Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

Zusammenfassung

In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.

Zusammenfassung

RNA-Viren sind für die wichtigsten Krankheiten wie Grippe, Bronchitis, Dengue-Fieber, Hepatitis C oder Masern verantwortlich. Sie stellen auch eine neue Bedrohung wegen der erhöhten weltweiten Austausch und die menschlichen Populationen durchdringen mehr und mehr natürliche Ökosysteme. Ein gutes Beispiel für eine solche Situation ist Schwellen Chikungunya-Virus-Epidemien von 2005-2006 in den Indischen Ozean. Jüngsten Fortschritte im Verständnis der zellulären Wege Steuern virale Replikation zeigen, dass Verbindungen, die auf Wirtszellfunktionen anstatt das Virus selbst, könnte eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. Einige antiviralen Breitband-Verbindungen mit Host-zielorientierte Tests identifiziert worden. Aber die Hemmung der Virusreplikation in Zellkulturen unter Verwendung von Reduktion der cytopathischen Effekte als Auslese immer noch eine überragende Screening-Strategie. Solche funktionellen Bildschirme wurden durch die Entwicklung von rekombinanten Viren Reporter exprimieren verbesserter Enzyme ca.Pable der Biolumineszenz wie Luciferase. In dem vorliegenden Bericht haben wir detailliert eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die rekombinanten Masern-und Chikungunya-Viren mit zellulären Lebensfähigkeitstests kombiniert, um Verbindungen mit einem antiviralen Breitband-Profil zu identifizieren.

Einleitung

RNA-Viren sind für eine Vielzahl von Infektionen beim Menschen verantwortlich und haben einen großen Einfluss auf die Bevölkerung weltweit, sowohl in Bezug auf die öffentliche Gesundheit und wirtschaftliche Kosten. Effizienten Impfstoffen gegen verschiedene menschliche RNA-Viren entwickelt worden und werden weithin als prophylaktische Behandlungen. Es besteht jedoch immer noch ein Mangel an kritischen therapeutische Arzneimittel gegen RNA-Virus-Infektionen. Tatsächlich sind effiziente Impfstoffe nicht verfügbar gegen wichtige menschliche Krankheitserreger wie Dengue-Virus, Hepatitis-C-Virus oder humanen Respiratory-Syncytial-Virus (HRSV). Außerdem sind RNA-Viren, die für die Mehrheit der neu auftretenden Krankheiten, die in der Frequenz wegen der globalen Austausch und menschlichen Auswirkungen auf ökologische Systeme erhöht haben verantwortlich. Gegen diese Bedrohung, die RNA-Viren darstellen, ist unser therapeutisches Arsenal äußerst begrenzt und relativ ineffizient ^1-3. Gegenwärtige Therapien beruhen im wesentlichen auf rekombinanten Typ I-Interferone (IFN-α / β), um angeborene Immunität stimulieren basiert,oder die Verabreichung von Ribavirin. Obwohl die Wirkungsweise dieser Ribonukleosid analogen umstritten ist und wahrscheinlich von mehreren Mechanismen, der Hemmung der zellulären IMPDH (Inosin-Monophosphat-Dehydrogenase), die die intrazelluläre GTP-Pools erschöpft ist eindeutig erforderlich ^4. Ribavirin in Kombination mit pegyliertem IFN-α, ist die Haupt Behandlung gegen Hepatitis C-Virus. Allerdings sind die relativ geringe Wirksamkeit in vivo gegen die meisten RNA-Viren IFN-α / β und Ribavirin Behandlungen, wie sie effizient stumpfen IFN-α / β Signaltransduktion durch Expression von Virulenzfaktoren ⁵ und oft entkommen Ribavirin ^3. Dieser Mehr der Tatsache, dass Ribavirin Behandlung wichtiger Fragen Toxizität erhöhen, obwohl es vor kurzem gegen schwere Krankheit mit HRSV umstrittene Vorteile ⁶ genehmigt ^wurde. In jüngerer Zeit sind einige virusspezifischen Behandlungen wurden vermarktet, insbesondere gegen Influenzavirus mit der Entwicklung of Neuraminidase-Hemmer ^3. Die große Vielfalt und dauerhafte Auftreten von RNA-Viren verhindert jedoch die Entwicklung von spezifischen Behandlungen gegen jeden von ihnen in relativ naher Zukunft. Insgesamt unterstreicht dies die Notwendigkeit für eine effiziente Strategien, um in der nahen Zukunft zu identifizieren und zu entwickeln, starke antivirale Moleküle.

