神経病原の非侵襲的モデル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;新生ラットにおける感染

要約

ここでは、手順は、 大腸菌 K1の培養新生児ラットにおける全身性感染の確立のために記載されている。この非侵襲的手順は、脈絡叢での胃腸管のコロニー形成、全身循環への病原体の転座、および中枢神経系への侵入を可能にする。

要約

採用感染モデルは、自然感染の主要な特徴を複製する場合は、動物宿主と細菌性病原体の間の相互作用の調査はのみ意味があります。このプロトコルは、新生ラットにおける神経病原性大腸菌 K1 に全身感染の確立と評価のための手順を説明します。消化管の植民地化は、感染の腸リンパ血液 - 脳のコースに沿って病原体の普及につながり、モデルが強い年齢依存性を表示します。 Eのひずみ大腸菌 O18：新生ラットのための強化された病原性を持つK1は植民地化の非常に高い率、血液区画および脈絡叢を通る通過以下の髄膜の侵略への転座を生成します。ヒト宿主と同様に、中枢神経系の浸透は局所炎症および常に致死的転帰を伴う。モデルは、メカニズムの研究のために実績のある有用である病因の、治療的介入を評価するため、および細菌の病原性の評価のため。

概要

全身細菌感染は、新生児の健康と生存にとって大きな脅威である。早産児は特に脆弱である。頻繁に細菌性敗血症に関連した新生児の細菌性髄膜炎（NBM）は、人生の最初の数週間の間に死亡率と罹患率の重要な供給源であり続けていると問題が最前線抗菌薬^1,2に対する抵抗性の継続的な進化によって悪化する。 NBMの場合は、高い、医療的、社会的、経済的な負担^3を運ぶ医学的な緊急事態である。その結果、感染症の負担を軽減するための新しい治療法であり、特に、新規な予防戦略が緊急に必要である。 NBMの一部の機能を異例のとおりです。先進国では、 大腸菌とB群レンサ球菌は、ほとんどの場合、保護多糖類CAの存在と関連しているケースが大多数とNBMを惹起するこれらの株の容量を担当する免疫認識を回避するために、病原体を可能にpsuleは^4を処理します。神経浸潤E.の- （85〜80％）、非常に高い割合大腸菌は 、K1カプセル^5,6、神経可塑⁷のモジュレーターをホストする構造的に同一であるα-2,8-結合ポリシアル酸ポリマーを発現する。

NBMと関連する菌血症と敗血症のための新たな治療薬および予防薬の評価は明らかに強い年齢依存性や感染の自然経路、特に、ヒトの新生児における疾患の重要な特徴を模倣し、感染の堅牢な動物モデルから恩恵を受ける。グラム陽性およびグラム陰性細菌性髄膜炎のためのモデルの広い範囲が^8,9利用可能であり、これらはかなりこれらの感染における病因、病態生理と治療選択肢の知識を高めています。したがって、ラット、マウス、ウサギ、サルにおける実験的感染は、nの両方で髄膜炎を研究するために使用されているeonateと大人。しかし、これらのモデルの多くは、コロニー形成部位から播種の自然のプロセスをバイパスすることによって人工的病因を作成する、感染の開始のための細菌の直接槽内または皮下注射を使用する。いくつかのケースでは、接種するこれらの方法は、病理学に大きな変化をもたらした。例えば、E.の皮下投与大腸菌 K1株は、新生児および成人の¹⁰の両方における菌血症および中枢神経系（CNS）の侵入を生成する、天然の感染に関連する年齢依存性を抑止。 E.素因大腸菌 NBMは、またはすぐに出産後の母親から¹¹乳児への原因物質の垂直伝播に決定的に依存する。母系由来のE.大腸菌 K1の細菌は出生時に滅菌されているが、急速に複雑な細菌叢^14を取得し、新生児胃腸（GI）管^11-13を 、植民地化。保菌新生児では、E。大腸菌のK1菌は、血液脳または血液脳脊髄液障壁^9,15横切っCNSに入る前に全身循環に腸管腔から転位する能力を有する。実験的感染の堅牢なモデルの設計は考慮に入れ、これらの詳細を取る必要があります。

