas de 96 poços com filha Compostos

1. Mover placas mãe de 96 cavidades que contêm soluções-mãe 10 mM de compostos químicos em DMSO a partir de -20 ° C até à temperatura ambiente. Diluir 5x compostos em DMSO para se obter placas de intermediários de diluição de 96 poços a 2 mM. A diluição é obtida por pipetagem de 5 ul em 20 ul de DMSO e a mistura.
2. Pipete 1 mL de diluição em placas de poços de branco seco, de cultura de tecidos de código de barras placas de 96 poços. Este primeiro conjunto de placas filhas (D1) vai ser utilizado para avaliar a toxicidade dos compostos a uma concentração final de 20 uM. Armazenar as placas filhas a -20 ° C até à sua utilização.
3. Dilui-se novamente 1:10 compostos por pipetagem de 4 ul de diluição em placas de 36 ul de DMSO e mistura. Pipetar 1 mL em poços secos de branco, fundo plano, cultura de tecidos com código de barras de 96 poços placas. Este segundo conjunto de placas filhas (D2) vai ser utilizado para avaliar a inibição da MV replication pelos compostos a uma concentração final de 2 fiM. Armazenar as placas filhas a -20 ° C até à sua utilização.

2. Preparação de culturas de células para determinar a toxicidade do composto

1. Cultivar células HEK-293T, a 37 ° C e 5% de CO ₂ em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com estabilizado L-glutamina e suplementadas com 10% soro fetal bovino (FCS), estreptomicina (100 ug / ml) e penicilina (100 IU / ml). As células são passadas por tripsinização a cada 4-5 dias, e diluído 1:10 em um frasco fresco. As células devem estar em fase de registro para experimentos.
2. No dia da experiência, recuperar células por tripsinização e efectuar a contagem celular. Células por centrifugação, e ressuspender-los em 3 x 10 ⁵ células / ml em meio de cultura. Considere-se que 12,5 ml de suspensão de células são necessárias para cada placa de triagem.
3. Transferência de células para uma calha, e dispensar 100 ml de suspensão de células em placas D1 contendo componente químico cravadounds. A suspensão de células no interior da calha é agitado periodicamente para evitar a sedimentação.
4. Pico de controle de poços A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 e G12 com 1 ml de DMSO. Poços correspondentes serão utilizados como referência para as células vivas (sem toxicidade). Pico de controlo poços B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 e H12 com 1 ml de DMSO e 2,5 mL de uma solução a 0,5% de IGEPAL para matar as células. Poços correspondentes serão usadas como referência para as células mortas (alta toxicidade).
5. Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.

3. Preparação de culturas de células infectadas por rMV2/Luc

1. Crescer e recuperar as células, tal como descrito em 2.1 e 2.2. Mais uma vez, as células ressuspender em 3 x 10 ⁵ células / ml em meio de cultura. Considere-se que 12,5 ml de suspensão de células são necessárias para cada placa de triagem.
2. Opcional: meio de cultura suplemento com uridina a 20 mg / ml.
   Nota: Quando o rastreio de bibliotecas químicos para replicatio viraln inibidores, parece que os compostos de segmentação etapas precoces da via de biossíntese de pirimidina são frequentemente isolados ^13,16,27,28. A adição de uridina para o meio de cultura é usada para filtrar estas moléculas antivirais. Com efeito, esta repõe eficientemente a replicação viral quando as enzimas a montante da via de biossíntese de pirimidina estão bloqueados.
3. Salve 01:10 de suspensão de células para poços de controlo com células não infectadas, e vá para a infecção com o volume restante.
4. Descongelar o volume apropriado de solução de estoque rMV2/Luc. Soluções estoque de MT são geralmente em 10 -10 ^{6 8} partículas infecciosas por ml. A cultura deve ser infectado com 0,1 partículas infecciosas de rMV2/Luc por células alvo, o que corresponde a 0,1 multiplicidade de infecção (MOI). Nota: rMV2/Luc é derivado de vacina MV (cepa Schwarz) e é manipulada de um ambiente de BSL2.
5. Adicione o vírus a suspensão de células e misture delicadamente. Transferência de células infectadas para uma calha, e dispensar 100mL de suspensão de células infectadas em colunas de 2 a 11 de placas D2 contendo compostos químicos perfurantes. Suspensão celular dentro da calha é regularmente misturado delicadamente.
6. Nas colunas 1 e 12, dispensar 100 ul de células não-infectadas, bem em um dois. As células infectadas são dispensados ​​nos demais poços.
7. Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.