Es ist trivial zu sagen, dass ein Breitspektrum-Inhibitor aktiv gegen eine große Gruppe von RNA-Viren würde dieses Problem lösen. Obwohl ein solches Molekül ist immer noch ein Virologe Traum, unser besseres Verständnis der zellulären Abwehrmechanismen und angeborene Immunsystem nahe, dass einige Möglichkeiten gibt es ^7,8. Mehrere akademischen und industriellen Laboratorien versuchen nun, Moleküle, die bestimmte Aspekte der zellulären Abwehrmechanismen oder Stoffwechselwege, die virale Replikation stumpf zu stimulieren. Obwohl solche Verbindungen wahrscheinlich zeigen erhebliche Nebenwirkungen, werden Behandlungen gegen akute Virusinfektionen zu verabreichened für eine relativ kurze Zeit, so dass sie trotz einer möglichen Toxizität auf lange Sicht akzeptabel. Verschiedene Strategien wurden entwickelt, um solche Breitspektrum-antiviralen Moleküle zu identifizieren. Einige Forschungsprogramme zielen auf die Suche nach Molekülen, die spezifische Abwehr oder Stoffwechselwege abzielen. Dazu gehören zum Beispiel Krankheitserreger Erkennungsrezeptoren auf eine antivirale Genexpression ⁹ entlocken und aktivieren antiviralen Faktoren wie RNaseL ^10, Autophagie Maschinen Virus Abbau ¹¹ zu fördern, Nucleosidsynthese Pfade ^12,13, oder apoptotischen Kaskaden zum Tod von Virus-infizierten Zellen ausfallen ^14. Andere Gruppen haben phänotypische Bildschirme, die nicht ziel basieren ^13,15-17 entwickelt. In diesem Fall werden die antivirale Moleküle einfach durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, um die virale Replikation in einem gegebenen zellularen Systems blockieren. Die allgemeine Annahme ist, dass eine Verbindung Hemmung 2-3 unabhängigen RNA-Viren wäre ein geeignetes Profil für eine breit spectrum antiviralen Moleküls. Die Wirkungsweise der Trefferverbindungen mit einer solchen empirischen Ansatz gewählt wird erst in einem zweiten Zeitpunkt bestimmt und schließlich kann die Identifizierung von neuartigen zellulären Ziele für antivirale Medikamente führen. Interessant ist, dass eine retrospektive Analyse der von der US Food and Drug Administration zwischen 1999 und 2008 zugelassenen neuen Medikamenten hat gezeigt, dass im Allgemeinen, wie phänotypischen Screenings tendenziell besser als zielorientierte Ansätze durchführen, um first-in-class, niedermolekulare Medikamente ¹⁸ entdecken .

