Universal de mão tridimensional Optoacoustic imagem Sonda para Deep Tissue Angiografia Humano e Estudos pré-clínicos funcionais em Tempo Real

Resumo

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Resumo

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today’s preclinical research and clinical practice.

Introdução

Optoacoustic (fotoacústica) imagem atrai crescente interesse das comunidades de pesquisas biológicas e médicas, como manifestado pelo número cada vez maior de publicações que abrangem grande variedade de novas aplicações que exploram as vantagens únicas oferecidas pela tecnologia ^1-5. Em particular, a capacidade de imagem agentes espectralmente distintos de absorção de fotos com resolução espaço-temporal alta em profundidades muito além do limite de difusão de luz abre capacidades inéditas de imagem funcional e molecular ^6-10.

Na verdade, a tradução da tecnologia optoacoustic na prática clínica vem com perspectivas promissoras no diagnóstico e monitoramento do tratamento de muitas doenças. Contudo, a propagação limitado de fotões no espalhamento opticamente absorventes e tecidos e as respostas fracas geralmente associados com o fenómeno optoacoustic limitar a profundidade do método aplicável. Como resultado, optoa de mãoCoustic sondas foram tentadas a partes da imagem acessíveis a partir do exterior do corpo, enquanto os sistemas de ^11,12 endoscópicos são utilizados para fornecer imagens a partir de dentro do corpo, inserindo-os através de orifícios naturais ^13. Algumas partes baixa absorção do corpo humano, tais como a mama feminina, também são acessíveis por scanners optoacoustic tomográficas ^14,15. De particular interesse é a abordagem de mão, uma vez que permite grande versatilidade, de forma semelhante para ultra-sonografia. Aqui, a adaptação do ultra-som comum sondas lineares de matriz para a imagem latente optoacoustic continua sendo um desafio, principalmente devido a diferenças fundamentais em requisitos de imagens tomográficas entre ultra-som e optoacoustics. Embora altas taxas de quadros em ultra-sonografia padrão são ativadas por sequencial de transmissão-recepção esquemas que empregam freqüências de repetição de pulso de alta na faixa de kHz, imagem optoacoustic em tempo real tridimensional é obtida pela coleta simultânea de dados tomográfica volumétrica de um único interrogating pulso de laser. Assim, a alta qualidade de imagem optoacoustic implica aquisição de dados tridimensionais do maior ângulo sólido possível em torno do objeto fotografado.

Recentemente, lançamos a primeira sonda optoacoustic portátil para tridimensional (volumétrico) de imagem em tempo real, ^16. O sistema baseia-se numa matriz bidimensional de elementos piezoeléctricos 256 dispostos em cima de uma superfície esférica (pontos azuis na Figura 1A), abrangendo um ângulo de 90 °. O tamanho dos elementos individuais de cerca de 3 mm x 3 mm ^2, bem como a sua orientação e largura de banda de frequência (cerca de 2-6 MHz) garante compilação de sinal eficaz de um volume centímetro escala em torno do centro da esfera (cubo negro na figura 1A). Excitação óptica da região de formação de imagens é fornecida com um feixe de fibras inseridas através de uma cavidade cilíndrica central da matriz, de modo que qualquer comprimento de onda susceptible de ser transmitido através do feixe de fibra pode ser usado para geração de imagens. Uma imagem real do conjunto de transdutores, juntamente com o feixe de fibras ópticas está representado na Figura 1B. A excitação eficiente e detecção simultânea de sinais de imagem permite-tecidos profundos com excitação de um único tiro (um pulso de laser), de modo que imagens em tempo real em uma taxa de quadros determinado pela frequência de repetição do pulso do laser é ainda habilitado com um gráficos- processamento em unidade (GPU) aplicação do procedimento de reconstrução ^{de 17.} Um invólucro cilíndrico com uma membrana de polietileno transparente (Figura 1C) está ligado ao conjunto de transdutores para incluir um meio líquido acusticamente transmissão (água). A membrana é ainda acoplado ao tecido por meio de gel de acústica. Uma imagem da sonda optoacoustic como sendo utilizado no modo de operação manual é mostrado na Figura 1D.