マウスは広く細菌性髄膜⁸のいくつかの形態の研究のために使用されてきたが、これらは新生児感染の研究のためには不適当である：それらは全身感染に圧倒され、人間の乳児¹⁶の強力な年齢依存特性を示さない。さらに、αディフェンシン、Eで全身侵入に対する保護を提供するGI管のキーペプチド大腸菌 K1 ^17は 、高度にヒトおよびラットにおけるパネート細胞および好中球ではなく、マウス¹⁸で表される。他では見られない、複製、冗長性とマウスディフェンシンにおける異質性と関連cryptidin遺伝子の顕著度がありますimals ^19。新生仔ラットは最初モクソンによって使用され、同僚^20を鼻腔内接種後インフルエンザ菌性髄膜炎の病因を調査するために、人間にこの新生児病原体のコロニー形成の自然のサイトを複製し、続いて年齢依存性のE.のために適合した大腸菌 K1、菌血症および髄膜炎。 Bortolussi ら細菌接種の²¹就業腹腔内注射は、感染を開始するが、キーGlodeの研究とは、GI植民地化の後に感染の自然の経路を平行に²²用いられる経口胃摂食を同僚。胃管が粘膜表面を傷める可能性がありますので、手順は新生児²³に接種材料の供給が含まれるように精製した。ここで、感受性の仔ラットにおいて感染を追跡するための胃腸管のコロニー形成および手順のための方法が記載されている。さらに、モデルの治療及び予防のアプリケーションが議論されている。

プロトコル

この研究で行われたすべての動物実験は、国内および欧州の法律に準拠し、薬局のUCL学校の倫理委員会と英国内務省（HO）によって承認された。 HOプロジェクトで行ったすべての動物の仕事はPPL 2243分の80とPPL 7773分の70をライセンス供与しています。

1.ラットの準備

1. 病原体フリーのWistar新生児ラットを使用して、すべてのin vivo実験を行う。
2. 21℃、45 - - 55％湿度、15から20のエア変更/ hrで、最適な条件（19条、 - （11週齢の雌9）彼らの授乳中の母親と個々のケージ内のすべてのラットの仔（コロニーあたり12新生児）を保持12時間の明/暗サイクル）。

2.細菌細胞調製

1. ストアE. 20％ 大腸菌 K1株-80℃で（v / v）グリセロール。各実験について、寒天プレートミューラーヒントン（MH）への株式細菌をプレートアウトし、37℃、CO / Nでインキュベートする。
2. 給餌、inocu前日シングルE.付きMHブロスの後期10ミリリットル37℃、200rpmで大腸菌 K1、コロニーや文化、O / N。培地の汚染のための対照として、未接種MHブロスを10ml調製し、200rpmで37℃でインキュベートする。
3. 転送MHブロス9.9mlの中にO / Nの細菌懸濁液100μl（1：100 v / v）であり、中間指数相が0.6の光学密度に対応し、到達するまで、37℃、200rpmでインキュベート600nmで（OD _600）の波長で測定した。

E.と新生ラットの3摂食大腸菌 K1は

1. そっと口を開くことができ、首筋から片手で垂直に動物を保持する。ゆっくりと30秒の期間にわたって動物の口に接種物（〜37℃）の20μLを動物の口に滅菌ピペットチップを挿入し、ピペット。すぐに給餌した後、その母親に動物を返します。
2. 8×10 ⁶細菌トンを与えてきた- 4がいることを確認しますOシリアルPBS​​中接種物の希釈およびMH寒天プレート上にスポッティングすることにより、それぞれの子犬。

E.による植民4.アセスメント大腸菌 K1は

1. 優しく首筋から片手で動物を保​​持します。無菌PBS中の滅菌綿棒を湿らせ、その後、静かに肛門周囲の領域を綿棒。すぐに拭き取り後に母親に動物を返します。
2. 滅菌PBS300μlの入ったチューブにスワブ先端を置き、氷上で保存する。
3. PBS中で連続希釈により生菌数を測定し、マッコンキー寒天プレート上にプレーティング。
4. 実行可能なE.を決定バクテリオファージ感受性試験によって大腸菌 K1は。滅菌微生物学的ループを使用して個々のコロニーを採取し、ボルテックス混合を受けた後、滅菌PBSを200μlに浸漬。
5. 直線でMH寒天上に滅菌微生物学的ループ、サブカルチャーを使って。プレートを30秒間乾燥することができ、その後、BAC10μlのピペット線の中心へteriophageのK1E（10 ⁹プラーク形成単位/ ml（PFU / ml）で）。 37℃でプレートO / Nインキュベートする。
6. 翌日、バクテリオファージ媒介性溶解用のプレートを調べます。