Virusreplikation in Hochdurchsatz-Assays auf Zellbasis wird in der Regel von Virus zytopathische Effekte bestimmt. Zellen infiziert und in 96 - oder 384-Well-Platten in Gegenwart der getesteten Verbindungen. Nach einigen Tagen werden die Zellschichten fixiert und mit Farbstoffen, wie Kristallviolett gefärbt. Schließlich wird die Absorption mit einem Plattenlesegerät und Verbindungen Hemmung der viralen Replikation durch ihre Fähigkeit identifiziert, die Zellschichten her erhalten bestimmtm-Virus-induzierten zytopathischen Effekt. Alternativ werden viral-vermittelte zytopathischen Effekte mit Standard Lebensfähigkeit Assays wie MTS Reduktion beurteilt. Solche Assays sind hoch handhabbar und kostengünstig, aber leiden unter drei Hauptbeschränkungen. Erstens erfordern sie eine Virus-Zell-Kombination, bei der die virale Replikation ist zytopathischen in nur wenigen Tagen, aber dies ist nicht immer möglich, so fordern alternative Ansätze ^19. Zweitens sind sie schlecht quantitative da sie auf einer indirekten Messung der Virusreplikation basiert. Schließlich können toxische Verbindungen wie positive Treffer erzielt werden und müssen daher mit einer Gegen Bildschirm messen Zelllebensfähigkeit beseitigt werden. Um einige dieser Hürden zu überwinden, wurden rekombinante Viren oder Replikons durch reverse Genetik entwickelt worden, Reporterproteine, wie EGFP oder Luciferase exprimieren, aus einer weiteren Transkriptionseinheit oder in Rahmen mit Virusprotein-Gene (einige Beispiele ^20-23). Wenn diese Viren replizieren, Reporter proteins zusammen mit viralen Proteine ​​selbst hergestellt. Dies stellt eine sehr quantitative Assay die virale Replikation Messung und Bewertung der inhibitorischen Aktivität des Kandidaten-Moleküle. Dies gilt insbesondere für rekombinante Viren, die Luciferase (oder andere Enzyme, die Biolumineszenz), da dies Reportersystem weist einen weiten Dynamikbereich mit einer hohen Empfindlichkeit und praktisch ohne Hintergrund. Darüber hinaus gibt es keine Anregungslichtquelle, wodurch Interferenzen mit ²⁴ Fluoreszenzverbindung.

Hier haben wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Protokoll auf chemische Bibliotheken für Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren zu untersuchen. Die Verbindungen werden zuerst auf menschliche Zellen mit einem rekombinanten Masernvirus (MV) zum Ausdruck Firefly Luziferase ²⁵ (rMV2/Luc, Bild 1, primären Bildschirm) infiziert getestet. MV gehört zu bestellen Mononegavirales und wird oft als eine prototypische Mitglied der Negativstrang RNA-Virus alsEs. Als solches ist MV-Genom als Matrize durch die virale Polymerase verwendet, um mRNA-Molekülen codiert für virale Proteine ​​zu synthetisieren. In dem rekombinanten MV-Stamm genannt rMV2/Luc wird die Luciferase-Expression von einer zusätzlichen Transkriptionseinheit zwischen P und M-Gene (Fig. 2A) einge ausgedrückt. Parallel Verbindungen für ihre Toxizität auf menschlichen Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Luciferase-Reagens, das, zur Quantifizierung von ATP getestet, die Anzahl der metabolisch aktiven Zellen in Kultur (Fig. 1, primären Bildschirm). Gesamte chemischen Bibliotheken lassen sich mit diesen beiden Tests, um Verbindungen, die nicht giftig sind und MV-Replikation effizient zu blockieren wählen abgeschirmt werden. Dann werden Treffer für Dosis-Wirkungs-Hemmung der MV-Replikation, das Fehlen von Toxizität als auch für ihre Fähigkeit, Chikungunya-Virus (CHIKV) Replikation (Abbildung 1, sekundären Bildschirm) beeinträchtigen erneut getestet. CHIKV ist ein Mitglied der Familie und Togaviridae sein Genom ist apositive Einzelstrang-RNA-Molekül. Als solches ist es völlig unabhängig von Masern und Verbindungen Hemmung sowohl MV und CHIKV stehen eine große Chance, eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. CHIKV Nicht-Strukturproteine ​​werden von dem viralen Genom übersetzt, während Strukturproteine ​​werden durch Transkription und Translation einer subgenomischen mRNA-Molekül kodiert. Unsere in vitro-Assay für die Replikation CHIKV auf einem rekombinanten Stamm genannt CHIKV / Ren, die Renilla-Luciferase-Enzym als gespaltenen Teil der Nicht-Struktur Polyprotein durch eine Einsetzöffnung des Reportergens zwischen nsP3 und nsP4 Sequenzen ²⁶ (Fig. 2B) auf der Basis drückt. Das Maß der Renilla-Luciferase-Aktivität erlaubt die Überwachung der viralen Replikation in einem frühen Stadium des Lebenszyklus CHIKV.

