BRET歩：バインドされていない励起による蛍光発光から（燃料）

要約

関連する原則を調査し、フルオロフォアおよび抗体標的条件は多岐との互換性を実証することによって発光（燃料）から未励起によって蛍光の基礎と応用性を拡大しています。

要約

ルミネセンス（FUEL）から未結合の励起による蛍光は、 インビトロおよびインビボで増加信号およびコントラスト強調を生成する放射励起発光プロセスである。燃料株式生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）と同じ基本的な原則の多くはまだ大幅に発光源と蛍光エンティティ間の許容可能な作動距離が異なっている。 BRETを効果的に2倍のフェルスター半径、一般的に14未満程度の最大値に制限されている間、燃料は光吸収体が存在しない場合にミクロンまでの距離で、あるいはCM発生する可能性があります。ここでは、現象の背後にある、関連する原則を見直すことで、燃料の基礎と応用を拡張し、フルオロフォアおよび蛍光ナノ粒子の多種多様なシステムの適合性を実証する。さらに、抗体標的燃料の有用性が検討されている。ここに示す例は、FUELはapplを利用することができるという証拠を提供するBRETが不可能なications、BRET、伝統的な動物全体のイメージングの間に存在する空間的空白を埋める。

概要

このようなウイルス^1、2、3、細菌、または小型哺乳類などの生物の遺伝子改変は^、4誘導または構成的に発現する生物発光のいずれかに、非常に成功しており、広く^5-7実証されています。生物発光は、天然に存在する試薬を含むインビボでの化学発光反応は、外部光源を必要とせずに、光を生成するという利点を有する。このように、生物発光イメージング、蛍光イメージング⁸から求めた自己および非特異的シグナルの共通の欠点に悩まされない。任意の検出された信号が意図源のみから由来するので、その結果、生物発光は、有意な信号対雑音比を有する。多くのモデルは、in vitroおよびin vivo用途⁹用のPhotorhabdusルミネセンスからルクスオペロン（480と490との間に中心発光極大）を悪用しているが、小さなmammでの使用ALSは、撮像条件の性質そのものに問題があった。ヘモグロビンのような光吸収体の存在を浸透していると、このような組織および骨のような薬剤を、散乱が強く、黄色の波長^3、青に影響を与える。設計ホタルルシフェラーゼ（617nmで発光極大）の発現は、最近開発され、取り込まれ、大幅に光吸収^10を克服し、ツールを提供するが、それでも散乱効果が適用されてきた。

これに応答して、赤色シフト生物発光共鳴エネルギー移動^{（BRET）11-13を}用いて、650〜900 nmの最小化吸収と散乱の領域の所望の光学窓に発信された信号を複数の試みがなされてきた。信号検出を強化するためのツールと​​して、受容体としてのドナーを追加しました蛍光団として生物発光源を使用していますBRETは、限られた成功を発見した。この現象の精液例として、「自己発光量子ドット4; ^{（SIQDs）14}で構成されてウミが外部ポリマー-リジン層に結合されたルシフェラーゼをウミ修正 市販の量子ドット（QD）。基質添加後、得られた生物発光反応は、赤色光子の有意な産生を生成し、量子ドットからの蛍光発光を誘導する。しかし、これらのSIQDsは、生理学的に関連するイベントのin vivo可視化への適用が限られている。この限定された適用性は、SIQDsが遺伝的にエンコードできないため、ポリマーシェルの二次変性を必要とすることから、臓器、細胞または関心のある遺伝子に二重のプローブをリンクすることの難しさに起因する可能性が高い。それらの適用性を改善するために、ルシフェラーゼは、発光コアに直接結合されている他のSIQDsは、最近^15を採用^してきた。 SIQDコンセプトからさらに発展、より適切BRETシステムは、内にウミホタルルシフェラーゼを付加することによって達成された675 nmの460 nmのからの実質的なレッドシフトを生成しながら、具体的マウスの腫瘍を標的にすることができた色素^16を 、docyanine。非放射エネルギー移動を受けることが、BRETは、蛍光カウンターパートと同じ主な制約に従います。ドナー発光とアクセプターの励起スペクトルと2の部分の間の作動距離との間に強いスペクトルの重なりがなければならない程度である必要がありますフェルスター半径（5月14日Nmは二回フェルスター半径¹⁷の実効的な最大距離で、ドナー·アクセプターペアによって異なります）。この距離依存性が大きく検出を強化する手段としてBRETを用いて観察することができるイベントの種類を制限する。

最近、新しいアプローチは、in vitroおよびin vivo条件下での両方で識別され、実証された。 BRET、発光（燃料）から^18、19、未結合の励起によって蛍光の基礎をオフに構築また、発光と蛍光成分との間に強いスペクトルの重なりを必要とします。しかしながら、BRETは異なり、FUELは、発光源から出射された光子が続いてフルオロフォア量子収量に応じて赤色にシフト光子を放出する光学的にアクセス可能なフルオロフォアによって吸収される完全放射過程である。 BRETに似て、このアプローチはまた、光吸収体の存在下での撮像の制約を克服するために使用することができる。得られた赤色シフトは、減衰の減少と光散乱効果の減少に検出された信号の全体的な増加および特異性を提供する。 FUELは、 ルクスオペロン及び量子ドット^18,19を発現する生物発光大腸菌の間で発生することが報告されている。 SIQDsに実験的に類似しているが、根本的な違いが存在する：燃料中の発光源がFOを可能にする蛍光団、物理的に拘束されることにのために、それは必要ありません発光プローブの遺伝子コード化をrを。による発光細菌および量子ドット間のFUELの検出に成功すると、この技術は表面的（皮膚）および深部組織（肺、肝臓）、例えば黄色ブドウ球菌および肺炎連鎖Klebsielliaなどの感染の両方に適用可能であることが可能である。

その実験的有意性の報告以来、FUELは、許容可能な発光性、蛍光対を予測するために使用することができ、そのアプリケーションが、量子収量などの光物理学的特性の同定における使用を含むように拡張されている強固な数学的モデル^20を含むように進化してきた。我々は、燃料の基本的な技術のいくつかの下に説明します。まず、（μm）と短く、基本的にBRETから燃料を区別し、長さ（cm）作動距離、両方の上にこの現象の証拠を示す。第二に、我々は、フルオロフォアおよび蛍光性ナノ粒子の多種多様を調べることによって可能FUEL対を拡張。 THIRdは、FUELアプリケーションは、標的化および非標的化FUEL対を比較することにより調べた。

プロトコル

1。試薬

1. 購入またはそのようなルクス ABCDE ^21を発現する改変大腸菌（Escherichia coli）などの発光細菌や適切な培養培地を開発し、 ビブリオフィ、フォトバクテリウム属、肺炎桿菌^22。
2. 標準レシピによると、生理食塩水（0.9％NaCl）で、文化メディアソリューションを準備します。E.大腸菌とK.肺炎連鎖球菌は、37℃、およびV.でルリアベルターニ（LB）中で増殖させた。 22℃で、0.5MのNaClを添加したLB中でシャリとフォトバクテリウム属
3. 購入又はQ-トラッカーなどの蛍光プローブ705（40nmの直径、QD705と称する）を取得する、Q-トラッカ800（40nmの直径、QD800と称する）、蛍光（40nmの直径）と非蛍光ポリスチレン微小球（ 48 nmの直径）、および従来の蛍光染料。
4. 細菌の標識に必要な試薬を準備します。
5. へのアクセスを確保発光波長と露光時間の広い範囲の下でシグナルを検出することができるようなIVISスペクトルなどの全動物生物発光イメージャ。生物発光の測定が可能なプレートリーダーは、ここに記載した実験のほとんどは十分です。

燃料の2。基本的な要約

1. 標準的な培養プレート上の個々のコロニーから開始し、発光細菌の一晩培養を開始します。ここでは、V.シャリを使用した。
2. 実験日は、新鮮なサブカルチャーを開始し、1〜1.5のOD _600が達成されるまで、それらが進行することができます。比較可能な結果を​​生成するために、それらが強いシグナルを生成する同様の増殖状態の細菌を使用するのが最適である。これは、OD ₆₀₀を一定に保つことによって確保することができる。
3. 5 QD705の液または生理食塩水（PS）のいずれかとのそれぞれから、100μLのアリコートを結合してから、スタンダにPSの895μlに追加番目の分光学キュベット。 IVISスペクトラムに充填されたキュベットを置き、適切なフィルターセットの下で測定を行う。ここで、710〜730 nmの発光フィルターを使用した。

3燃料以上の様々な距離

1. 1ミリリットルPSの総容量QD705を50μlまたは非蛍光48 nmのポリスチレン微小球の97.2μlのいずれかとの2減少した体積（1ミリリットル）プラスチック測光キュベットを埋める。これは、2つのエンティティ間の総体積あたりの同じような固体の表面積を保証します。
2. 標準的な黒のテープや光を遮断することができるいくつかの他の不透明材料と第三のキュベットを包むことにより、光源のキュベ​​ットを準備します。慎重にキュベットの両側に二つの同一の光学窓を用意。
3. 光源キュベットのいずれかの側に直接、以前に満たされたキュベットを配置します。 Vの1ミリリットルの分量を追加シャリや他の文化（ すなわち発光大腸菌やフォトバクテ S光源キュベットに新鮮なサブカルチャーからのp）と任意の光汚染を低減するような黒い紙などの不透明材料、でそれをカバーしています。
4. それぞれ、10,30、および30秒の露光時間で、例えば、全光線および710〜730 nmの発光フィルターなどの適切な発光フィルター下で3キュベットを可視化する。
5. 中央キュベットから同等の更なる距離で両方の外部キュベットの位置を変更し、再度可視化する。 3センチメートルの最終対面（還元ボリュームキュベットの中心）の距離が達成されるまで繰り返します。各ステップにおいて、QD705の場所を検証するために蛍光画像（450〜480 nm励起、710〜730 nmの発光）を取得する。

4。潜在的な燃料ペアの調査

1. 他の中のネガティブコントロールとして非蛍光ナノ粒子蛍光体または1の関心の蛍光ナノ粒子のいずれかを含有する1ミリリットル溶液を用いて2削減量キュベットを記入し、PSまたはPS。目の中に電子作業は、表1に概説されるように潜在的な市販のFUELフルオロフォア及び蛍光ナノ粒子の種々検討した、ここに示された。
2. 新鮮Vの1ミリリットルの分量を追加反対側に位置する2つの物理的に同等の光学ウィンドウが格納されているブラックアウトサードキュベットにシャリや他の発光細菌。黒一枚の紙のような不透明な物質でキュベットをカバーしています。
3. 短いが等距離の場所で2削減量のブラックアウトキュベットのいずれかの側のキュベットし、適切なフィルタの下に視覚化する。ここで、0.7センチの距離を用いた。他の蛍光体で繰り返します。

5。ターゲットFUEL

1. 発光細菌に特異的なビオチン化抗体を調製する。 Kに具体的な例については、ここでは一次抗体肺炎連鎖球菌 （α-Kpを）はEZ-リンクスルホ-NHS-LC-ビオチンを含有する溶液を用いてビオチン化した。
2. 2分間の遠心分離（1500×g）での下で脱塩カラムを用いて抗体から過剰の試薬を除去。
3. タンパク質濃度を決定し、HABAアッセイによる抗体のビオチン化の程度を決定するための標準的なブラッドフォードアッセイを使用する。
4. Abおよび最終的に16のビオチン残基の置換の最終度で、その結果、40μlのα-KP抗体で100μL（1×PBSに溶解した10ミリメートル、）混合することにより、α-KP-ビオビオチン化抗体（AB）のバッチを取得10mgの溶液のタンパク質濃度^-1。
5. 複数使用することで、一晩、文化を複製、適切なプロトコル、以下、上記の抗体を用いて洗浄した細菌をターゲットにしています。
   1. 具体的には、Kを洗う1X PBS中で、肺炎 、および4のODに1X PBS中に再懸濁（ 約 4×10 ⁸ CFUミリリットル^-1 OD ^-1）。
   2. 各反復のために、100μlのPBSインキュベート、α -KP抗体（制御用10μlのα-KP-biotBまたは10μLのPBS）と30℃で90分間、100μlの細胞1X PBS中で細胞を3回洗浄し、196μlのPBSに懸濁します。
6. QD705ストレプトアビジンコンジュゲートで細胞を標識し、2つの等価ボリュームに分割する。
7. 一つの解決策を3回洗浄した後、適切な音量にそれを懸濁します。
8. 黒色96ウェルプレートの各ウェルに洗浄し、洗浄されていないソリューションを100μlを配布します。得られた全光の下で発光、490から510 nmであり、710から730 nmのフィルターを測定します。フルオロフォア濃度は、450〜480 nmの励起および710〜730 nmの発光を用いて決定することができる。