O thr demonstraramee imagiologia tridimensional de mão optoacoustic combinado com a capacidade de imagiologia funcional em tempo real possuem vantagens importantes para diagnósticos clínicos e um número de aplicações potenciais são previstos para várias indicações, tais como a doença vascular periférica, do sistema linfático, do cancro da mama, lesões de pele, inflamação ou artrite ^18. Além disso, a capacidade de imagiologia rápido permite a visualização de eventos biológicos dinâmicos com a sonda disposta numa posição estacionária. Combinado com rápido comprimento de onda-tuning oscilador paramétrico ótico (OPO), tecnologia laser, esta abordagem permite imagens em tempo real de biodistribuição de agentes de absorção de fotos. Desse modo, novas possibilidades podem surgir igualmente em aplicações pequenas de imagem animal, por exemplo., No estudo da hemodinâmica tecido, in vivo rastreamento celular, visualização de farmacocinética, a perfusão dos órgãos, alvo de imagem molecular de tumores e sistema cardiovascular, ou neuroimagem.

Neste trabalho, fornecer uma descrição detalhada do protocolo experimental de imagem para operar com a sonda e mostra o desempenho de mão optoacoustic matriz esférica em vários cenários clínicos e de imagem de animais pequenos típicos.

Protocolo

O procedimento detalhado para a operação com a sonda optoacoustic de mão volumétrica é descrito abaixo. Este procedimento é realizado de acordo com os regulamentos institucionais aprovados em relação experimentos em animais e humanos.

1. Sistema de Preparação

1. Ligue o laser por um período de aquecimento de ~ 15 min antes da operação para estabilizar o feixe de luz de saída.
2. Coloque a parte da água com a membrana que envolve o isolamento que está em contacto com a pele (Figura 1).
   NOTA: A distância entre a membrana de isolamento (em contacto com a pele) e a região com o máximo de sensibilidade do transdutor (centro da sonda esférica) estabelece a profundidade da imagem efectiva.
3. Encha todo o volume de aproximadamente 100 ml de isolamento entre a membrana e a superfície do transdutor com água desionizada por meio de uma bomba.
4. Certifique-se de que não há vazamento de água nem bolhas de ar são present. Alternativamente, evitar bolhas de ar, proporcionando recirculação de água.
5. Realizar as experiências à TA e assegurar o meio de acoplamento (água) é mantida a esta temperatura.

2. Preparação de Imagem

1. Preparação imagiologia humana.
2. Remover os pêlos da parte a-ser-fotografada com uma loção de depilação, a fim de evitar uma indesejada no fundo das imagens (este passo é opcional).
3. Aplicar gel de ultra-som para a pele em torno da região a ser trabalhada, a fim de proporcionar acoplamento acústico eficiente. Coloque a sonda optoacoustic na região de interesse. Certifique-se de que não há bolhas de ar estão presentes no gel de acoplamento de ultra-som.
4. Preparação animal de imagem.
5. Assegurar que os procedimentos de cuidados e experimentais com animais estão de acordo com as regras e regulamentos institucionais e governamentais.
6. Remover o pêlo do animal, na região a ser trabalhada com uma loção de barbear. Proteger os olhos do animal compomada veterinário, o que evita o ressecamento e danos da exposição à intensa radiação laser pulsado.
7. Anestesiar o animal usando injecção intraperitoneal (IP) de cetamina / xilazina (100 mg / kg de KG Cetamina + 5 mg / kg de KG Xilazina) antes da experiência ou utilizar a anestesia de isoflurano (2-3% (por volume) com 0,9 l / fluxo de gás min) durante a experiência. Confirmar anestesiados, verificando o reflexo do membro posterior do animal.
8. Aplicar gel de ultra-som para a pele em torno da região a ser trabalhada, a fim de proporcionar acoplamento acústico eficiente e colocar a sonda optoacoustic na região de interesse. Certifique-se de que não há bolhas de ar estão presentes no gel de acoplamento de ultra-som.

3. Pré-view Modo de Operação

1. Estabelecer o comprimento de onda (s) de imagem entre 690 nm e 900 nm e a taxa de repetição do pulso entre 10 e 50 Hz. Selecione os parâmetros para o sistema de aquisição de dados acústicos - 1 mohmsimpedância de entrada. Adquirir 2030 amostras para cada pulso de laser a uma taxa de amostragem de 40 megasamples por segundo e 12 bits resolução vertical. Desencadear a aquisição com saída Q-switch do laser.
2. Certifique-se de que o operador e para o paciente utilizar óculos de protecção adaptado para o comprimento de onda (s) de excitação óptica. Definir a potência do laser, de modo que a fluência da luz na superfície do tecido é mantida abaixo de 20 mJ / cm ² durante a experiência para os comprimentos de onda do infravermelho próximo, de modo a satisfazer os limites de exposição de segurança para as experiências ¹⁹ e humanos para prevenir a deformação térmica e os danos da pele em animais .
3. Inicie o software de pré-visualização com a implementação de algoritmos de processamento de GPU para permitir a visualização de imagens tridimensionais em uma taxa de quadros que corresponde à taxa de repetição do pulso do laser.
4. Mover a sonda e / ou o objecto a ser trabalhada, a fim de optimizar o desempenho de visualização e localizar as estruturas de interesse.

4. Aquisição de Dados

1. A aquisição de dados para o modo de varredura (de mão).
2. Se necessário, injectar um agente de contraste antes da aquisição para enriquecer o contraste na região de interesse.
   NOTA: Em nossos experimentos, não ter realizado imagem humana com contraste. No entanto, vários agentes de contraste pode ser potencialmente utilizado para esta finalidade. Indocianina verde (ICG) é um exemplo de agente de contraste óptico clinicamente aprovados que podem ser utilizados para o realce de contraste na dose máxima recomendada de 2 mg / kg de peso corporal em adultos.
3. Iniciar o hardware de aquisição de dados com os parâmetros descritos na manutenção de 3,1 a execução do programa de pré-visualização. Mova suavemente a sonda ao redor da região fotografada para acompanhar as estruturas de interesse.
   NOTA: Quando as imagens em múltiplos comprimentos de onda laser são adquiridos em simultâneo, a velocidade do movimento da sonda em modo de mão tem de ser diminuída significativamente (de preferência inferior a 2 mm / segpara uma taxa de repetição de impulsos de 50 Hz a laser), a fim de evitar artefactos relacionados com o movimento nas imagens espectralmente não misturados.
4. A aquisição de dados para o modo estacionário.
5. Montar o objecto digitalizado (por exemplo., De origem animal) e a sonda de mão até o suporte de iniciar a aquisição e com os parâmetros descritos em 3.1, mantendo a execução do programa de pré-visualização.
6. Manter a sonda optoacoustic e a parte de imagem, na mesma posição durante a experiência para visualizar os eventos biológicos dinâmicos da região de interesse.
7. Injectar um agente de contraste para rastrear a sua distribuição dinâmica na região de interesse.
   NOTA: Em nossos experimentos rato, Indocianina verde (ICG) foi utilizado para aumento de contraste. Como orientação geral, uma quantidade de 10 nmol ou 0,4 mg / kg de ICG tem de ser introduzido na circulação do rato, de modo a criar um contraste com detectável optoacoustics multi-espectrais in vivo.
   NOTA: O agente de contraste deve seraprovado para uso humano e / ou animal pela respectiva entidade.

5. Finalizando o Experimento

1. Pare o laser.
2. Remova a sonda optoacoustic da região trabalhada. Para o estudo animal, interromper o fornecimento de anestesia.
3. Posicione o animal sob um aquecedor de infravermelhos para mantê-lo aquecido e evitar o contato com outros animais, até que totalmente recuperado da anestesia. Não deixe o animal sozinho durante a recuperação da anestesia.

6. Off-line de Processamento de Dados

1. Carregar o arquivo (s) contendo os sinais optoacoustic adquirida com a aplicação de software utilizado para processamento de dados.
2. Usar um algoritmo de reconstrução para se obter um conjunto de matriz tridimensional correspondente a uma imagem volumétrica da absorção óptica para cada quadro e cada comprimento de onda.
   NOTA: Para a reconstrução é preferível usar um algoritmo representando factores de distorção, como heterogenedades e atenuação no objecto fotografada, efeitos de largura de banda final e forma geométrica dos elementos de detecção de luz e variações de fluência, de modo a obter uma representação mais quantitativa da distribuição da energia absorvida.
3. Usar um algoritmo desmistura obter, a partir de cada trama multi-comprimento de onda, um novo conjunto de matrizes tridimensionais de matriz que representa a absorção óptica para cada substância absorvente presente na amostra.
4. Se necessário, o processo ainda mais as matrizes de matrizes que representam a distribuição de absorção óptica para facilitar a visualização e leitura dos parâmetros biologicamente relevantes.

Resultados

Os resultados representativos, demonstrando as capacidades da sonda de mão volumétrico descrito optoacoustic, são exibidos nesta seção. Em todos os casos, a fluência da luz na superfície da pele foi mantida abaixo do limite de exposição de segurança de 20 mJ / cm ^{2 19.}

O desempenho da sonda em tempo real de rastreamento vascularização periférica humana é mostrada na Figura 2. Durante o curso do experimento, a sonda foi lentamente digitalizado ao long...

Discussão

As vantagens únicas oferecidas por técnicas de imagem optoacoustic em pesquisa animal pequeno criaram uma forte motivação para traduzir a tecnologia na prática clínica, com uma série de diagnósticos e aplicações de monitoramento de tratamento previstos eg., Na mama e câncer de pele, inflamação ou doenças vasculatura periférica. No entanto, ao contrário de murganhos ou de animais mais pequenos, que pode ser rodeado por um número suficiente de fontes de iluminação e de detecção de elementos p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Optical parametric oscillator (OPO)-based laser	Innolas Laser GmbH, Krailling (Germany)	custom-made	The laser provides laser pulses with a duration around 10ns and an energy up to 80mJ. The wavelength is tunable between 680-950nm.
Spherical array of piezocomposite detectors	Imasonic SaS, Voray (France)	custom-made	The array consists of 256 piezoelectric sensors distributed on a spherical surface. Each element has dimensions 3x3mm2, a central frequency of 4MHz and a bandwidth of 100%.
Data acquisition system (DAQ)	Falkenstein Mikrosysteme GmbH, Taufkirchen (Germany)	custom-made	The DAQ simultaneously acquires 256 signals at 40 megasamples per second and 2030 samples. The input impedance is 1MW.
Fiber bundle	CeramOptec GmbH, Bonn (Germany)	custom-made	The bundle consists of 480 individual fibers randomly distributed in the input and output. The numerical aperture of each individual fiber is 0.22.
Athymic Nude mouse	Harlan Laboratories (The Netherlands)	Athymic nude - Foxn1nu	The mouse was 8 weeks old (adult) at the time of the experiment. The ethical protocol was approved by the Bavarian goverment (number 55.2.1.54-2632-102-11)
Bepanthen cream	Bayer AG (Germany)	N/A	Vet ointment to protect the eyes during anesthesia
Data processing software	Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA)	custom-made	The data processing software was devoped at our institute. It allows reconstruction at each wavelength and multi-wavelength unmixing, as well as further data processing.
Water-enclosing part	N/A	custom-made	This part contains the water that acts as an acoustic coupling medium between skin and transducer elements
Indocyanine green (ICG)	PULSION Medical Systems SE	N/A	ICG-PULSION (active ingredient: indocyanine green dye) is a drug used in cardiac, circulatory and micro-circulatory diagnostics, liver function diagnostics and ophthalmic angiography diagnostics.