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요약

영상 기술의 통합 제품군은 카리브해 산호 Montastraea의 annularis와 M.에서 용종의 형태와 조직 구조를 결정하기 위해 적용되었습니다 faveolata. 형광, 직렬 블록 얼​​굴, 및이 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 lobate 구조 용종 벽 및 예상 chromatophore 및 주산 셀러 밀도 및 분포를 확인했다.

초록

이미징 기술의 통합 스위트 카리브해 암초 건물 산호 Montastraea의 annularis 및 M. 이루어지는 3 차원 (3D) 형태학 및 용종 조직의 세포 구조를 결정하기 위해 적용되어왔다 faveolata. 이러한 접근은 형광 현미경 (FM), 시리얼 블록 얼​​굴 영상 (SBFI), 및 2 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 (TPLSM)를 포함한다. SBFI 물리적 절편 후 깊은 조직 이미징을 제공한다; 그것은 이상 2mm의 조직 깊이에 조직 표면의 질감과 3D 시각화에 대해 자세히 설명합니다. 조직 세포 구조의 보완 FM 및 TPLSM 수율은 매우 높은 해상도의 이미지. 결과가있다 : (1) 외부 개별 산호 폴립의 벽에 이전에보고되지 않은 lobate 조직 형태학을 확인 (2) 색소, 조류와 같은 dinoflagellate의 주산 셀러의 endosymbionts의 3 차원 분포와 조직 밀도의 제 1면지도를 만들었습니다. 스펙트럼 흡수 완두콩500 nm 내지 675 nm 인 KS는 각각 제안 M. annularis와 M. faveolata 엽록소와 색소의 유사한 유형을 포함. 그러나, M. annularis와 M. 조직 밀도와 이러한 주요 세포 구성 요소의 3 차원 분포의 유의 한 차이를 나타내지 faveolata. 이미징 방법에 초점을 맞춘이 연구는 SBFI이 탈회 산호 조직의 큰 mm 크기의 샘플의 분석에 매우 유용 있음을 나타냅니다. 무료 FM 및 TPLSM는 nondecalcified 산호 조직 샘플에서 세포의 분포와 밀도의 미묘한 서브 밀리미터 규모의 변화를 알 수있다. TPLSM 기법 수득한다 : (1) 최소 침습 샘플 준비, (2) 우수한 광 단면 처리 능력, (3) 최소의 광 흡수 및 산란, 여전히 깊은 티슈 이미징을 허용하면서.

서문

지구 온난화 및 첨부 환경의 변화는 직접적으로 열대 해양 산호 1-4의 건강 및 유통에 영향을 미치는됩니다. 여러 영향 산호 표백 및 전염병 5-6의 출현을 포함하여 관찰되고있다. 그러나 이러한 환경 적 위협에 대한 미래 산호 응답의보다 정확한 예측은 조직 학적 "베이스 라인" "건강 해 보이는"산호에 대한 조직의 형태 및 세포 구성과 분포를 정의하는 설립하는 것이 필요합니다. 차례로, 산호가 다음 정량적으로 비교 될 수있다 "영향". "정상 응답이"또한 환경에 걸쳐 구배 계측 할 수 있도록 또한,이 기준선은, 다양한 환​​경 조건 하에서 외관상 건강한 산호 대해 확립되어야한다. 이 기준선을 설정 향한 초기 단계로서, 고해상도 3D 연구는 어떻게 외관상 건강한 산호 폴립 조직 수행되었다형태와 세포 조성물은 햇빛 조사량에서 수심의 증가 (WD) 및 첨부 감소에 응답합니다. 결과는 다음 산호 적응 기작보다 포괄적 이해를 설정할뿐만 아니라, 산호 공생 진화 통찰력과 광 수확의 향상을 얻기 위해 이용 될 수있다.

스토니 산호 (Scleractinia)는 공동으로 산호 7-10 holobiont이라 다른 미생물의 복잡한 조립, 호스트를 재생 식민지 해양 무척추 동물이다. 본 연구에서 수행 연구는 동시에 조직 색소의 증가 수심 분명히 건강한 호스트 산호의 공생 주산 셀러와 변경 사항을 추적하기 위해 최첨단 영상 기술의 제품군을 사용하고자한다. 이 산호 난방의 지표로 분명히 건강한 산호와 행위에 대해 수심 그라데이션을 통해 필요한 비교 조직 셀 "기준"을 설정합니다LTH 10. 산호 안료라는 색소가 흡수, 반영, 산란, 굴절, 회절, 또는 다른 사건 태양 복사 11을 방해하는 역할을합니다. 주산 셀러 - chromatophore endosymbiotic 관계는 산호 동물 (12)에 대해 전략적으로 유리한 빛 수확 최적화 및 골격 성장 전략의 공진화뿐만 아니라 영양 소성 (시프트 공급 전략 autotrophy가 heterotrophy까지 앞뒤로)를 사용할 수있다.

쿠라 카오 남부 카리브해 섬 국가 (네덜란드 령 앤 틸리 스의 이전 부분) 아루바 라 Blanquilla 열도 (그림 1A)를 동향 동서 내에서 약 65km 북쪽 베네수엘라있다. 쿠라 카오 70km 긴 남쪽 해안은 현대 지속적이고 중신 - 플라이오세 - 플라이 스토 홀로 세 고대의 언저리 산호초 기관 13, 14이 포함되어 있습니다. 큐라는 약 3 ° C 형을 변화에 연간 SST 평균nually, 27.5 ± 0.5 ºC의 연간 평균 온도, 9 월 초에 29 ° C의 최대 월 말에서 26 ° C의 최소에 이르기까지 (NOAA SST 데이터 것은 2000년부터 2010년까지 설정합니다). 이전에 잘 공부 되었기 때문에 큐라 (그림 1A)의 북서쪽 끝에 근처에 누워 야 Kalki에서 산호초 (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62"W)는, 샘플링에 선정되었다 이 위치에서 해양 생태계 신선한 nonpolluted 해수 7,15-19에서 목욕을합니다. . 두 밀접하게 관련 scleractinian 산호 종, M.의 annularis 및 M faveolata,이 연구에서 실험과 분석을 위해 선택되었다 각 종 때문에 (1) 선반 휴식과에 대한 암초 기관에 전시 분명히 다른과 겹치지 않는 수심 분포 관련 탄산염 퇴적 퇴적 환경 (M.의 annularis 범위 = 0-10미터 WD, M.의 faveolata범위 = 10~20m WD 20,도 1B, 2A 및 2B); (2) 카리브해 (21)에 걸쳐 공통의 산호초 프레임 워크 빌더입니다; (3) 잘 연구 된 생태 학적, 생리 학적, 진화 관계 (22)이있다.

본 연구를위한 필드를 샘플링은 해외 쿠라에 플라 야 Kalki의 표준 스쿠버 다이빙 기술을 사용하여 실시 하였다. 얕은 - 투 - 심해 해저 지형의 횡단면은 선반 휴식을 통해, 선반 가로 질러 그 설립하고, 깊은 물 이물 암초 환경으로 하였다. (1) 세 개인 M.의 ~ 1m 직경 산호 머리 : 분명히 건강한 산호 헤드는 다음을 포함하여이 수심 횡단면을 따라 샘플링 확인되었다 5m 수심 (WD)에 있었다 모두 annularis; M.의 (2) 개별 세 ~ 1m 직경 산호 머리 faveolata는 모두 12m WD에 있었다. 광합성 활성 복사 (PAR)는 33-36% P로 측정 하였다5m WD에서 AR과 10m WD에서 18-22%의 PAR. SST는 5m와 12m 모두의 수심에서 26 ° C를 때 샘플링 년 1 월에 실시했다. 이 여섯 산호 헤드의 각 (즉,. 육 반구형 산호 머리에 각각 약 45 ° N 위도) 동일한 공간 위치에 세중 샘플링했다. 각각의 샘플은 청소 아치 펀치 수집 2.5 cm 직경 산호 조직의 골격 코어 생검으로 구성되었다. 세 산호 조직의 골격 조직 검사가 산호 머리에서 각각 장갑을 낀 손으로 표준 SCUBA에서 샘플링되었다 (M. 9은 5m WD에서 식민지를 annularis 및 M.에서 9 12m WD에서 faveolata). 즉시 깊이에서 수령시, 각 조직 검사 코어 시료를 멸균 50 ㎖의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 넣고, 나사 정상은 밀봉하고, 표면에 돌아왔다. 해수 각 원심 관으로부터 경사 분리하고, 각 코어 생검 후, 침지 저장, 4 % 파라 포름 알데히드로 이송 하였다.

SBFI 영상은 이전에 전체 뇌 및 전체 심장 인체 조직, 그대로 마우스 배아, 얼룩말 물고기 배아, 그대로 뼈 23-30와 동물 샘플의 여러 유형을 포함하여 생물학적 시료의 넓은 범위에서 수행되었다. 형광 또는 시야 기법 중 하나와 광학 / 광학 현미경을 이용 이러한 연구의 대부분. 그러나, 연구는 지난 31 년 사형 전자 시리얼 블록 얼굴 영상을 사용하여 초고 배율에서 수행되고있다. 본 연구에서, 변성 SBFI 프로토콜이 개발되었으며 처음 산호인가. M. 때문에 annularis와 M. faveolata 산호 폴립은 두께 1-2mm 아르, 루틴 광학 현미경 기술 중 어느 것도 산호 폴립 조직의 전체 두께를 관통 할 수 없을 것입니다. 따라서, 우리는 특히 산호 샘플을 위해 설계 SBFI 샘플 준비 프로토콜을 가지고있다. 또, 정의 실체 홀더를 설계했다x와 y 방향 모두에서 동력 이동된다. 이 장치는 오히려 현미경 앞의 정규 마이크로톰을 사용하는 섹션을 수집하는 것보다 샘플 블록 얼​​굴의 화상을 얻어. 우리는 또한 산호 조직의 전체 두께에 걸쳐 이미지에 동일한 산호 폴립을 다른 비선형 광학 두 광자 현미경 기술을 소개했다. 이것은 탈회 측면과 시료 전처리 (탈수) 및 프로세싱 프로토콜에 의해 유도 될 수있다 조직 형태학 및 볼륨 (수축)의 변화의 가능성에 의해 부과 SBFI 한계를 극복한다. 또한, 산호에서 배출 프로파일은 스펙트럼 색소와 광합성 주산 셀러 사이에 절정 배출과 변화를 확인하기로 결심 하였다. 이러한 결과는 사용 된 방법의 컨텍스트 및 수집 시간에 관한 개별 장점, 분석 시간, 및 STR을 손상시키지 않고 미세 구조적 세부 사항을 해결하는 능력으로 평가 하였다산호 조직의 uctural 무결성.

프로토콜

참고 : 시약은 산호 샘플의 직렬 블록 얼​​굴 이미징을위한 준비를합니다

1 Preinfiltration 왁스

  1. 유리 비커에 스테아린 조각 3.6 g을 녹여. 핫 플레이트 (60 ~ 70 ° C에서) 잘 섞는다.
  2. 수단 IV의 400 mg의 추가 (왁스 배경 형광을 최소화하기 위해). 잘 섞어 빨간색 반투명​​ 솔루션이 달성 될 때까지 기다립니다.
  3. 96 ㎖의 뜨거운 용융 파라핀 (100 %)을 넣고 잘 섞는다.

1.2) 포함] 왁스

  1. 유리 비커에 스테아린 조각 7.2 g을 녹여 뜨거운 접시에 잘 혼합 (60 ~ 70 ° C).
  2. 수단 IV의 0.8 g을 추가합니다. 잘 섞어 빨간색 반투명​​ 솔루션이 달성 될 때까지 기다립니다.
  3. 파라핀 과립 (162g)를 추가 파라핀이 완전히 녹을 때까지 섞는다.
  4. 흰색 과립 Vybar의 30g를 추가하고 같은 비커에 완전히 녹아; 녹인 후, 혼합한다.
  5. 느슨하게 뚜껑 유리 병을 닫습니다. 60 ° C 대류 오븐에 유리 병을 배치EN은 액상 성분을 유지한다. 이 오븐의 모든 침입을 수행하십시오.
  6. 100 ㎖의 각의 두 유리 병에 200 ㎖의 빨간색 왁의 전체 볼륨을 분할합니다. 한 침투에 대한 나누어지는 최종 매립에 대한 기타를 사용합니다.

1.3) 직렬 블록 얼​​굴 이미징에 대한 임베딩 산호 조직

  1. 인산염 완충 생리 식염수에 (3 배 5 분) (파라 포름 알데히드 4-5 ° C에서 3-6개월) 산호 분야 (SI 비디오 1)에서 수집 및 저장 폴립을 씻고 준비가 이미지를 만들 때 석회. 24 시간 동안이나 용종의 CaCO3의 완전히없는만큼 때까지 ExCal 솔루션의 폴립을 석회. 샘플을 탈수 1X 크실렌 대체 한 후, 25, 50, 75, 및 100 % 에탄올 시리즈에서 단일 블록으로 여러 탈회 산호 폴립 부화.
  2. 100 % 자일 렌의 대체를 포함하는 예열 65 ° C의 오븐에서 처리 된 용종을 놓습니다. 창이에 의해 두 번 30 분 동안 품어신선한 용액에 겨. 폴립의 상부면 아래 및 상부 표면은 가능한 평탄한되는 방식으로 용종의 방향.
  3. 1, 1 : 1 및 1 : 2의 용액을 2 크실렌 대체물 및 50 ㎖의 팔콘 튜브에서 preinfiltration 왁스 (단계 1.1).
  4. 30 ~ 60 분마다 100 %의 preinfiltration 왁스의 3 배 인큐베이션 preinfiltration 왁스의 세 가지 농도를 증가, 산호 폴립을 품어.
  5. 주의 : 샘플의 두께에 따라, 단계 1.3.1-1.3.5 장기간에 따라 증가 될 수있다.
  6. 왁스를 포함하는 샘플을 이동 100 % preinfiltration 왁스의 3 배 배양 후에 (단계 1.2.6 참조).
  7. 30 분 후 삽입 왁스를 제거합니다. 신선한 삽입 왁스로 교체하고 65 ° C에서 4 시간의 최소 배양을 계속합니다.

1.4) 레드 왁스에 포함하기

  1. 블록 (흰색 왁스 배치와 상단에있는 스테인리스 스틸 트레이를 촬영하는의 샘를 들어)이 배치된다. 일단 왁스에 매립하기 때문에 필요한 샘플의 위치는 매립 붉은 왁스가 불투명으로 보이지 않게된다.
  2. 새로운 예열 된 스테인레스 스틸 삽입 금형 주위에 고 융점 왁스의 작은 방울을 넣고 식 힙니다. 단계 1.2.6에서 언급 한 바와 같이 제 2 용기에서 갓 녹은 내장 왁스의 작은 볼륨을 붓는다.
  3. 흰색 왁스 점 이상 빠르게 아래로 향하게 산호 폴립의 위치를​​ 다음 스테인리스 쟁반에 플라스틱 샘플 홀더를 배치하고 왁스는 플라스틱 금형의 표면까지 오도록 더 삽입 왁스를 붓는다.
  4. 65 ° C의 오븐에서 전체 설치를 타고 왁스가 완전히 경화 될 때까지 벤치 또는 차가운 표면에 냉각 할 수 있습니다.
  5. 이것은 하루 이틀에 6 시간 최대 걸릴 수 있습니다. 장기 저장을 위해 빛으로부터 보호 4 ° C에서 냉장고에 건조 된 블록을, 놓습니다.