結果

共鳴エネルギー移動（RET）が終了したドナーからのエネルギーが強い双極子-双極子相互作用¹³を介してアクセプターからの蛍光応答を誘導することができることにより、発光ドナーと蛍光アクセプターとの間の非放射性の相互作用である。化学発光、蛍光^23,24、および生物発光ドナー¹³を用いて説明したRETは、主に必要とする：ドナー発光とアクセプターの励起スペクトルとの間の1強いスペクトルの重なりを; 2つのエンティティ間の適切な回転整列。と3。0.5〜2倍を超えない作動距離ドナーとアクセプター¹⁷との間のフェルスター半径R _0、。 RETとは対照的に、燃料は、生物発光細菌などの発光源は、このようなフルオロフォアまたは蛍光ナノ粒子として吸収され、第2のエンティティによって再放射される光子を放出するときに発生する赤色のシフト放出SPECTをオリジナルの発光源のラム酒。これにより、燃料はまだ集中励起を使用せずに、標準的な落射条件に似た標準の励起発光過程に従う。この証拠は、容易に、発光細菌および高度に蛍光性の量子ドットを単純に混合することによって観察することができる。 QD705は非蛍光ポリスチレン微小球コントロール（ 図1A）と比較して、溶液中にあったときにも、 ビブリオ属の存在下では、赤のシグナルの有意な増加が観察される。生物発光、本質的にアルデヒド基質、ルシフェラーゼ、およびATPを作成するために必要な構成要素は、すべての産生され、細胞質内に含まれる。さらに、酵素の発光団の生産は、細菌の細胞質（ 図1B）内で行われます。他の場所で報告されているように、細菌の内膜と外膜との間の距離は、典型的には30nmよりも^25-27、有意なRETを可能にしない距離である発生する。ないエンドサイトーシスまたは取り込みの他の手段がないためだけでなく、蛍光ナノ粒子は、細菌の細胞質に交差しない。一緒に、これらの制約は、燃料は、発光細菌を蛍光ナノ粒子と混合された場合に発生する支配的な励起発光現象であることを示している。

先に示したように、FUELは、RETの範囲を超えて存在する。距離にFUEL依存性を調べるために、標準的な分光測光キュベット減少した体積は、フルオロフォア溶液を含むもの、散布のために制御することができる適切なコントロールを含む第2、および第3の新鮮な発光溶液のアリコートを含有すると共に、使用することができる。これは、中央のキュベットは、発光源からの光潜在的な汚染を減らすために、反対側の面に配置された少なくとも二つの同一の光学窓のために保存、黒色テープ又は別の不透明な材料を用いて包まれることが不可欠である。さらに、残りの2つのキュベットを行う必要があります中央キュベットのいずれかの側に等間隔に配置すること。最後に、新鮮な発光溶液は、細菌または化学発光を使用して、最大の光産生を確実にするために、各実験で使用されるべきである。適切な配置の際、希望するフィルタの下に発光信号を取得する。後者からのデータのみが示されているものの合計の光と710〜730 nmのフィルタは、この場合に使用した。各買収後、3センチメートル（ 図2）に段階的に1.0センチメートルから対面距離を増加させる。最後に、最も明るい点にすべてのデータを正規化する。ここで使用される例では、これは、発光源及びQD705を含有するキュベット間の最短距離（D = 1cm）に発生した。このアプローチを使用して、実行可能なFUEL信号は、任意の光吸収体の非存在下で、FUELは、あらゆる可能な共鳴エネルギー移動を越えた距離で起こり得ることを示唆している最終的な取得まで観察することができ、唯一の純粋に放射であると説明することができる効果。データをフィッティングすると、D ^{-1、D -2}依存性車間距離Dの関数としてのシグナルの減少を明らかにする。幾何学的な構成に応じて、コンデンサ距離依存性や点光源のための逆二乗則に前者と後者に相当する。この結果は、キュベット開口部の大きさと発光源とフルオロフォアとの間の距離が指定されていますので、我々の全体的な収集の設定と一致している。