Das Hochdurchsatz-Protokoll wurde verwendet, um schnell Verbindungen zu identifizieren mit einem geeigneten Profil für Breitspektrum antiviralen Medikamenten in einer kommerziellen Bibliothek von 10.000 MoleModule für die chemische Vielfalt bereichert. Die Verbindungen wurden im Wesentlichen folgende Lipinski-Regel von fünf, mit Molekulargewichten im Bereich von 250 bis 600 Dalton und log D-Werten unter 5. Die meisten dieser Moleküle wurden neue chemische Wirkstoffe in anderen kommerziellen Bibliotheken nicht verfügbar sind.

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Protokoll

1. Herstellung von 96-Well-Platten mit Tochter Verbindungen

1. Bewegen Mutter 96 Vertiefungen-Platten, die 10 mM Stammlösungen von chemischen Verbindungen in DMSO von -20 ° C bis Raumtemperatur. 5x verdünnen Verbindungen in DMSO Zwischen 96-Well-Platten bei Verdünnung 2 mM zu erhalten. Verdünnung wird durch Pipettieren von 5 &mgr; l in 20 &mgr; l DMSO und Mischen gelöst.
2. Je 1 ul von Verdünnungsplatten in trockene Brunnen aus weißem, Barcode-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen. Diese erste Reihe von Tochterplatten (D1) wird verwendet, um die Toxizität der Verbindungen bei einer Endkonzentration von 20 uM zu bewerten. Speicher Tochterplatten bei -20 º C bis zur Verwendung.
3. Verdünnen Verbindungen wieder 1.10 durch Pipettieren von 4 ul Verdünnungsplatten in 36 ul DMSO und Mischen. Je 1 ul in trockene Brunnen aus weißen, flachen Boden, Barcode-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen. Diese zweite Gruppe von Tochterplatten (D2) wird verwendet, um die Hemmung der MV replicatio evaluierenn durch die Verbindungen in einer Endkonzentration von 2 uM. Speicher Tochterplatten bei -20 º C bis zur Verwendung.

2. Herstellung von Zellkulturen, um die Verbindung Toxizität ermitteln

1. Wachsen HEK-293T-Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit stabilisierten L-Glutamin und 10% fötales Kälberserum (FCS), Streptomycin (100 ug / ml) und Penicillin (100 IU / ml). Die Zellen werden durch Trypsinierung alle 4-5 Tage passagiert und 1:10 verdünnt in einen frischen Kolben. Die Zellen sind in der log-Phase für Experimente sein.
2. Am Tag des Experiments zu erholen Zellen durch Trypsinierung und Zellzählung durchzuführen. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren und Resuspendieren sie bei 3 × 10 ⁵ Zellen / ml in Kulturmedium. Auffassung, daß 12,5 ml der Zellsuspension für jedes Abschirmblech erforderlich.
3. Über Zellen zu einem Trog, und werden 100 ul Zellsuspension in D1-Platten, die Stachel chemische Zusammensetzungunds. Zellsuspension innerhalb der Wanne wird regelmäßig geschüttelt, um die Sedimentation zu verhindern.
4. Spike Kontroll-Wells A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 und G12 mit 1 ul DMSO. Entsprechende Bohrungen werden als Referenz für die lebenden Zellen (keine Toxizität) eingesetzt werden. Spike Kontrollvertiefungen B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 und H12 mit 1 ul DMSO und 2,5 ul einer 0,5% IGEPAL Lösung, um Zellen zu töten. Entsprechende Bohrungen werden als Referenz für die toten Zellen (hohe Toxizität) eingesetzt werden.
5. Zellen, Inkubation für 24 h bei 37 ° C und 5% CO _2.