4. Medidas de luciferase de atividade e de Análise de Dados

1. Retirar as placas do incubador D1, e determinar a viabilidade celular através da adição de 50 ul de reagente de viabilidade baseados em luciferase directamente aos poços de cultura. Misturar e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. Ler as placas com um luminómetro. O tempo de integração é de 100 ms por bem.
2. Retirar as placas do incubador D2, e determinar a actividade de luciferase por adição de 50 ul de substrato de luciferase directamente aos poços de cultura. Incubar durante 6 minutos à temperatura ambiente, e ler as placas com um luminómetro, como descricama acima.
3. Calcular um factor-Z'para cada placa D1 do ensaio de toxicidade para garantir a qualidade da tela ^29. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), onde μ + e + σ correspondem aos meios de luminescência e desvios-padrão para as células HEK-293T com DMSO sozinho (sem toxicidade), e μ e σ-são meios de luminescência e desvios padrão para poços de cultura tratados com IGEPAL para matar as células. Z 'está prevista para ser superior a 0,5, ou a correspondente placa é descartado.
4. Definir limite de toxicidade em μ + / 2. Descarte compostos com valores de luminescência abaixo deste ponto de corte (Figura 3A).
5. Calcular um factor-Z'para cada placa D2 do ensaio anti-viral. Aqui, μ + e + σ correspondem aos meios de luminescência e desvios-padrão para as células infectadas cultivadas com DMSO sozinho, e μ e σ-são meios de luminescência e desvios-padrão para as células não-infectadas. Mais uma vez, placas com Z & #39; Os valores abaixo de 0,5 são descartados.
6. Calcula-se a inibição da replicação do vírus da seguinte forma: percentagem de inibição = (μ + - a actividade da luciferase para o composto X) / (μ + - μ-) * 100. Definir limite de inibição em 75%, e selecionar os compostos que reduzam os valores de luminescência abaixo desse ponto de corte (Figura 3B) e não são tóxicos, segundo critérios descritos em 4.4.

5. Tela secundária para toxicidade e amplo espectro antiviral Atividade

1. Fazer diluições em série 1:02 para cada batida composto em DMSO, a partir de 500 uM a 4 uM (8 diluições). Encha branco, placas de cultura de tecidos com código de barras, com 50 ul de meio de cultura. Adicionar 1 ml de cada diluição do composto em poços de cultura. Repita duas vezes para 3 placas de cultura com as diluições em série em duplicado para cada composto de acerto.
2. Prepare a 37,5 ml de uma suspensão de células HEK-293T em 6 x 10 ⁵ células / ml em meio de cultura, tal como descrito acima (em 2.1 e 20,2). Dispensar 2x 12,5 ml em tubos falcon e infectar as células com qualquer rMV2/Luc no MOI = 0,1 ou CHIKV recombinante expressando Renilla luciferase (CHIKV / Ren) em MOI = 0,2. Misture por inversão.
   Nota: CHIKV / Ren é derivado de uma estirpe de tipo selvagem de CHIKV e, portanto, devem ser manipulados em um ambiente BSL3. As placas podem ser movidos a partir de BSL3 para BSL1 vez de substrato de Renilla foi adicionado aos poços de cultura (ver abaixo).
3. Dispense 50 ul de células não infectadas, rMV2/Luc-infected ou CHIKV / Ren-infectadas em placas de cultura contendo diluições em série de compostos de sucesso. Incubar 24 horas a 37 ° C.
4. Adicionar 50 ul de substrato de luciferase do pirilampo para determinar a actividade da luciferase do pirilampo nas cavidades rMV2/Luc-infected. Adicionar 50 mL de substrato Renilla luciferase para determinar a atividade da luciferase Renilla em CHIKV / poços Ren-infectados. Finalmente, adicionar 50 ul de reagente de ensaio de viabilidade baseados em luciferase para células não infectadas para determinar a viabilidade celular.
5. Dados de plotagem (Figura 4) e determinar as concentrações de compostos que inibem o bater MV e replicação CHIKV por 50%. Ignorar composto mostrando alguma toxicidade neste ensaio.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Este gasoduto triagem depende em primeiro lugar na seleção de compostos que inibem a replicação do MV e não mostram qualquer toxicidade celular significativa (Figura 1, a tela principal). Aproveita-se os ensaios baseados em luciferase para determinar a toxicidade celular e a inibição da replicação viral. Todos os passos de pipetagem e de aquisição de dados pode ser realizada em um ambiente de alto rendimento com uma plataforma robótica.

A toxicidade celular dos c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O gasoduto triagem descrito aqui tem como objectivo seleccionar compostos com um perfil adequado como inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Quando uma biblioteca de 10.000 compostos foi exibido com este protocolo e critérios de filtragem acima referidos foram aplicados, ou seja, a inibição da replicação MV superior a 75%, 40 compostos (0,4%) resultados positivos. Além disso, cerca de metade deles mostraram alguma toxicidade no ensaio de viabilidade com base em luciferase, e foram desconsiderados por...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity.