A Step Beyond BRET: Fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL)

Résumé

Extension de la fondation et de l'applicabilité de la fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) en interrogeant les principes pertinents et démontrer sa compatibilité avec une multitude de fluorophores et les conditions d'anticorps ciblés.

Résumé

Fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) est un processus d'excitation-émission radiative qui produit le signal accrue et l'amélioration de contraste in vitro et in vivo. actions de carburant Beaucoup des mêmes principes de base que le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET), mais diffère grandement dans les distances de travail acceptables entre la source luminescente et l'entité fluorescente. Bien BRET est effectivement limitée à un maximum de 2 fois le rayon de Förster, communément moins de 14 nm, FUEL peut survenir à des distances allant jusqu'à pm ou même cm en l'absence d'un absorbeur optique. Ici, nous étendons sur le fondement et l'applicabilité de carburant en passant en revue les principes pertinents derrière le phénomène et de démontrer sa compatibilité avec une grande variété de fluorophores et de nanoparticules fluorescentes. En outre, l'utilitaire de carburant anticorps ciblé est explorée. Les exemples présentés ici montrent que le carburant peut être utilisé pour applications où BRET n'est pas possible, combler le vide spatial qui existe entre BRET et de l'imagerie traditionnelle de l'animal entier.

Introduction

La modification génétique des organismes, tels que les virus ^{1, 2, 3,} bactéries ou de petits mammifères ⁴ soit induire ou bioluminescence expriment de manière constitutive, a été très réussie et largement démontré ^5-7. La bioluminescence, une réaction de chimioluminescence in vivo impliquant des réactifs d'origine naturelle, présente l'avantage de produire de la lumière sans la nécessité d'une source de lumière externe. En tant que tel, l'imagerie bioluminescente ne souffre pas des inconvénients communs de signal non-spécifique et d'auto-fluorescence à partir de l'imagerie trouvés ^8. Par conséquent, la bioluminescence a un rapport important rapport signal-bruit étant donné que tout signal détecté provient uniquement de la source prévue. Alors que de nombreux modèles ont exploité l'opéron lux de Photorhabdus luminescens (maximum d'émission entre 480 et centrée sur 490 nm) pour in vitro et in vivo ^neuf applications, son utilisation dans les petits mammals a été problématique en raison de la nature même des conditions d'imagerie; l'existence d'absorbeurs optiques pénétrant, telles que l'hémoglobine, et des agents de dispersion, tels que des tissus et des os, affecte fortement à des longueurs d'onde bleu jaune ^3. L'expression d'une luciférase de luciole ingénierie (de maximum d'émission à 617nm) a été récemment mis au point et intégré, fournissant un outil qui permet de surmonter beaucoup absorption optique ^10, mais il est encore soumis à des effets de diffusion.

En réponse, il ya eu plusieurs tentatives de rouge-décaler le signal émis dans la fenêtre optique désirée de 650-900 nm, une région de l'absorption réduite au minimum et diffusion, en utilisant le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) ^11-13. Comme un outil pour améliorer la détection du signal, BRET, qui utilise une source de bioluminescence comme donneur et un fluorophore ajoutée comme accepteur, a trouvé le succès limité. Comme un exemple précurseur de ce phénomène, les «points quantiques auto-éclairante4; (SIQDs) se composent de ¹⁴ Renilla reniformis luciférases modifiées liées à la couche de polymère externe-lysine disponible dans le commerce de points quantiques (QD). Lors de l'addition de substrat, la réaction de bioluminescence résultant induit l'émission de fluorescence des points quantiques, générant une production importante de photons rouges. Cependant, ces SIQDs ont applicabilité limitée à la visualisation in vivo des événements physiologiquement pertinents. Cette application limitée est probablement dû à la difficulté de lier la sonde double à l'organe, la cellule ou le gène d'intérêt, car les SIQDs ne peuvent pas être codés génétiquement et donc nécessiterait une modification secondaire de l'enveloppe de polymère. Afin d'améliorer leur applicabilité, SIQDs alternatives, où les luciférases sont liés directement à la base luminescente, ont récemment été utilisés ^15. Construction d'arrêt de la notion SIQD, un système de BRET plus applicable a été obtenue en attachant la luciférase de Cypridina dans undocyanine colorant ^16, qui était capable de cibler spécifiquement des tumeurs chez la souris tout en produisant un décalage vers le rouge substantielle de 460 nm à 675 nm. Pour subir un transfert d'énergie non radiatif, BRET suit les mêmes contraintes primaires que son homologue fluorescent: il doit y avoir une forte chevauchement spectral entre l'émission des bailleurs de fonds et les spectres accepteur d'excitation et la distance de travail entre les deux parties doit être de l'ordre de la rayon Förster (5-14 nm en fonction de la paire donneur-accepteur, avec une distance maximale de deux fois le rayon Förster ^17). Cette dépendance de la distance limite grandement les types d'événements qui peuvent être observés à l'aide BRET comme un moyen d'améliorer la détection.

Récemment, une nouvelle approche a été identifié et démontré sous la fois in vitro et dans des conditions in vivo. Développée à partir de la fondation de BRET, fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) ^{18, 19} nécessite également une forte chevauchement spectral entre le luminescent et composants fluorescents. Cependant, contrairement à BRET, le carburant est un processus par lequel complètement radiative du photon émis depuis la source luminescente est absorbée par un fluorophore optiquement accessible, qui émet un photon par la suite déplacée vers le rouge selon le rendement quantique de fluorophore. Akin à BRET, cette approche peut également être utilisée pour surmonter les contraintes de l'imagerie en présence d'absorbeurs optiques. Le décalage vers le rouge résultante fournit une augmentation globale et la spécificité dans le signal détecté en raison d'une diminution de l'atténuation et une réduction des effets de diffraction optiques. FUEL a été signalée entre Escherichia coli bioluminescentes exprimant l'opéron lux et les points quantiques ^{18, 19.} Bien que expérimentalement similaire aux SIQDs, une différence fondamentale existe: en carburant, il n'est pas nécessaire que la source luminescente d'être physiquement lié au fluorophore, ce qui permet for codage génétique de la sonde luminescente. En raison de la détection réussie du carburant entre bactéries luminescentes et des points quantiques, il est possible que cette technique pourrait être appliquée à la fois superficielle (la peau) et les tissus profonds (poumon, foie) des infections telles que Staphylococcus aureus et Klebsiellia pneumoniae.

Depuis le rapport de sa signification expérimentale, FUEL a évolué pour inclure un modèle mathématique solide ²⁰ qui peut être utilisé pour prédire luminescent acceptable et paires fluorescentes, et ses applications se sont élargies pour inclure l'utilisation dans l'identification des caractéristiques photophysiques tels que le rendement quantique. Nous décrivons ci-dessous quelques-unes des techniques de base du carburant. Tout d'abord, nous montrons des preuves de ce phénomène tant à court (um) et à long (cm) des distances de travail, qui distingue fondamentalement CARBURANT de BRET. Deuxièmement, nous étendons sur les paires possibles de carburant par l'examen d'une grande variété de fluorophores et de nanoparticules fluorescentes. Third, applications de FUEL sont étudiés en comparant des paires de CARBURANT ciblées et non-ciblées.

Protocole

Une. Réactifs

1. Achat ou de développer des bactéries luminescentes et les milieux de culture appropriés, tels que Escherichia coli modifiée exprimant l'ABCDE lux ^21, Vibrio fischeri, sp Photobacterium. Klebsiella pneumoniae ^22.
2. Préparer le sérum physiologique (NaCl 0,9%) et des solutions de milieux de culture selon des recettes standard. E. coli et K. pneumoniae ont été cultivées en milieu Luria Bertani (LB) à 37 ° C, et V. fischeri et Photobacterium sp dans du LB complété avec 0,5 M de NaCl à 22 ° C.
3. Acheter ou acquérir des sondes fluorescentes telles que la Q-suiveur 705 (40 nm de diamètre, dénommé QD705), Q-suiveur 800 (nm de diamètre 40, dénommée QD800), fluorescent (40 nm de diamètre) et de microsphères de polystyrène non-fluorescentes ( 48 nm de diamètre), et les colorants fluorescents conventionnels.
4. Préparer les réactifs nécessaires pour l'étiquetage bactérienne.
5. Assurer l'accès àensemble un imageur de bioluminescence animal, tel qu'un spectre IVIS, qui est capable de détecter des signaux dans une large gamme de longueurs d'onde d'émission et des durées d'exposition. Un lecteur de plaque capable de mesures de bioluminescence sera suffisant pour la plupart des expériences décrites ici.

2. Récapitulatif de base de FUEL

1. A partir de colonies individuelles sur des plaques de culture standard, commencer cultures de la nuit de bactéries luminescentes. Ici, V. fischeri ont été utilisés.
2. Le jour de l'expérimentation, lancer des sous-cultures fraîches et de leur permettre de progresser jusqu'à une DO ₆₀₀ de 1-1,5 est atteint. Afin de produire des résultats comparables, il est préférable d'utiliser des bactéries dans les États de croissance similaires dans lesquels ils produisent des signaux intenses. Ceci peut être assuré en maintenant la DO ₆₀₀ constante.
3. Combiner des aliquotes de 100 pl de chacun soit 5 pi de QD705 ou de sérum physiologique (PS), puis ajouter 895 ul de PS en standacuvettes rd spectroscopiques. Placer les cuvettes remplies dans le spectre IVIS et prendre les mesures dans les jeux de filtres appropriés. Ici, le filtre d'émission de 710 à 730 nm a été utilisée.

3. Carburant sur des distances variables

1. Remplir deux volume réduit (1 ml) photométriques des cuvettes en plastique avec soit 50 ul de QD705 ou 97,2 pi de non-fluorescentes 48 nm microsphères de polystyrène dans un volume total de 1 ml PS. Cela garantit surface solide similaire par volume total entre les deux entités.
2. Préparer une cuvette de source de lumière en enfermant une troisième cuve avec du ruban noir standard ou d'un autre matériau opaque capable de bloquer la lumière. Préparer soigneusement deux fenêtres optiques identiques sur les côtés opposés de la cuvette.
3. Placer les cuvettes préalablement remplis directement sur chaque côté de la cuvette de la source lumineuse. Ajouter une fraction aliquote de 1 ml de V. culture fischeri ou autre (c.-à-luminescent E. coli ou Photobacterium sp) à partir d'une sous-culture fraîche dans la cuvette de la source lumineuse et le couvrir avec un matériau opaque, tel que du papier noir pour réduire la contamination de la lumière.
4. Visualisez les trois cuvettes dans les filtres d'émission appropriés, tels que la lumière totale et 710-730 filtres d'émission nm, avec des temps d'exposition de 10, 30 et 30 secondes, respectivement.
5. Repositionner les deux cuvettes externes à de plus grandes distances équivalentes de la cuvette centrale, puis de visualiser à nouveau. Répétez l'opération jusqu'à une distance finale face-à-face (au centre de la cuvette réduite en volume) de 3cm est atteint. A chaque étape, acquérir une image de fluorescence (450 à 480 nm d'excitation, de 710 à 730 nm émission) pour valider l'emplacement de QD705.

4. Enquête paires potentielles de carburant

1. Remplir deux cuvettes à faible débit de 1 ml avec des solutions contenant soit un fluorophore ou une nanoparticule fluorescente d'intérêt dans une, et PS PS ou avec des nanoparticules non fluorescents comme le témoin négatif dans l'autre. En ee travail a démontré ici, une variété de potentiels disponibles dans le commerce fluorophores carburant et nanoparticules fluorescentes ont été étudiés, comme indiqué dans le tableau 1.
2. Ajouter une aliquote de 1 ml V. frais fischeri ou d'autres bactéries luminescentes à une troisième cuve black-out contenant deux fenêtres optiques physiquement égaux situés sur les côtés opposés. Couvrir la cuve avec une substance opaque comme un morceau de papier noir.
3. A un endroit à courte distance mais égale les deux cuvettes de volume réduit des deux côtés de la cuvette black-out et de visualiser sous les filtres appropriés. Ici, une distance de 0,7 cm a été utilisé. Répéter l'opération avec les autres fluorophores.

5. CARBURANT ciblée

1. Préparer des anticorps biotinylés spécifiques pour les bactéries luminescentes. Par exemple, des anticorps primaires spécifiques ici à K. pneumoniae (α-Kp) ont été biotinylé en utilisant une solution contenant du EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine.
2. Enlever l'excès de réactif des anticorps en utilisant des colonnes de dessalage sous centrifugation (1500 xg) pendant 2 min.
3. Utiliser un dosage de Bradford standard pour déterminer la concentration en protéine et de déterminer le degré de biotinylation anticorps par dosage de HABA.
4. Obtenir l'anticorps biotinylé α-Kp-biot (AB) des lots par mélange de 100 ul (10 mM, on le dissout dans 1 x PBS) avec 40 ul d'anticorps α-Kp, résultant en un degré final de la substitution de 16 résidus de biotine par Ab et une finale concentration en protéines de 10 mg ml ^-1.
5. Utilisation multiple nuit reproduire cultures, de cibler les bactéries lavées avec les anticorps ci-dessus en suivant le protocole approprié.
   1. Plus précisément, laver le K. pneumoniae dans PBS 1x, et remettre en suspension dans PBS 1x à une DO de 4 (environ 4 x 10 ⁸ UFC ml ^-1 OD ^-1).
   2. Pour chaque répétition, incuber 100 pi de PBS, α -Anticorps Kp (10 pi α-Kp-biotB ou 10 pi de PBS pour le contrôle) et 100 cellules de pi pendant 90 min à 30 ° C. Laver les cellules trois fois en PBS 1x, et remettre en suspension dans 196 ul de PBS.
6. Étiqueter les cellules avec le conjugué QD705 de streptavidine et les diviser en deux volumes équivalents.
7. Laver une solution à trois reprises et remettre en suspension dans un volume approprié alors.
8. Distribuer 100 ul des solutions lavés et non lavés dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits noir. Mesurer la luminescence résultante sous la lumière totale, 490-510 nm et 710-730 nm filtres. concentration en fluorophore peut être déterminée à l'aide de 450 à 480 nm d'excitation et d'émission de 710 à 730 nm.

Résultats

Resonance Energy Transfer (RET) est une interaction non radiatif entre un donneur luminescent et d'un accepteur de fluorescence, grâce à quoi l'énergie du donneur sorti est capable d'induire une réponse de fluorescence de l'accepteur à travers une forte interaction dipôle-dipôle ^13. RET, qui a été décrite à l'aide fluorescent ^{23, 24} chimioluminescence, et bioluminescentes ¹³ bailleurs de fonds, nécessite principalement: 1 chevauchement spectral forte entre l'émission du donneur et accepteur spectres d'excitation;. 2 alignement de rotation appropriée entre les deux entités.; et 3. une distance de travail non supérieure à 0,5 à 2 fois le rayon de Förster, R _0, entre le donneur et l'accepteur ^17. Contrastant avec RET, FUEL se produit lorsqu'une source luminescent, tel que des bactéries bioluminescentes, émet un photon qui est absorbée et réémise par une seconde entité, tel qu'un fluorophore ou une nanoparticule fluorescente rouge de décalage d'émission le spectrhum de la source luminescente initiale. Ainsi, FUEL suit un processus d'excitation-émission-type semblable à épifluorescence conditions standards, mais sans l'utilisation d'une excitation focalisé. La preuve de cela peut être facilement observé par le simple mélange de bactéries luminescentes et les points quantiques fortement fluorescentes. En présence de la Vibrio sp, une augmentation significative des signaux rouge est observée lorsque QD705 étaient également en solution par rapport à un contrôle non-fluorescente à base de microsphères de polystyrène (Figure 1A). Les composants nécessaires pour créer la bioluminescence, essentiellement du substrat en aldéhyde, la luciférase et l'ATP, sont tous produits et contenus à l'intérieur du cytoplasme. En outre, la production enzymatique de luminophore a lieu dans le cytoplasme bactérien (figure 1B). Comme il a été rapporté ailleurs, la distance entre la membrane interne et externe des bactéries est généralement supérieure à 30 nm ^{25 à 27,} sur une distance qui ne permet pas significative pour RETde se produire. De plus, les nanoparticules fluorescentes ne se croisent pas dans le cytoplasme bactérien puisqu'il n'y a pas d'endocytose ou d'autres moyens de fixation. Ensemble, ces contraintes indiquent que le carburant est le phénomène d'excitation-émission dominante qui survient lorsque les bactéries luminescentes sont mélangés avec des nanoparticules fluorescentes.

Comme on l'a déjà montré, FUEL existe au-delà de la gamme de RET. Pour étudier la dépendance de carburant sur la distance, standards cuves spectrophotométriques de volume réduit peuvent être utilisés, avec un contenant une solution de fluorophore, un second contenant un contrôle approprié qui peut contrôler les points, et la troisième contenant un aliquote de solution luminescente frais. Il est essentiel que la cuvette centrale est enveloppée à l'aide du ruban noir ou en un autre matériau opaque, sauf pour au moins deux fenêtres optiques identiques situés sur des faces opposées, afin de réduire la contamination potentielle de la lumière provenant de la source luminescente. En outre, les deux cuves restantes doiventêtre placé de manière équidistante sur chaque côté de la cuvette centrale. Enfin, une solution luminescente frais, à l'aide de bactéries ou de chimioluminescence, doit être utilisé avec chaque expérience pour assurer une production maximale de la lumière. Lors d'un placement approprié, acquérir le signal de luminescence dans les filtres souhaités. La lumière totale et 710-730 nm filtres ont été utilisés dans ce cas, bien que seules les données de ce dernier sont affichés. Après chaque acquisition, augmenter progressivement la distance face-à-face de 1,0 cm à 3 cm (figure 2). Enfin, normaliser toutes les données à la point le plus lumineux. Dans les exemples utilisés ici, cela s'est produit à la plus courte distance (D = 1 cm) entre la source luminescente et la cuve contenant la QD705. En utilisant cette approche, le signal de FUEL viable peut être observée jusqu'à l'acquisition définitive ce qui suggère que, en l'absence de toute absorption optique, FUEL peut se produire à des distances au-delà de tout transfert possible d'énergie de résonance et ne peut être expliqué pour être purement radiatifeffet. Montage de données révèle une diminution du signal en fonction de la distance D suivant un ^{D-1 à} D ^de la dépendance. En fonction de la configuration géométrique, la première correspond à la dépendance condensateur à distance et la seconde à la loi du carré inverse de sources ponctuelles. Ce résultat est donc conforme à notre configuration globale d'acquisition, étant donné la taille de l'ouverture de la cuvette et de la distance entre la source luminescente et le fluorophore.

FUEL s'applique non seulement à des points quantiques, mais peut aussi être observée en utilisant une large gamme de fluorophores allant de la série de microsphères fluorescentes Alexa (tableau 2). Pour être comparable au témoin, des concentrations égales des fluorophores différents doivent être utilisés et l'aire totale de la surface des nanoparticules maintenus constants (tableau 1). En comparant les fluorophores et des nanoparticules de leurs contrôles appropriés (PS ou PS avec les non-fluorescentmicrosphères de polystyrène), une augmentation significative de signal est observé à un maximum d'émission de chaque entité fluorescente. L'augmentation relative plus importante dans le signal a été trouvé à se produire lorsque le maximum d'émission de fluorescence a été le plus éloigné du maximum d'émission de luminescence. Ceci est probablement dû à l'augmentation de la spécificité du signal fluorescent par rapport au large spectre d'émission de la source luminescente. Au contraire, le signal de FUEL moins fiable a été constaté lorsque les maxima d'émission de deux n'étaient pas bien séparés. Fait intéressant, un signal de FUEL discernable n'a été trouvée avec les microsphères jaunes, même si la différence spectrale est minimale, due très probablement à la quantité importante de la présente fluorophore par bille (350 équivalents de fluorescéine). Les résultats présentés ici indiquent que dans des conditions appropriées carburant peut être réalisée avec une variété de fluorophores, ce qui permet l'adaptation des sondes choisies pour des applications plus pertinentes dans les deux in vitro et dans des conditions in vivo. La signification du signal de FUEL observée a été déterminée à l'aide du test t de norme Student bilatéral. En tant que telle, seule la Alexa555 a été jugée incompatible avec la source luminescente utilisée.

Afin d'explorer les effets de ciblage sur le carburant, des anticorps biotinylés ont été utilisés pour cibler des bactéries luminescentes et les points quantiques de streptavidine liée. Il est important que les bactéries ou les source de luminescence assurent une couche assez épaisse pour réduire au minimum la possibilité de RET entre le luminophore et le fluorophore correspondant. Après incubation et lavage pour éliminer les anticorps non liés, les bactéries marquées à la biotine sont ensuite exposées soit QD705 de la streptavidine conjuguée ou QD705 non fonctionnalisé en tant que témoin, les solutions séparées et un ensemble exposé à des lavages supplémentaires, afin de supprimer tout non respectées QD705. Ici, pour les quatre conditions, la luminescence résultant a été observé sous la lumière totale, 490-510 nm, uned 710-730 nm filtres, mais seuls les deux derniers filtres sont utilisés pour l'analyse de données. La présence de la QD705 a été comparée à l'aide de 450 à 480 nm d'excitation et de filtres d'émission de 710 à 730 nm. Après enquête, nous avons trouvé peu ou pas de différence dans le signal décalé vers le rouge lorsque les solutions ont été laissés dans un état ​​non lavé (Figure 3). Le signal de fluorescence résultante sous cette condition se trouve également tout à fait similaire, ce qui suggère que d'un nombre égal de QD705 était présent sous la fois l'état ciblée et non ciblée. Cependant, le lavage des échantillons pour éliminer toute QD705 non lié prévoit une augmentation de près du double du signal rouge par rapport aux bactéries ciblées par rapport à leur contrôle non ciblée. Investigation par fluorescence peut être utilisée pour vérifier la présence ou l'absence de la QD705. Comparativement, l'état lavé ciblée a donné lieu à une intensité de fluorescence qui était près de trois fois moins que la condition non lavé, mais le décalage vers le rouge résultant diminué que de30%, ce qui suggère que dans des conditions strictement liées au ciblage des bactéries se traduira par une augmentation de l'émission décalée vers le rouge. Cela implique fortement l'utilité de FUEL ciblé pour les applications futures.

Figure 1. Une interaction entre les bactéries luminescentes FUEL et disponibles dans le commerce points quantiques conduit à une augmentation de la production de photons rouge. Deux cuves spectrophotométriques ont été remplis avec des solutions contenant 100 aliquotes de V. frais fischeri culture avec une _DO600 de 1 à 1,5, 895 ul de PS, et soit 5 ul de solution saline physiologique ou QD705 (PS), avant d'être placé dans un spectre IVIS et le spectre d'émission acquis. Une augmentation significative des signaux rouge est obtenue grâce à la présence dela QD705, comme on peut le constater par l'augmentation de photons détectés • • s ^-1 cm ^-2 (p • • s ^-1 cm ^-2) par rapport à la commande sous le filtre d'émission 710-730 nm (A). Ici, la double membrane de la bactérie exclut l'interaction des groupements luminescents (cercles bleus) et la QD705 (cercles noirs). Le premier ne se trouvent que dans le cytoplasme bactérien alors que ce dernier est distribué librement dans la solution en vrac (B). N = 3 pour chaque solution bactérienne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Trace de carburant se produisant sur ​​des distances complà l'exclusion etely transfert d'énergie de résonance. cuves spectrophotométriques ont été remplis avec des solutions contenant soit 50 ul de QD705 et 950 ul de solution saline physiologique (PS) ou 97,2 pi de non-fluorescentes microsphères 48 nm de polystyrène et de 902,8 ul de PS, et placées de manière équidistante sur des côtés opposés d'une cuvette noir central contenant 1 ml de frais luminescente Photobacterium sp à une DO ₆₀₀ de 1-1,5. La cuvette centrale avait deux fenêtres optiques identiques permettant aux photons émis pour disperser librement. Acquisition d'images à des distances (D) allant de 1,0 cm à 3 cm, la production observée de la lumière rouge a diminué en fonction de la distance l'affichage des preuves que le carburant peut se produire à des distances pas réalisables par transfert d'énergie de résonance. L'intensité semble avoir D ^de la dépendance, similaire à la loi du carré inverse (à gauche). Le même protocole a été suivi pour E. coli (à droite). Les lignes de tendance résultant détiennent forme au concept that les bactéries agissent comme des sources ponctuelles de lumière. Un total de trois mesures de distance indépendantes entre elles ont été acquises en utilisant une sous-culture unique. Les barres d'erreur sont présents à chaque point. Dans certains cas, les barres d'erreur sont plus petites que les symboles utilisés qui indiquent l'intensité normalisée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Une comparaison entre ciblée (spécifique) et non ciblée (solution globale) CARBURANT. K. pneumoniae ont été fonctionnalisées avec des anticorps biotinylés et ensuite exposé à de la streptavidine marquée, soit (ciblé) ou non marquée (non ciblées) QD705. Les solutions résultantes sont également divided et une série lavées trois fois avec du PBS avant d'être remises en suspension dans leur volume initial dans du PBS. Les solutions ont ensuite été distribués dans les puits individuels d'une plaque de 96 puits noir et la bioluminescence observée dans les filtres d'émission 490-510 nm (500 nm) et 710-730 nm (720 nm) (indiqués par des barres bleues). Le p • • s ^-1 cm ^-2 trouve de filtre de 720 nm pour chaque puits a été normalisée par le respectif p • • s ^-1 cm ^-2 intensité de bioluminescence de 500 nm de la même bien. L'intensité relative de fluorescence résultant de l'excitation à fluorescence a été déterminée à l'aide de 450 à 480 nm d'excitation et de filtres d'émission de 710 à 730 nm (indiqué par des barres rouges). Peu ou pas de différence dans le signal de bioluminescence ou fluorescent a été observée dans les conditions non lavées (non-ciblées non lavés et non lavés ciblées). Ceci suggère que la QD705 lié et libre-flottante étaient tout aussi excités par les photons bioluminescentes. Après le lavage, le ntôt une différence de deux fois dans le signal rouge par rapport a été observée pour les bactéries QD705 marqués (ciblées lavés) par rapport à la commande (non ciblée lavé). L'absence de QD705 dans le non-ciblée lavé a été confirmée par l'absence de signal fluorescent et vérifié l'étiquetage de QD705 dans l'état lavé ciblée. Les données sont de quatre cultures indépendantes de K. pneumoniae. Par souci de clarté, la légende indique la source de l'excitation de QD705. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Fluorophore	Concentration	pl	PS (ul)	λ max ex / em (nm)	Filtre d'émission (n m)
Alexa 555	37,2 uM	4,77	995,23	555/565	570-590
Alexa 568	37,2 uM	4,77	995,23	578/603	590-610
Alexa 633	37,2 uM	4,77	995,23	632/637	650-670
37,2 uM	4,77	995,23	702/723	710-730
Nonfluorescent	2,62% de matière sèche	9,72	990.28
μSph rose	5% de matières solides	4,77	995,23	580/605	610-630
μSph jaune	5% de matières solides	4,77	995,23	505/515	510-530
QD705	2 uM	5	995	465/705	710-730
2 uM	5	995	465/705	790-810

largeur: 108px; "> Alexa 700 hauteur: 22px; largeur: 108px; "> QD800

Tableau 1. Propriétés des fluorophores utilisés dans les démonstrations de carburant.

	Contrôle	filtre	fluorophore		Contrôle		valeur de p
			p · s -1 · cm -2	Dakota du Sud	p · s -1 · cm -2	Dakota du Sud
A555	PS	580	1,08 x 10 7	3,31 x 10 6	9,09 x 10 6	1,75 x 10 6	0,233
A568	PS	600	8,47 x 10 6	4,23 x 10 6	4,49 x 10 6	9,71 x 10 5	0,094
A633	PS	660	2,40 x 10 6	1,25 x 10 6	7,85 x 10 5	2,39 x 10 5	0,046
A700	PS	720	5,53 x 10 5	2,46 x 10 5	1,54 x 10 5	6,05 x 10 4	0,026
MSPH jaune	μspheres non fluorescents	520	1,19 x 10 8	4,85 x 10 7	5,79 x 10 7	1,99 x 10 7	0,057
MSPH rose	μspheres non fluorescents	620	2,37 x 10 7	1,36 x 10 7	2,16 x 10 6	8,00 x 10 5	0,026
QD705	μspheres non fluorescents	720	1,76 x 10 7	7,33 x 10 6	2,08 x 10 5	7,16 x 10 4	0,007
QD800	μspheres non fluorescents	800	7,79 x 10 6	4,72 x 10 6	3,60 x 10 4	1,52 x 10 4	0,023

Tableau 2. Identification des fluorophores et des nanoparticules fluorescentes compatible avec le carburant.

Discussion

La démonstration fondamentale de carburant peut être réalisée par simple mélange de bactéries luminescentes avec des nanoparticules ou points quantiques fluorescentes. Les deux entités seront physiquement séparés et restent au-delà de n'importe quelle distance de RET efficace. Plus difficile est l'optimisation du signal de FUEL à la fois in vitro et in vivo. Dans des conditions in vitro, à la fois avec et sans un absorbeur optique présente, en général l'addition d'un excès de fluorophore sera suffisant pour maximiser la réaction du combustible. Cependant, à des concentrations élevées phénomènes tels que la trempe statique ou de collision peut conduire à une perte de signal fluorescent. Réalisation d'une série de dilutions par la variation indépendante de la concentration de la source luminescente et le fluorophore permettra d'optimiser les concentrations désirées. La mise en place et l'optimisation de carburant sous des concentrations in vivo est beaucoup plus difficile et doit être traité au cas par cas. Il peut être difficile de créer un condition où l'entité fluorescente peut être accédé par la source optique luminescent. En tant que tel, en commençant par co-injection directe des deux parties peut fournir des informations quant à la réussite de carburant dans des conditions optimales.

Protocoles standards existent pour les bactéries d'étiquetage et les cellules eucaryotes avec des entités fluorescentes telles que la série et les points quantiques Alexa. Souvent, cela nécessite une fonctionnalisation de surface ou l'activation d'anticorps, ce qui peut conduire à des effets indésirables tels que la viabilité des cellules ou réduit l'activité métabolique altérée. Pour y remédier, il est important de déterminer la quantité optimale de l'anticorps ou de l'agent d'activation préalable qui minimise les perturbations cellulaires tout en maximisant le marquage fluorescent. L'utilisation de points quantiques est avantageux en raison de leur caractéristique large spectre d'excitation, les spectres d'émission étroite et accordable, et la possibilité d'un déplacement de Stokes. Cependant, les points quantiques peuvent être cytotoxiques et peuvent ne pas être souhaitable dans certains cas.

CARBURANT est un phénomène qui est présent dans de nombreuses expériences de BRET ¹³ et est applicable à une variété de sources fluorescentes et luminescentes. Jusqu'à présent, les photons provenant du combustible ont été considérés comme le produit d'interactions non spécifiques ou un signal de fond malheureux résultant des expériences de BRET mal conçus. C'est seulement avec le type d'expériences démontré ici que nous avons pu identifier l'utilité de ce signal parasite. Dans les exemples représentés, les bactéries luminescentes agissent comme une source d'excitation diffuse capable de déclencher une réponse fluorescent standard à partir d'une grande variété d'entités fluorescentes. En outre, en raison de la distance de travail importante, il est raisonnable de conclure que, bien que le carburant peut être construit sans l'apparition de BRET, dans BRET général ne peut pas être observé sans une contribution de FUEL. Il est important, en raison de l'absence d'une obligation de ciblage, le carburant peut être utilisé pour couvrir l'écart spatiale qui existe entre BRET et ctechniques d'imagerie animal entier onventional.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon			kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145			52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)			standard growth media
Q-Tracker 705	Life Sciences	Q21061MP
Q-Tracker 800	Life Sciences	Q21071MP
Alexa 555	Life Sciences	S21381
Alexa 568	Life Sciences	S11226
Alexa 633	Life Sciences	S21375
Alexa 700	Life Sciences	S21383
Non-fluorescent microspheres	Polysciences, Inc	15913
Pink microspheres	Life Sciences	F8887	40nm diameter
yellow microspheres	Life Sciences	F8888	40nm diameter
Ivis Spectrum	PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific Pierce	21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO	Thermo Scientific Pierce	21425
HABA assay kit	Thermo Scientific Pierce	28005
Bradford assay	Bio-Rad	500-0201