FUELは、量子ドットに適用されるだけでなく、Alexaの系列からの蛍光マイクロスフェア（ 表2）の範囲のフルオロフォアの広い範囲を使用して観察することができるだけでなく。コントロールに匹敵するようにするために、種々のフルオロフォアの等しい濃度を使用すべきであり、ナノ粒子の総表面積（ 表1）を一定に保持。非蛍光との適切なコントロール（PSまたはPSに蛍光団とナノ粒子とを比較することにより、ポリスチレン微小球）、シグナルの有意な増加は、各エンティティの蛍光発光最大で観察される。信号の最大の相対的な増加は、蛍光発光極大、発光極大発光から最も離れた場所に発生することが見出された。これは、発光源のブロードな発光スペクトルに比べて蛍光シグナルの増加した特異性による可能性が最も高い。 2発光極大がうまく分離しなかったときは逆に、最も信頼性の低い燃料信号が検出されました。興味深いことに、識別可能な燃料信号は、ビーズ（350フルオレセイン当量）あたりに存在する蛍光体のかなりの量に起因する可能性が最も高いスペクトル差は最小限であってもイエローフェア、で発見された。ここに示す結果は、適切な条件下でFUEL iは両方の下で、より関連性の高いアプリケーションのために選択されたプローブの適合化を可能にする種々のフルオロフォアを用いて達成され得ることを示すn個の、インビトロおよびインビボ条件下で 。観察FUEL信号の有意性は、標準的両側スチューデントt検定を用いて決定した。このように、唯一のAlexa555を用い発光源と不適合であることが判明した。

FUELに標的化の影響を調査するために、ビオチン化抗体は、発光細菌およびストレプトアビジン連結された量子ドットを標的化するために使用した。これは、細菌または発光源は発光団及び対応するフルオロフォア間のRETの可能性を最小限にするのに十分な厚さの層を提供することが重要である。インキュベーションおよび非結合抗体を除去するための洗浄後、ビオチン標識された細菌は、次いで、ストレプトアビジン結合QD705または対照としての非官能QD705のいずれかに晒されて、溶液を分割し、一組は、非付着を除去するために、さらなる回の洗浄に曝さQD705。ここでは、すべての4つの条件のために、結果として得られる発光は全光線、​​490から510ナノメートル、下で観察したdは710〜730 nmのフィルタは、後者のみつのフィルタは、データ分析のために使用されるけれども。 QD705の存在は、450〜480 nmの励起および710〜730 nmの発光フィルターを使用して比較した。調査の結果、我々は解決策を洗っていない状態（ 図3）に残された赤いシフトされた信号の差がないがほとんどを発見した。この条件下で得られた蛍光シグナルはまた、QD705同数の標的化および非標的化状態の両方の下に存在することが示唆された、非常に類似していることが見出されている。ただし、未結合のQD705を削除するために、サンプルを洗浄して、その非標的対照と比較して対象となる細菌のための相対的な赤外線信号でほぼ2倍の増加を提供しています。蛍光による調査はQD705の有無を確認するために使用することができる。比較的、目標と洗浄条件は、ほぼ3倍に洗浄されていない状態よりも小さく、まだのみ減少し、得られたレッドシフトした蛍光強度が得られた30％純粋に結合した条件下で細菌の標的はレッドシフト発光の増加をもたらすことを示唆している。このことは、将来のアプリケーションを対象とした燃料の有用性を暗示。