3. Herstellung von Zellkulturen durch rMV2/Luc Infizierte

1. Wachsen und wieder Zellen, wie in 2.1 und 2.2 beschrieben. Wieder resuspendieren Zellen bei 3 x 10 ⁵ Zellen / ml in Kulturmedium. Auffassung, daß 12,5 ml der Zellsuspension für jedes Abschirmblech erforderlich.
2. Optional: Ergänzung Kulturmedium mit Uridin bei 20 ug / ml.
   Hinweis: Bei der Kontrolle von chemischen Bibliotheken für virale replication-Inhibitoren scheint es, dass Verbindungen, die auf frühen Schritte der Pyrimidin-Biosynthese werden häufig getrennt ^13,16,27,28. Die Zugabe von Uridin Kulturmedium dazu verwendet, um solche antiviralen Moleküle. In der Tat, dies effizient wieder her, wenn die virale Replikation aufwärts Enzyme der Pyrimidin-Biosynthese sind blockiert.
3. Sparen 01.10 Zellsuspension für Kontrollvertiefungen mit nicht-infizierten Zellen, und fahren Sie mit der Infektion mit Restvolumen.
4. Tauen Sie das entsprechende Volumen von rMV2/Luc Stammlösung. MV Stammlösungen sind in der Regel bei 10 ⁶ -10 ⁸ infektiöse Partikel pro ml. Kultur muss mit 0,1 infektiöse Teilchen rMV2/Luc pro Zielzellen, die mit 0,1 Multiplizität der Infektion (MOI) infiziert entspricht. Hinweis: rMV2/Luc von MV-Impfstoff (Schwarz-Stamm) abgeleitet ist und in einer Umgebung BSL2 manipuliert.
5. Fügen Sie den Virus auf Zellsuspension und vorsichtig mischen. Übertragen infizierten Zellen zu einem Trog, und werden 100&mgr; l der infizierten Zellsuspension in den Spalten 2 bis 11 der D2-Platten, die Stachel chemischen Verbindungen. Zellsuspension innerhalb der Wanne wird regelmäßig vorsichtig gemischt.
6. In den Spalten 1 und 12 werden 100 &mgr; l nicht-infizierten Zellen ein gut auf zwei. Infizierte Zellen werden in den anderen Vertiefungen verteilt.
7. Zellen, Inkubation für 24 h bei 37 ° C und 5% CO _2.

4. Luciferase Aktivität Maßnahmen und Datenanalyse

1. Entfernen D1 Platten aus dem Inkubator, und festzustellen, Zelllebensfähigkeit durch Zugabe von 50 ul Luciferase-basierte Lebensfähigkeit Reagenz direkt an Kultur Brunnen. Mischen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Lesen Platten mit einem Luminometer. Integrationszeit ist auf 100 ms pro auch gesetzt.
2. Entfernen D2 Platten aus dem Inkubator, und bestimmen Sie die Luciferase-Aktivität durch Zugabe von 50 ul der Luciferase-Substrat direkt an Kultur Brunnen. Inkubation für 6 min bei Raumtemperatur, und lesen Platten mit einem Luminometer, wie beschrieüber dem Bett.
3. Berechnen Sie einen Z'-Faktor für jede Platte D1 der Toxizität Assay, um die Qualität des Bildschirms ²⁹ zu rechtfertigen. Z '= 1-3 * (σ + σ +-) / (μ + - μ-), wobei μ und σ + + entsprechen mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für HEK-293T-Zellen, die mit DMSO allein (keine Toxizität), und μ-und σ-sind mittels Lumineszenz und Standardabweichungen mit IGEPAL behandelt, um Zellen zu töten Kultur Brunnen. Z 'voraussichtlich über 0,5, oder die entsprechende Platte wird verworfen.
4. Stellen Toxizität Schwelle bei μ + / 2. Entsorgen Sie Verbindungen mit Lumineszenz-Werte unter diesem Cut-off (Abbildung 3A).
5. Berechnen Sie einen Z'-Faktor für jede D2 Platte des antiviralen Test. Hier μ + σ + und entsprechen mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für infizierte Zellen mit DMSO allein kultiviert und μ-σ-und sind mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für nicht-infizierte Zellen. Auch Platten mit Z & #39; Werte unter 0,5 werden verworfen.
6. Berechnen Sie die Hemmung der Virusreplikation wie folgt: Prozentsatz der Hemmung = (μ + - Luciferase-Aktivität für die Verbindung X) / (μ + - μ-) * 100. Stellen Hemmschwelle bei 75%, und wählen Sie Verbindungen, die sowohl reduzieren Lumineszenz-Werte unter diesem Cut-off (3B) und sind nicht giftig nach in 4.4 beschriebenen Kriterien.