1.5) 직렬 블록 얼​​굴 설정에서 단면

  1. TR블록 메신저 및 마이크로톰을 사용하여 1 μm의 섹션을 잘라. 그들은 분말처럼 될 것 같은 부분을 수집하지 마십시오. 우리는 단지 블록의 얼굴을 이미지화하는 것을 잊지 마십시오. 흰색 왁스가 사라지기 시작할 때 샘플이 나타납니다.
  2. 샘플보기 부분이 제거 될 때마다 블록이 포함 매끄러운면의 이미지를 캡처. 산호 폴립은 SI 비디오 2에서 사라질 때까지 계속합니다.
  3. 녹화 / 색소 / 산호 폴립의 자동 형광을 데리러 FITC 형광 필터를 사용하여 흑백 카메라로 이미지를 캡처합니다. 이미지 각 종에서 3-4 탈회 코어.

2 이미징 산호에서 두 개의 광자 형광 현미경

  1. 즉시 물에서 수확 각 컬렉션 (바다 해안)의 사이트에서 4 % 파라 포름 알데히드에 직경 인치에 대해 약 10 ~ 12 폴립을 포함, 산호 폴립 코어를 수정합니다.
  2. 영상까지 4 ° C에서 샘플을 보관하십시오. 세탁 코어는 일에 배치됩니다거꾸로 커버 유리 바닥 접시에 전자 같은 용액 (0.17 mm 두께).
  3. 10 배 (0.3 NA) 목표를 사용하여 780 nm의 여기, 이미지 두 개의 서로 다른 배율 (디지털 줌)에서 3-4 폴립에서 두 광자 레이저를 사용. 산호 폴립 형상과 높이도 촬상 대물의 작동 거리에 의해 제한되는 샘플 (보통 1~2밀리미터) 및 촬상 깊이 사이에서 변한다.
  4. 주위 5,000-10,000 이미지를 총, 10, 20 μm의 간격으로 z 축 통해 XY의 초점면 당 이미지와 50 ~ 100 이미지를 약 25 ~ 100 (5 × 5, 10 × 10 타일)를 수집하기 위해 타일 스캔 모드를 사용 / 산호 폴립.
  5. 네 용종 지역 이미지 셋은 코어와 산호 종을 나타냅니다. 참고 : 이미지 획득 시간은 2-5 시간 / 용종 지역마다 다릅니다.
  6. LSM 5는 3D 이미지 분석 및 렌더링 소프트웨어에서 3D 렌더링으로 시스템의 하드 디스크에 원시 데이터 형식으로 모든 이미지를 저장합니다.

3 차원 볼륨 렌더링과 VisualizatioSBFI의 n 및 두 개의 광자 형광 스펙트럼 데이터

  1. 프로그램 사각형 자르기 도구를 사용하여 하나의 용종에 포커스함으로써 파일 크기를 줄이고 컴파일 단일 TIFF 파일로 수집 소프트웨어 (8 비트 형식으로 파일을 저장하여도 파일 크기를 감소)하는 2D 데이터 자르기.
  2. Imaris 볼륨 알고리즘에 따라 모듈을 능가 프로그램에 SBFI 데이터의 조립 파일 (1.5.1 단계에서 수집) 또는 (2.1.4 단계에서 수집 된) 두 광자 광학 부분의 타일 여러 Z-스택을 엽니 다.
  3. 그림자 투영을 사용하여 3D 렌더링 SBFI 데이터를 전망이다. 복셀은 고체 표면 패턴 (SI 비디오 3)을 만들 역치 아르있는 isosurface 모드를 만듭니다.
  4. 산호의 3 차원 구조와 형태를 나타 내기 위해 XZ, XY에서 클리핑면 알고리즘을 사용하여 3D 돌기, 그리고 YZ 직교 모드를 시각화.
  5. Imaris 동일한 프로그램 키 프레임 애니메이션 모듈을 사용하여 돌기에 애니메이션 (SI 바이DEOS 3-7).
  6. 5 % 압축에서 비디오 파일을 생성하고 볼륨을 사용하여 AVI 형식의 동영상 클립을 생성 (SI 동영상 4 및 6), 3D 및있는 isosurface 양식 (SI 동영상 5, 7).

결과

(본 연구를 위해 특별히 제조 된 그림 3) 사용자 정의 설계 SBFI 장치는 M.의 외부 표면의 질감과 형태의 첫번째 상세한 3D 디지털 고도지도 (DEM을)를 생산 annularis와 M. faveolature 산호 폴립 (그림 4 및 SI 동영상 1-2). 이것은 각각의 동심 폴립 (도 4B, 4D 및 4E)의 중심으로부터 외측 방사 산호 조직되지 않았던 이전 누적 로브 이미지를 수득 하...

토론

산호초 연구는 해양 환경에서 작동을 동시에 물리적, 화학적 분석, 생물학적 현상을 포함하는, 고도의 학제 적 연구 노력이다. 복잡한 산호초 생태계의 연구는 따라서 최선의 상황에 맞는 프레임 워크 (그림 10) '10의 멱수'내에 완료됩니다. 이 그래픽 편집 산호 생태계 차원 공간의 넓은 범위 (10 -9 10 5m)를 다루고 있음을 보여줍니다. 또한,이 운동은 geobiological 필?...

공개

The authors declare no conflict of interests.

감사의 말

We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Coral Tissue SkeletonNoneNone2.5 cm Biopsy from natural habitat
Arch Punch Coring DeviceC.S. Osborne and CompanyNo. 149For Coral biopsy collection
ParaformaldehydeElectron Microscopy SciencesRT 1570016% Pre-diluted
Histoclear/Safeclear IIElectron Microscopy SciencesRT 64111-04Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization
Xylene and EthanolFisher ScientificFisher ScientificDehydration
Paraffin WaxRichard Allen ScientificType H REF 8338Infiltration solution
VybarThe Candle MakerNoneComponent of Red Wax
StearinThe Candle MakerNoneComponent of Red Wax
Sudan IVFisher ChemicalS667-25Red Wax-Opaque background
Wheat Germ Agglutinin (WGA)Life TechnologiesW32466For labeling  Coral Mucus
Prolong GoldLife TechnologiesP36095Anti-fade mounting media
Fluoro DishWorld Precision InstrumentsFD-35-100For two-photon imaging
XY Motor, Driver and ControllerLin Engineering211-13-01R0, R325, R256-ROXY Translational Movement
Hot PlateCorningDC-220Melting all wax
Convection OvenYamatoDX-600Infiltration and Embedding
Tissue ProcessorLeicaASP 300Dehydration, Infiltration
MicrotomeLeicaRM2055Disposable knifes
Stereo MicroscopeCarl ZeissStereolumar V 121.5x (30 mm WD) Objective
Fluorescence Microscope with ApoTomeCarl ZeissAxiovert M 200, ApoTome I SystemImaging thin section of a polyp: Zooxanthellae
Axiocam cameraCarl ZeissMRmMonochrome camera 1388x1040 pixels
Axiovision SoftwareCarl ZeissVersion 4.8Image acquisition program
Two-Photon LaserSpectraphysicsMaitai eHP, pulsed laser (70 fs)With DeepSee module
Laser Scanning MicroscopeCarl ZeissLSM 710 with Spectral Detector34 channel PMT detection
Zen SoftwareCarl Zeiss2010 or abovefor two-photon and spectral image acquisition
Imaris Suite SoftwareBitplane, Inc.,Version 7.0 or above3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization

참고문헌

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