図1の発光細菌および市販の量子ドット間FUEL相互作用が赤色光子生成の増加をもたらす。つの分光測光キュベットを、新鮮V.の100μlアリコートを含有する溶液で満たしたIVISスペクトラム取得した発光スペクトル内に配置する前1〜1.5のOD _600、PSの895μL、およびQD705または生理食塩水（PS）の5μLのどちらか、とシャリ文化。赤色シグナルの有意な増加が原因の存在のために達成されるQD705、710から730 nmの発光フィルター（A）の下で、対照と比較して秒^{-1•CM -2（P•}秒^{-1•CM -2）•}検出された光子の増加により注目することができるように。ここでは、細菌の二重膜は、発光部分（青丸）とQD705（黒丸）との相互作用を除外している。後者は自由にバルク溶液（B）に分布している前者のみが細菌細胞質中に見出される。各菌液用= 3、N。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2燃料の証拠が距離COMPLにわたって発生etely共鳴エネルギー移動を除く。光度キュベットQD70550μlの生理食塩水950μlの（PS）又は非蛍光48nmのポリスチレン微小球の97.2μlのとPSの902.8μlのいずれかを含有する溶液で満たされ、両側に等距離に配置したOD 1〜1.5の₆₀₀で、新鮮な発光フォトバクテリウム属の1ミリリットルを含む中央シュバルツキュベットの。中央キュベットは放出された光子が自由に分散させることができるように2の同一の光学窓を持っていた。 1.0センチメートル〜3 cmの範囲の距離（D）で画像を取得し、赤色光の産生が観察されたFUELが共鳴エネルギー移動によって達成可能ではない距離で起こり得るという証拠を表示する距離の関数として減少した。強度は逆二乗則（左）と同様、D ^-2依存性を、持っているように見えた。同じプロトコルを大腸菌追跡した大腸菌 （右）。結果のトレンドラインは、コンセプトTHAにフォームを開催細菌は、光の点源として動作しているトン。三つの独立した距離測定値の合計は、それぞれが固有の継代培養を用いて得た。エラーバーは、各時点で存在している。場合によっては、エラーバーは、正規化された強さを示すために使用される記号よりも小さかった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3標的（特異的）および非標的（バルク溶液）FUELとの比較。K. 肺炎連鎖球菌は、ビオチン化抗体で官能化し、次いでストレプトアビジン標識（標的化）または非標識（非標的化）QD705のいずれかに曝露した。得られた溶液を均等に配当でしたDEDと1セットPBS中で最初の体積中に再懸濁する前にPBSで3回洗浄した。溶液を、次いで、黒色96ウェルプレート及び（青色バーとして示される）490〜510ナノメートル（500ナノメートル）および710〜730ナノメートル（720 nm）の発光フィルターで観察生物発光の個々のウェル中に分配した。 Pの•秒^-1•センチ^-2 720 nmのフィルターから検出された各ウェルについては、それぞれのP•秒^-1•センチ^-2同一ウェルの500nm以上の生物発光強度で規格化した。落射蛍光励起に起因する相対的な蛍光強度を450〜480 nmの励起および710〜730 nmの発光フィルター（赤色バーとして示される）を用いて決定した。生物発光または蛍光シグナルの違いはありませんがほとんどが未洗浄の条件（非標的未洗浄およびターゲット未洗浄）で観察した。これは、結合されたとフリーフローティングQD705は生物発光光子によって均等に興奮していたことを示唆している。洗濯の際に、N初期の相対的な赤外線信号で2倍の差は、対照（洗浄非標的）と比較した（対象となる洗浄した）QD705で標識された細菌が観察された。非標的洗浄中QD705の不在は、蛍光シグナルの欠如によって確認され、目標と洗浄状態にQD705ラベルを確認した。データは、Kの4独立した培養物からのものである肺炎球菌。明確にするために、伝説がQD705励起のソースを示します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

蛍光色素分子	濃度	μL	PS（μL）	λ マックス EX / EM（NM）	発光フィルタ（N M）
アレクサ555	37.2μM	4.77	995.23	565分の555	570から590
アレクサ568	37.2μM	4.77	995.23	603分の578	590から610
アレクサ633	37.2μM	4.77	995.23	637分の632	650から670
37.2μM	4.77	995.23	723分の702	710から730
非蛍光性の	2.62パーセントの固形分	9.72	990.28
μSphピンク	固形分5％	4.77	995.23	605分の580	610から630
μSphイエロー	固形分5％	4.77	995.23	515分の505	510から530
QD705	2μM	5	995	705分の465	710から730
2μM	5	995	705分の465	790から810

幅：108px; ">アレクサ700 高さ：22px;幅：108px; "> QD800

表1燃料デモンストレーションを通じて使用される蛍光体の性質。

	コントロール	フィルター	蛍光色素分子		コントロール		p値
			P·秒-1·cm -2で	SD	P·秒-1·cm -2で	SD
A555	PS	580	1.08×10 7	3.31×10 6	9.09×10 6	1.75×10 6	0.233
A568	PS	600	8.47×10 6	4.23×10 6	4.49×10 6	9.71×10 5	0.094
A633	PS	660	2.40×10 6	1.25×10 6	7.85×10 5	2.39×10 5	0.046
A700	PS	720	5.53×10 5	2.46×10 5	1.54×10 5	6.05×10 4	0.026
MSPHイエロー	非蛍光μspheres	520	1.19×10 8	4.85×10 7	5.79×10 7	1.99×10 7	0.057
MSPHピンク	非蛍光μspheres	620	2.37×10 7	1.36×10 7	2.16×10 6	8.00×10 5	0.026
QD705	非蛍光μspheres	720	1.76×10 7	7.33×10 6	2.08×10 5	7.16×10 4	0.007
QD800	非蛍光μspheres	800	7.79×10 6	4.72×10 6	3.60×10 4	1.52×10 4	0.023

表2。蛍光団と燃料と互換性のある蛍光ナノ粒子の同定。

ディスカッション

FUELの基本的な実証は、蛍光ナノ粒子または量子ドットで発光細菌を混合することによって簡単に達成することができる。 2つのエンティティが物理的に分離され、任意の効率的なRETの距離を超えて残ることになる。より困難なインビトロおよびインビボの両方FUEL信号の最適化である。 in vitroの条件下では、とし、光吸収体の存在の有無の両方、通常は過剰蛍光体のほかには、燃料の応答を最大にするために十分である。しかし、高濃度ではそのような静的または衝突消光などの現象は、蛍光信号の損失につながることができます。独立して、発光源と蛍光体の濃度を変えることにより希釈系列を実行すると、所望の濃度を最適化するのに役立つ。 インビボ濃度下FUELの確立および最適化は、はるかに困難であり、ケースバイケースで対処する必要がある。なお、共を作成することは困難である蛍光実体が発光源によって光学的にアクセスすることができますndition。このように、二つの部分の直接の共注射で開始すると、最適条件下でFUELの成功に関する情報を提供することができる。

標準プロトコルは、Alexaのシリーズや量子ドットなどの蛍光実体で標識する細菌や真核細胞のために存在する。多くの場合、これは減少し、細胞生存率または変化した代謝活性のような望ましくない影響をもたらすことができる抗体を用いた表面機能化や活性化を必要とします。これを克服するために、蛍光標識を最大にしながら細胞の摂動を最小限に抑える必要な抗体または活性化剤の最適量を決定することが重要である。 QDの使用は、それらの特徴的な広い励起スペクトル、狭波長可変発光スペクトル、広いストークスシフトの可能性が有利である。しかし、QDは、細胞傷害性であることができ、いくつかのケースでは望ましくないことがある。

FUELは、多くのBRET実験¹³中に存在する、発光および蛍光種々の供給源にも適用可能である現象である。今まで、FUELから生じる光子は非特異的相互作用もしくは不十分に設計されたBRET実験から得られた不幸なバックグラウンド信号との積とみなした。それは我々が、この不要な信号の有用性を識別することができた、ここで実証実験の種類だけである。図示の実施例において、発光細菌は、蛍光実体の多種多様の標準蛍光応答を誘発することができる拡散励起源として作用する。さらに、実質的により作動距離のために、それはFUELがBRETが発生することなく構成することができるが、一般にBRET FUELからの寄与なしに観察することができないと結論しても安全である。重要なことに起因する標的要件の欠如のために、FUELはBRET及びcの間に存在する空間的な間隙を覆うために使用することができるonventional全動物のイメージング技術。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon			kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145			52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)			standard growth media
Q-Tracker 705	Life Sciences	Q21061MP
Q-Tracker 800	Life Sciences	Q21071MP
Alexa 555	Life Sciences	S21381
Alexa 568	Life Sciences	S11226
Alexa 633	Life Sciences	S21375
Alexa 700	Life Sciences	S21383
Non-fluorescent microspheres	Polysciences, Inc	15913
Pink microspheres	Life Sciences	F8887	40nm diameter
yellow microspheres	Life Sciences	F8888	40nm diameter
Ivis Spectrum	PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific Pierce	21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO	Thermo Scientific Pierce	21425
HABA assay kit	Thermo Scientific Pierce	28005
Bradford assay	Bio-Rad	500-0201