ディープティシュ人間血管造影および機能前臨床研究のためのユニバーサルハンドヘルド三次元光音響イメージングプローブリアルタイムで

要約

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

要約

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today’s preclinical research and clinical practice.

概要

光音響（光音響）イメージング技術^1-5が提供するユニークな利点を活用する新しいアプリケーションのさまざまな出版物を網羅増え続けることで明示されるよう、生物学および医学研究コミュニティからの関心の高まりを魅了しています。具体的には、はるかに光の拡散限界を超えた深さで高時空間解像度の画像スペクトル的に独特の光吸収剤の能力は、機能と分子イメージング^6-10前例のない機能を開きます。

実際、臨床診療への光音響技術の翻訳は多くの疾患の診断および治療のモニタリングに有望な見通しが付属しています。しかし、光学的に散乱された光子を吸収組織や光音響現象に関連した一般的に弱い応答の限られた伝播は、この方法の適用可能な深さを制限。結果として、ハンドヘルドoptoa内視鏡システムは、自然のオリフィス¹³を介してそれらを挿入することによって、身体内から画像を提供するために使用されている間cousticプローブボディ^11,12の外部からアクセス可能な画像部分に試みられてきた。そのような女性の胸のような人間の体の一部の低吸収部も、断層光音響スキャナ^14,15でアクセスできます。それは同様に超音波検査を、大きな汎用性を可能にするので特に興味深いのは、手持ち式のアプローチである。ここでは、光音響イメージングのための一般的な超音波リニアアレイプローブの適応は、主に超音波およびoptoacoustics間の断層画像化要件の根本的な違いにより、依然として厳しい。標準的な超音波検査の高いフレームレートはkHzの範囲で高いパルス繰り返し周波数を用いた送受信シーケンシャル方式で有効にされているが、リアルタイムの三次元光音響イメージングは​​、単一のintから体積断層撮影データを同時に収集することにより達成されるレーザーパルスをerrogating。これにより、高品質の光音響イメージングは​​、撮像対象の周りに可能な限り大きな立体角から3次元データの取得を意味する。

最近、我々はリアルタイムで^16を 3次元（体積）イメージングのための最初のハンドヘルド光音響プローブを導入しました。システムは、90°の角度をカバーする球面上に配置された圧電素子256（ 図1A中の青色のドット）の二次元配列に基づいている。約3×3mmの²の個々の要素の大きさ、ならびにそれらの配向および周波数帯域幅（約2-6メガヘルツ）は、 図中の球体の中心（黒立方体を囲むセンチメートルスケールのボリュームから有効な信号収集を保証する1A）。任意の波長SUSCように、撮像領域の光学的励起は、アレイの中央の円筒形キャビティを通って挿入繊維束を備えて​​いる繊維束を透過するのeptibleは、イメージングのために使用することができる。光ファイバ束と共にトランスデューサのアレイの実際の画像は、 図1Bに示されている。レーザーのパルス繰り返し周波数で決まるフレームレートでリアルタイムイメージングは​​さらに、グラフィックスを用いて有効にされるように、効率的な励起および信号の同時検出は、シングルショット励起（一方のレーザーパルス）と深部組織イメージングを可能にする処理ユニット（GPU）再建手続き¹⁷の実装。透明なポリエチレン膜（ 図1C）を有する円筒状ケーシングは、音響的に送信する液体媒体（水）を囲むように、トランスデューサアレイに接続されている。膜はさらに音響ゲルを用いて組織に結合されている。手持ち式の動作モードで使用されているような光音響プローブの画像が図1Dに示されている。

実証THR臨床診断および潜在的な用途の数の重要な利点が付属してリアルタイム機能イメージング能力と組み合わせるeeの次元ハンドヘルド光音響イメージングは​​、例えば、末梢血管疾患などの種々の適応症、リンパ系障害、乳癌、皮膚病変のために想定されている炎症または関節炎^18。さらに、高速撮像能力は静止位置に配置されたプローブを用いた動的な生物学的事象の可視化を可能にします。高速波長同調光パラメトリック発振器（OPO）レーザー技術と組み合わせて、このアプローチは、光吸収剤の生体内分布のリアルタイムイメージングを可能にする。これにより、新たな可能性は等しく、例えば 、小動物イメージング用途に出現することができる。、組織血行動態を研究する、 インビボでの細胞追跡、薬物動態、臓器灌流の視覚化は、腫瘍及び心臓血管系、または神経画像の分子イメージング標的。

本研究では、いくつかの典型的な臨床および小動物イメージングシナリオで球状のアレイ光音響ハンドヘルドプローブとショーケースパフォーマンスで動作するように実験的な撮影プロトコルの詳細な記述を提供する。