5. Sekundärbildschirm Toxizität und Breitspektrum antiviralen Aktivität

1. Stellen serielle 1:2 Verdünnungen für jeden Treffer Verbindung in DMSO, ausgehend von 500 um bis 4 um (8 Verdünnungen). Füllen weiß, Barcode-Gewebekulturplatten mit 50 &mgr; l Kulturmedium. 1 ul jeder Verbindung Verdünnung in Kulturvertiefungen. Zweimal wiederholen bis 3 Kulturplatten mit doppelten serielle Verdünnungen für jeden Treffer Verbindung haben.
2. Vorbereitung 37,5 ml einer HEK-293T-Zellsuspension bei 6 x 10 ⁵ Zellen / ml in Kulturmedium, wie oben beschrieben (2.1 und 20,2). Dispense 2x 12,5 ml in Falcon-Röhrchen und infizieren Zellen entweder mit rMV2/Luc bei MOI = 0,1 oder rekombinanten CHIKV Renilla-Luciferase (CHIKV / Ren) Expression bei MOI = 0,2. Mischen durch Umdrehen.
   Hinweis: CHIKV / Ren ist aus einem Wildtyp-Stamm von CHIKV abgeleitet und sollte daher in einem BSL3 Umgebung manipuliert werden. Die Platten können aus BSL3 zu BSL1 einmal bewegt Renilla Substrat zur Kultur Brunnen hinzugefügt werden (siehe unten).
3. Geben Sie 50 ul von nicht-infizierten, rMV2/Luc-infected oder CHIKV / Ren-infizierten Zellen in Kulturplatten mit seriellen Verdünnungen von Hit-Verbindungen. Inkubiere 24 Stunden bei 37 ° C.
4. In 50 ul von Firefly Luziferase-Substrat zu Firefly Luziferase Aktivität in rMV2/Luc-infected Brunnen zu bestimmen. In 50 ul Renilla Luciferase Substrat Renilla Luciferase-Aktivität in CHIKV / Ren-infizierten Brunnen zu bestimmen. Schließlich, fügen Sie 50 ul Luciferase-Assay-Reagenz basiert Lebensfähigkeit zu nicht-infizierten Zellen zu Zelllebensfähigkeit zu bestimmen.
5. Grundstücksdaten (Figure 4) und bestimmen getroffen Verbindung Konzentrationen, die MV-Replikation hemmen und CHIKV um 50%. Ignorieren Verbindung zeigt einige Toxizität in diesem Test.

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Ergebnisse

Dieses Screening-Pipeline setzt zunächst auf die Auswahl von Verbindungen, die MV-Replikation hemmen und keine signifikante zelluläre Toxizität (Abbildung 1, primären Bildschirm) nicht zeigen. Es nutzt Luciferase-basierte Assays zur Zelltoxizität und die Hemmung der viralen Replikation zu bestimmen. Alle Pipettierschritte und Datenerfassung in einem Hochdurchsatzeinstellung mit einer Roboter-Plattform ausgeführt werden.

Zytotoxizität von Verbindungen unter Verwendung ...

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Diskussion

Die hier beschriebene Screening-Pipeline zielt auf die Auswahl-Verbindungen mit einem geeigneten Profil als Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren. Wenn eine Bibliothek von 10.000 Verbindungen wurde mit diesem Protokoll und oben erwähnten Filterkriterien angewendet wurden untersucht, dh die Hemmung der MV-Replikation überlegen 75%, 40 Verbindungen (0,4%) als positiv. Dabei etwa die Hälfte von ihnen zeigten eine Toxizität in der Luciferase-Basis-Lebensfähigkeitstest, und wurden deshalb nicht berücksichtig...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity.