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要約

イメージング技術の統合スイートは、カリブ海サンゴMontastraeaのannularis及びM.におけるポリープの形態および組織構造を決定するために適用されているfaveolata。蛍光、シリアルブロック面、及び二光子共焦点レーザー走査顕微鏡は、葉状構造、ポリープの壁、推定色素胞および藻密度および分布を同定した。

要約

イメージング技術の統合スイートは、カリブ海造礁サンゴMontastraeaのannularisおよびMを含む三次元（3D）形態およびポリープ組織の細胞構造を決定するために適用されているfaveolata。これらのアプローチは、蛍光顕微鏡（FM）、シリアルブロック面イメージング（SBFI）、および二光子共焦点レーザー走査顕微鏡（TPLSM）が挙げられる。 SBFIは、物理的なセクショニング後に深部組織イメージングを提供します。それ以上2mmの組織深さに組織表面テクスチャと3D可視化を詳述する。組織細胞構造の相補FMとTPLSM収率は、超高解像度の画像。結果は、きた：（1）個別のサンゴのポリープの外壁に、以前に報告されていない葉状組織形態を特定し、（2）色素胞および藻類様渦鞭毛藻褐虫藻の内部共生の3次元分布と組織の密度の第1面のマップを作成しました。分光吸収エンドウ500 nmおよび675 nmでksとは、それぞれ、ことを示唆しているM. annularisとM. faveolataはクロロフィル色素胞と同様のタイプが含まれています。しかし、M. annularisとM.組織密度及びこれらの重要な細胞成分の3次元分布に有意な相違を示すfaveolata。イメージング方法に焦点を当てこの研究は、SBFIを脱灰サンゴ組織の大ミリメートル規模サンプルの分析に非常に有用であることを示す。無料のFMおよびTPLSMはnondecalcifiedサンゴの組織試料中の細胞分布と密度の微妙なサブミリ規模な変更を明らかにした。 TPLSM技術が得られる：（1）低侵襲性試料調製、（2）優れた光学セクショニング能、及び（3）最小の光吸収及び散乱が、依然として深部組織のイメージングを可能にしつつ。

概要

地球温暖化および付随する環境変化を直接、熱帯の海洋サンゴ1-4の健康と分布に影響を与えている。複数の影響は、サンゴの白化や感染症5-6の出現など、観察されています。しかし、これらの環境の脅威に対する将来のサンゴ応答のより正確な予測が組織学的「ベースライン」は、「外見上健康」サンゴのための組織形態や細胞組成および分布を定義する、確立されることが必要になります。ターンでは、サンゴはその後、定量的に比較することができ、「影響を受ける」。 「健康な応答」、環境勾配を越え測ることができるようにさらに、このベースラインは、環境条件の多様な条件下で明らかに健康なサンゴのために確立されるべきである。このベースラインを確立に向けた最初のステップとして、高解像度の3D研究がどのように明らかに健康なサンゴのポリープ組織から行われてきた形態および細胞組成は、太陽光の放射照度での水深の増加（WD）及び添付減少に応答します。結果は、サンゴ適応のより包括的なメカニズムの理解を確立すること、ならびにサンゴ共生生物の進化への洞察と集光の増強を得るために使用することができる。

ストーニーサンゴ（ イシサンゴ ） をまとめサンゴは 7-10 holobiontと呼ばれる他の微生物の複雑な集合体にホストを果たしている植民地の海洋無脊椎動物の動物である。本研究で行わ研究では、同時に、組織の顔料および明らかに健康なホストサンゴの共生藻の高まり水深での変更を追跡するために、最先端のイメージング技術のスイートを使用しようとしています。これはサンゴょんの指標として明らかに健康なサンゴや行為に対して海底地形勾配を越え必要な比較の組織細胞「ベースライン」を確立しますLTH 10。 胞と呼ばれるサンゴ顔料は、吸収反映し、散乱、屈折、回折、またはその他入射太陽放射線11に干渉するように作用する。褐虫藻-色素胞内共生関係は、サンゴの動物12のための戦略的に有利な光捕集最適化と骨格成長戦略だけでなく、栄養の可塑性（栄養要求から従属栄養に前後送り戦略をシフト）の共進化を可能にした。

キュラソー南部のカリブ海の島国（オランダ領アンティル諸島の旧一部）アルバ·ラBlanquilla列島（ 図1A）トレンド東西以内に約65キロ北のベネズエラにある。キュラソーの70キロ長い南海岸は、連続モダンで新世-鮮新-更新世、完新世の古代フリンジサンゴ礁管13,14が含まれています。キュラソーで毎年恒例のSST平均は約3℃ANを変えるnually、27.5±0.5ºC（NOAA水温データセット2000-2010年）の年平均気温と1月下旬に26℃の最小値から9月上旬に29℃の最高に及ぶ。それは、以前はよく研究されてとしているため、キュラソー（ 図1A）の北西端の近くに横たわって、サンプリングのために選択されたプラヤカルキでサンゴ礁（12°22'31.63 "N、69°09'29.62" W）この場所での海洋生態系は、新鮮な非汚染海水7,15-19を浴びている。 。二つの密接に関連サンゴサンゴ種、 結核annularisとM faveolataは 、この研究での実験や分析のために選択したそれぞれの種のため、（1）棚ブレークとに関してサンゴ礁管に展示明確に異なるとオーバーラップしない海底地形分布関連した炭酸塩堆積堆積環境（M. annularis範囲= 0〜10メートルWD、M. faveolata範囲= 10〜20メートルWD 20; 図1B、2A、および2B）。 （2）カリブ海21全体で共通のサンゴ礁のフレームワークビルダーです。及び（3）よく研究された生態学的、生理学的、および進化的関係22を有している。

本研究のフィールドのサンプリングがオフショアキュラソープラヤカルキの標準スキューバダイビング技術を用いて行った。浅い対深海海底地形のトランセクトは棚ブレークオーバー、及び深海フォアサンゴ礁環境に、棚に偶然出会ったことが設立されました。 （1）3の個別Mの〜1メートル、直径サンゴヘッド：どうやら、健康なサンゴヘッドがその後を含め、この海底地形トランセクトに沿ってサンプリングのために同定された5メートルの水の深さ（WD）にあったそのすべてがannularis; Mの（2）は、3つの個別の〜1メートル、直径珊瑚faveolataは 、そのすべてが12メートルWDにあった。光合成有効放​​射（PAR）は、33から36までパーセントのPとして測定した10メートルWDで5メートル、WDと百分の18から22までの額面でのAR。 SSTは5メートルと12メートルの両方の水の深さで26℃のときのサンプリング1月に実施した。これらの6つのサンゴヘッドのそれぞれは、同等の空間的位置（6半球状のサンゴヘッドのそれぞれにすなわち 、約45°北緯）で三重にサンプリングした。各個別のサンプルを洗浄アーチパンチで採取した直径2.5cmサンゴ組織スケルトンコア生検で構成されていた。三サンゴ組織の骨格の生検は、サンゴのヘッドのそれぞれから手袋をはめた手で、標準的なスキューバでサンプリングされた（9 Mから12メートルのWDでのM. faveolataから5メートルWDと9位のコロニーをannularis）。直ちに深さで収集すると、各生検コアサンプルを密閉スクリュートップ、無菌の50mlポリプロピレン遠心管に入れ、表面に戻った。海水は、各遠心分離管からデカントし、各コア生検は、その後、浸漬保存し、4％パラホルムアルデヒド中で搬送した。

SBFIイメージングは、以前23-30無傷の骨を、全脳および全心臓、ヒト組織を含む、生物学的サンプルの広い範囲で無傷のマウス胚、ゼブラフィッシュ胚および動物試料の複数のタイプを行っていた。これらの研究の大部分は、蛍光または明視野いずれかの技術を有する光/光顕微鏡を利用した。しかし、研究は、過去31における走査型電子シリアルブロック顔画像を用いた超高倍率で行われている。本研究では、修飾SBFIプロトコルがために開発された初めてサンゴに適用した。 M.ので、 annularisとM. faveolataサンゴのポリープは、厚さ1〜2mmであり、日常的光顕微鏡技術のいずれも、サンゴのポリープ組織の厚さ全体を貫通することが可能でないであろう。そこで、具体的にはサンゴのサンプルのために設計されSBFI試料調製プロトコルを有している。さらに、当社は、カスタム実体顕微鏡ホルダーを設計したxおよびyの両方向に移動するように電動化されている。この装置ではなく、顕微鏡の前に定期的なミクロトームを使用してセクションを集めるよりも、サンプルのブロック面の画像を取ります。また、サンゴの組織の厚さ全体にわたってイメージに同じサンゴのポリープを別の非線形光学二光子顕微鏡技術を導入しました。これは、脱灰および試料調製（脱水）および処理プロトコルによって誘導され得る組織形態および量（収縮）の変化の可能性の点でSBFIによって課される制限を克服する。さらに、サンゴからの発光プロファイルは、スペクトル的に色素胞と褐虫藻の光合成の間にそれらのピークの排出量および変形を識別するために解決されました。これらの結果は、使用される方法の文脈及び取得時間に関して各自の長所、分析時間、とstrを損なうことなく、微細な構造の詳細を解決する能力で評価したサンゴ組織のuctural整合性。

プロトコル

注：試薬シリアルブロックフェイスイメージングサンゴのサンプルのために準備する

1 Preinfiltrationワックス

  1. ガラスビーカー中でステアリンフレーク3.6gのメルト。ホットプレート（60〜70℃）でよく混ぜる。
  2. スーダンIVの400 mgの追加（ワックスバックグラウンド蛍光を最小限にするため）。よく混ぜ、赤い半透明の溶液が得られるまで待つ。
  3. 96ミリリットルホット溶融パラフィン（100％）を加え、よく混ぜる。

1.2）埋め込みワックス

  1. ガラスビーカーにステアリンフレーク7.2gの溶融し、ホットプレート（60〜70℃）でよく混ぜる。
  2. スーダンIVの0.8グラムを追加します。よく混ぜ、赤い半透明の溶液が得られるまで待つ。
  3. パラフィン顆粒（162グラム）を追加し、パラフィンが完全に溶けるまで混ぜる。
  4. 白い粒状VYBARの30グラムを加え、同じビーカーに完全に溶融。溶けたら、混ぜる。
  5. 緩く蓋をガラスボトルを閉じます。 60℃の対流OVにガラス瓶を置きエンは、液体状態で成分を維持する。このオーブン内のすべての浸潤を実施する。
  6. 各100mlの二枚のガラスボトルに200mlの赤いワックスの総容量を分割します。最終的な埋め込みのために1浸潤分量やその他を使用してください。

1.3）シリアルブロックフェイスイメージング用埋め込みコーラル組織

  1. リン酸緩衝生理食塩水（3×5分）でサンゴのポリープフィールド（SIビデオ1）に回収し、（パラホルムアルデヒド中で4〜5℃で3〜6ヶ月）を記憶を洗浄したときに画像化することができる状態に脱灰。 24時間以上のポリープは、 炭酸カルシウムを全く欠いているようになるまでExCal溶液中のポリープを脱灰。サンプルを脱水する1倍キシレン代替が続く、25、50、75、および100％エタノール系に単一のブロックなど、いくつかの脱灰サンゴのポリープをインキュベートする。
  2. 100％のキシレン代替品を含有する予熱した65℃のオーブン内で処理ポリープを置きます。チャンギ二回30分間インキュベートする新鮮な溶液にngの。ポリープの上部が下方に面しており、上面はできるだけ平坦であるような方法で、ポリープを方向付ける。
  3. 1,1：1,1：2の溶液を作る2キシレン代用し、50mlファルコンチューブ内preinfiltrationワックス（ステップ1.1）。
  4. 30〜60分ごとに時間を100％のpreinfiltrationワックス中3倍インキュベートしpreinfiltrationワックスのこれら三つの濃度を増加させ、サンゴのポリープをインキュベートする。
  5. 注：試料の厚さに応じて、ステップは1.3.1-1.3.5より長い期間を増加させることができる。
  6. 100％preinfiltrationワックス中3倍のインキュベーションの後（ステップ1.2.6を参照）ワックスを埋め込むにサンプルを移動します。
  7. 30分後に埋め込むワックスを削除します。新鮮な埋め込みワックスで交換して、65℃で4時間の最小インキュベーションを続ける。

1.4）赤ワックスに埋め込み

  1. （ステンレス白ろうが配置されるトレイとサムの上にブロックを撮影PLE）が配置されます。一度ワックスに埋め込ま埋め込む赤いワックスが不透明であるように、サンプルの位置が不可視になるために必要です。
  2. 金型を埋め込む新しい予熱したステンレス鋼を中心に高融点ワックスの小滴を置き、冷却します。ステップ1.2.6で述べたように、第2の容器から新鮮に溶け埋め込むワックスを少量を注ぐ。
  3. ワックスは、プラスチック金型の表面まで来るように位置白蝋ドットの上に迅速に下向きにサンゴポリープは、次にステンレス鋼トレイにプラスチック製の試料ホルダを配置し、さらに埋め込みワックスを注ぐ。
  4. 65℃のオーブンの中から全体のセットアップを取り、ワックスが完全に硬化するまで、それがベンチや冷たい表面上で冷まします。
  5. これは一日か二日に6時間までかかる場合があります。長期保存のため、光から保護し、4℃で冷蔵庫内で乾燥さのブロックを、配置する。

1.5）シリアルブロックフェイスのセットアップでセクショニング

  1. Trはブロックイムとミクロトームを使用して1μmのセクションをカット。彼らが粉のようになるようにセクションを収集することはありません。私たちが唯一のブロック面を画像化していることを覚えておいてください。白ろうが消え始めるとサンプルが表示されます。
  2. サンプルのセクションが削除されるたびに含まれている滑らかなブロック面の画像を取り込む。サンゴポリープはSIのビデオ2のように消えるまで続けます。
  3. 録音/色素胞/サンゴポリープの自家蛍光をピックアップして、FITC蛍光フィルターを使用して白黒カメラで画像をキャプチャします。それぞれの種からの画像3-4脱灰のコアを。

二光子蛍光顕微鏡下では2イメージングサンゴ

  1. とすぐに、彼らは水の下で収穫されるように、それぞれがコレクション（海岸）の部位で4％パラホルムアルデヒド中で、直径約​​インチの周り10〜12ポリープを含む、サンゴポリープコアを修正しました。
  2. イメージングまで、4℃でサンプルを保管してください。洗浄されたコアは、目に配置されます逆さまにカバーガラスボトムディッシュでの電子と同じ溶液（0.17ミリメートルの厚さ）。
  3. 10X（0.3 NA）対物レンズを用いて780nmで励起、画像2の異なる倍率（デジタルズーム）で3〜4ポリープで2光子レーザーを使用した。形状および高さは試料（1〜2 mm）とし、撮像深度との間で変化するサンゴポリープはまた、結像対物レンズの作動距離によって制限される。
  4. XYでの焦点面あたりの画像と50〜100の画像は/ 5,000〜10,000の画像を中心に、合計10または20ミクロン間隔でのz軸を約25〜100（5×5または10×10のタイル）を収集するタイルスキャンモードを使用してくださいサンゴポリープ。
  5. コアとサンゴ種を表すためのイメージ三から四ポリープエリア。注：画像取得時間は2-5時間/ポリープエリアとの間で変化する。
  6. LSM 5は、3D画像解析およびレンダリングソフトウェアで、3Dレンダリングなどのシステムのハードディスクに、生データ形式ですべての画像を保存してください。

3次元ボリュームレンダリングとVisualizatioSBFIのnおよび二光子分光蛍光データ

  1. 収集ソフトウェア（8ビットフォーマットでファイルを保存することにより、ファイルサイズを小さくする）プログラム正方形トリミングツールを使用して、単一のポリープに着目してファイルサイズを小さくし、単一のTIFFファイルとしてコンパイルする2Dデータをトリミング。
  2. Imarisがボリュームアルゴリズムの下にモジュールを突破プログラム内SBFIデータの組み立てファイル（ステップ1.5.1収集）または（ステップ2.1.4収集）2光子光学切片のタイル張りの複数のz-スタックを開きます。
  3. 影の投影を使用して3DでレンダリングSBFIデータを投影。ボクセルは、固体表面パターン（SIビデオ3）を作成するために閾値処理された等値面モードを作成します。
  4. サンゴの3D構造と形状を明らかにするためにxz平面、XYでのクリッピング平面のアルゴリズムを使用して3D突起とyz平面の直交モードを可視化する。
  5. 同じImarisプログラム（SI Viには 、キーフレームアニメーションモジュールを使用して予測をアニメーションDEOS 3-7）。
  6. 5％の圧縮でビデオファイルを生成し、ボリュームを使用してのAVI形式のムービークリップを生成する（SIビデオ4および6）、3Dおよび等値面のモダリティ（SIビデオ5,7）。

結果

（具体的には、本研究のために製造され、 図3）、カスタム設計されたSBFI装置は、Mの外側表面の質感と形態の最初の詳細な3Dデジタル標高地図（DEMの）を生じたannularisとM. faveolatureサンゴのポリープ（ 図4とSIビデオ1-2）。これは同心円状に各ポリープ（ 図4B、4D、および4E）の中心から外側に放射するサンゴの組織の以前...

ディスカッション

サンゴ礁研究は同時物理的、化学的、および海洋環境で動作する生物学的現象の分析を含む、高度に学際的な研究努力である。複雑なサンゴ礁生態系の研究は、そのための最良のコンテキストフレームワーク（ 図10）「10の累乗」で終了する。このグラフィックコンパイルはサンゴ生態系が空間次元（10 -9 5〜10メートル）の広い範囲をカバーすることを示している。また?...

開示事項

The authors declare no conflict of interests.

謝辞

We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Coral Tissue SkeletonNoneNone2.5 cm Biopsy from natural habitat
Arch Punch Coring DeviceC.S. Osborne and CompanyNo. 149For Coral biopsy collection
ParaformaldehydeElectron Microscopy SciencesRT 1570016% Pre-diluted
Histoclear/Safeclear IIElectron Microscopy SciencesRT 64111-04Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization
Xylene and EthanolFisher ScientificFisher ScientificDehydration
Paraffin WaxRichard Allen ScientificType H REF 8338Infiltration solution
VybarThe Candle MakerNoneComponent of Red Wax
StearinThe Candle MakerNoneComponent of Red Wax
Sudan IVFisher ChemicalS667-25Red Wax-Opaque background
Wheat Germ Agglutinin (WGA)Life TechnologiesW32466For labeling  Coral Mucus
Prolong GoldLife TechnologiesP36095Anti-fade mounting media
Fluoro DishWorld Precision InstrumentsFD-35-100For two-photon imaging
XY Motor, Driver and ControllerLin Engineering211-13-01R0, R325, R256-ROXY Translational Movement
Hot PlateCorningDC-220Melting all wax
Convection OvenYamatoDX-600Infiltration and Embedding
Tissue ProcessorLeicaASP 300Dehydration, Infiltration
MicrotomeLeicaRM2055Disposable knifes
Stereo MicroscopeCarl ZeissStereolumar V 121.5x (30 mm WD) Objective
Fluorescence Microscope with ApoTomeCarl ZeissAxiovert M 200, ApoTome I SystemImaging thin section of a polyp: Zooxanthellae
Axiocam cameraCarl ZeissMRmMonochrome camera 1388x1040 pixels
Axiovision SoftwareCarl ZeissVersion 4.8Image acquisition program
Two-Photon LaserSpectraphysicsMaitai eHP, pulsed laser (70 fs)With DeepSee module
Laser Scanning MicroscopeCarl ZeissLSM 710 with Spectral Detector34 channel PMT detection
Zen SoftwareCarl Zeiss2010 or abovefor two-photon and spectral image acquisition
Imaris Suite SoftwareBitplane, Inc.,Version 7.0 or above3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization

参考文献

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