プロトコル

体積ハンドヘルド光音響プローブを動作させるための詳細な手順については後述する。この手順は、動物およびヒトの実験に関する承認された制度的規制に従って行われる。

1.システムの準備

1. 出力光ビームを安定化させるための操作前〜15分のウォームアップ期間のためのレーザーのスイッチを入れる。
2. 皮膚（ 図1）と接触している隔離膜で一部を囲む水を置きます。
   NOTE：（皮膚接触）分離膜とトランスデューサ（球形プローブの中心）の最大感度を有する領域との間の距離は、有効撮像深さを確立する。
3. ポンプを用いて脱イオン水を用いて単離した膜と変換器の表面との間に約100mlの全容積を満たす。
4. 水漏れでも気泡がpresaの複数形されていないことを確認NT。あるいは、水の循環を提供することにより、気泡を避ける。
5. 室温で実験を実施し、この温度に維持される結合媒体（水）を確保する。

2.イメージングの準備

1. 人間の撮影準備。
2. 画像内の望ましくないバックグラウンドを避けるために、脱毛ローション付きツー·画像化することが部分から毛を削除します（このステップはオプションです）。
3. 効果的な音響結合を提供するために、画像化される領域の周りの皮膚に超音波ゲルを適用する。関心領域内の光音響プローブを配置します。気泡が超音波カップリングゲル中に存在しないことを確認してください。
4. 動物の撮影準備。
5. 動物とのケアと実験手順は、制度や政府の規則や規制と一致していることを確認してください。
6. シェービングローションで画像化される領域での動物の毛皮を削除します。で動物の目を保護超短パルスレーザ放射への暴露から乾燥や損傷を防止獣医軟膏、。
7. 0.9リットルでケタミン/キシラジン体積（100 mg / kgをkgのケタミン+ 5mg / kgのキシラジンKG）は、実験に先立って、または使用イソフルラン麻酔（2-3％（）の腹腔内注射（IP）を使用して動物を麻酔/実験中の最小ガス流量）。動物の後肢の反射をチェックすることにより、麻酔を確認します。
8. 効果的な音響結合を提供し、関心領域内の光音響プローブを配置するために画像化される領域の周りの皮膚に超音波ゲルを適用する。気泡が超音波カップリングゲル中に存在しないことを確認してください。

3.プリビュー動作モード

1. 690 nmおよび900 nmおよび10および50 Hzのパルス繰り返し率と撮像波長（複数可）を確立する。音響データ収集システムのためのパラメータを選択します - 1MΩ入力インピーダンス。第12ビットの垂直分解能あたり40メガサンプルのサンプリングレートで各レーザパルス2030のサンプルを取得する。レーザーのQスイッチ出力と取得をトリガーする。
2. オペレータと患者の両方が光励起波長（群）に適合した保護メガネを使用していることを確認してください。人体実験¹⁹の安全曝露限界を満たすために及び動物における熱ひずみおよび皮膚損傷を防止するために、組織表面での光のフルエンスは、近赤外波長について、実験中は20mJ / cm ²程度以下に維持されるように、レーザパワーを設定する。
3. レーザーのパルス繰り返しレートに対応するフレームレートで三次元画像を可視化できるようにする処理アルゴリズムのGPU実装とプリビューソフトウェアを起動します。
4. プローブおよび/または可視化の性能を最適化し、目的の構造を局所化するために、撮像対象を移動させる。

4.データ収集

1. （ハンドヘルド）モードを走査するためのデータ収集。
2. 必要であれば、関心領域のコントラストを豊かにするための取得に先立って造影剤を注入する。
   注：私たちの実験では、我々は造影人間イメージングを行っていない。しかし、様々な造影剤は、潜在的にこの目的に使用することができる。インドシアニングリーン（ICG）は、成人の体重を2mg / kgでの最大推奨用量でのコントラストの強調のために使用することができる臨床的に承認された光学造影剤の一例である。
3. プレビューソフトウェアの実行を維持し3.1で説明したパラメータを持つデータ取得のためのハードウェアを起動します。静かに関心のある構造を追跡するために、画像化領域の周囲にプローブを移動させる。
   注：複数のレーザ波長で画像を同時に取得されると、ハンドヘルドモードでのプローブの運動の速度は、（好ましくは2mm /秒未満に著しく減少されなければならないスペクトル的に混合されていない画像の動きに関連するアーチファクトを回避するために、50Hzのレーザパルス繰返し率）である。
4. 定常モードのためのデータ収集。
5. ホルダーに、撮像対象（ 例えば 、動物）とハンドヘルドプローブをマウントし、プレビューソフトウェアの実行を維持し3.1で説明したパラメータを使用して取得を開始します。
6. 関心領域内の動的な生物学的事象を可視化するために、実験中の同じ位置における光音響プローブと撮像部を保持する。
7. 関心領域内の動的配布を追跡するために造影剤を注入する。
   注：我々のマウス実験では、インドシアニングリーン（ICG）はコントラスト強調のために使用した。一般的なガイドラインとして、ICGの10ナノモル、または0.4〜10mg / kgの量は、in vivoでのマルチスペクトルoptoacousticsで検出可能なコントラストを作成するために、マウスの循環中に導入されなければならない。
   注：造影剤は、でなければなりませんそれぞれの機関によって、ヒトおよび/または動物の使用のために承認した。

5.実験ファイナライズ

1. レーザーを停止します。
2. 撮像された領域から光音響プローブを除去。動物実験では、麻酔の供給を停止する。
3. 暖かいそれを維持し、それが完全に麻酔から回復するまで他の動物との接触を防ぐために、赤外線ヒーターの下に動物を配置します。麻酔からの回復中に無人の動物を放置しないでください。

6.オフラインデータ処理

1. データ処理に使用されるソフトウェアアプリケーションで取得した光音響信号を含むファイルを読み込む。
2. 各フレームおよび各波長に対する光吸収のボリュメトリック画像に対応する3次元マトリクス配列を得るために再構成アルゴリズムを使用する。
   注：再構成のために、そのようなheterogeneなどの要因を歪ませるためのアルゴリズムのアカウンティングを使用することが好ましい吸収されたエネルギー分布のより定量的な表現を得るために、撮像対象でITIES減衰、最終的な帯域幅と検出素子と光フルエンス変動の幾何学的形状の影響。
3. 各多波長フレーム、試料中に存在する各吸収性物質の光吸収を表す3次元マトリックスアレイの新しいセットから、取得するアンミキシングアルゴリズムを使用する。
4. 必要に応じて、さらなる生物学的に関連するパラメータの可視化および読み取りを容易にするために、光吸収分布を表す行列アレイを処理する。

結果

代表的な結果は、説明した容積ハンドヘルド光音響プローブの能力を実証し、このセクションで紹介されています。全ての場合において、皮膚表面上の光のフルエンスを20mJ / cm ²と¹⁹の安全曝露限界以下に維持した。

ヒト末梢血管系の追跡リア ​​ルタイムでプローブの性能は、図2に紹介されている。この実験の過程で、プローブをゆっく?...

ディスカッション

小動物研究に光音響イメージング技術によって提供されるユニークな利点は、 例えば想定診断と治療モニタリングアプリケーションの数と、臨床の実践に技術を変換するための強力な動機を作成している。、乳癌および皮膚癌、炎症または末梢血管疾患で。しかし、効果的な断層像取得ジオメトリを作成するための照明源と検出素子の十分な数で囲むことができるマウス又は小さな動...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Optical parametric oscillator (OPO)-based laser	Innolas Laser GmbH, Krailling (Germany)	custom-made	The laser provides laser pulses with a duration around 10ns and an energy up to 80mJ. The wavelength is tunable between 680-950nm.
Spherical array of piezocomposite detectors	Imasonic SaS, Voray (France)	custom-made	The array consists of 256 piezoelectric sensors distributed on a spherical surface. Each element has dimensions 3x3mm2, a central frequency of 4MHz and a bandwidth of 100%.
Data acquisition system (DAQ)	Falkenstein Mikrosysteme GmbH, Taufkirchen (Germany)	custom-made	The DAQ simultaneously acquires 256 signals at 40 megasamples per second and 2030 samples. The input impedance is 1MW.
Fiber bundle	CeramOptec GmbH, Bonn (Germany)	custom-made	The bundle consists of 480 individual fibers randomly distributed in the input and output. The numerical aperture of each individual fiber is 0.22.
Athymic Nude mouse	Harlan Laboratories (The Netherlands)	Athymic nude - Foxn1nu	The mouse was 8 weeks old (adult) at the time of the experiment. The ethical protocol was approved by the Bavarian goverment (number 55.2.1.54-2632-102-11)
Bepanthen cream	Bayer AG (Germany)	N/A	Vet ointment to protect the eyes during anesthesia
Data processing software	Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA)	custom-made	The data processing software was devoped at our institute. It allows reconstruction at each wavelength and multi-wavelength unmixing, as well as further data processing.
Water-enclosing part	N/A	custom-made	This part contains the water that acts as an acoustic coupling medium between skin and transducer elements
Indocyanine green (ICG)	PULSION Medical Systems SE	N/A	ICG-PULSION (active ingredient: indocyanine green dye) is a drug used in cardiac, circulatory and micro-circulatory diagnostics, liver function diagnostics and ophthalmic angiography diagnostics.