疾患重症度の5評価

1. 表1に概説7点スコアリングシステムを用いて5回、毎日4 -各動物の疾病の重症度を評価する。
2. 動物のスコアは7の外≥3場合は、すぐに苦痛を最小限にするために動物を間引く。死んだ動物を記録します。

新生ラットと採血6.安楽死

1. 優しく頭頸部を露出させ、片手で動物を保​​持します。アルコール綿棒で拭いて動物の首を消毒。微量のエタノールを除去し、滅菌PBSでリンスする前に、70％エタノールを用いて、はさみの大きなペアを消毒する。
2. 優しくペトリ皿の真上に動物を開催しています。シャープsurgiを使用して新生児を斬首血液がペトリ皿に滴下することを確実にするCALはさみ、。皮膚細菌叢と血液の汚染を防ぐためにヘッドとの接触を避けてください。
3. 直ちに滅菌ピペットを用いて血液を採取し、20の濃度のヘパリンナトリウム塩と混合 - 0.5ミリリットル微小遠心管中で50単位/ ml。
4. PBS中で連続希釈により生菌数を測定し、マッコンキー寒天プレート上にプレーティング。実行可能なEの数を決定バクテリオファージK1Eに生菌の感受性を試験することによって大腸菌 K1は。

7.解剖

1. 新生ラットの断頭に続いて、目的の組織を切除し、収集するために無菌状態を使用しています。 70％エタノール及び滅菌PBS中（ 図1に示されている）すべての機器を洗浄する。
2. 解剖ボードを清掃し、70％エタノールで完全に腹部を濡らす。左後脚へのピン止め、その裏に死体を置き、（i）で解剖ボードに固定する無菌の針で動作テーブル、（ⅱ）死体をストレッチし、操作テーブルに右前脚を固定する、（ⅲ）操作テーブルに右後肢と左前肢をピン止めする。
3. 小さな解剖ハサミを使用して、胸骨に下腹部から死体の左側に沿って切断した後、ピンセットを用いて下腹部の左側に沿って皮膚を引っ張る。
4. 胸骨を横断切除を拡張した後、下にある構造のいずれも損傷していないことを保証する鉗子と小さな解剖ハサミを使用して、下腹部に胸骨から死体の右側、ダウン。
5. 最後に、優しく腹膜を露出するようにアイリスに湾曲した解剖鉗子を用いて下腹部に胸骨から皮膚弁をプルダウン。
6. 根底にある臓器のいずれも損傷していないことを保証し、優しく鉗子で腹膜を高め、内臓が露出するように垂直に切断。

8.収集消化管

1. 胃、小腸、盲腸、結腸および腸間膜リンパ系を識別します。
2. 優しくいずれかの側で離断によって胃を削除し、その後、滅菌ピンセットを用いて滅菌PBS 1.6 mlを含むビジューに入れる。
3. 直腸でコロンを横断する。慎重に滅菌ペトリ皿に解剖鉗子と場所を使って死体から全体の腸質量を引く。腸の構造および腸間膜リンパ管構造が分離しないように、これは静かに行われていることを確認します。

消化管および腸間膜リンパ系の9の分離（図2）

1. 胃腸管が完全に浸漬されている保証ペトリ皿に無菌PBS 30ml中に注ぐ。
2. 腸間膜リンパ系の中央質量を特定し、細かい解剖鉗子を用いてピンチ。小腸の最も近位の部分を特定し、細かい解剖鉗子を用いてピンチ。
3. ゆっくりセントラを引っ張る腸間膜リンパ系および2つの組織まで、反対方向に遠位小腸のLの質量が完全に分離されている。これは、近位、中間および遠位の領域の再現性のあるコレクションを妨げるとして、小腸が引き伸ばされていないことを保証するために注意して、このプロセスを実行します。 300に腸間膜リンパ系を配置 - 滅菌PBS500μlを、氷上に置きます。

GI管の10セクショニング

1. 結腸から小腸を分離するために盲腸で胃腸管を横断する。
2. 300にコロンを置き - 500μlの滅菌PBS、氷上に置きます。
3. 近位、中間および小腸の末端領域からの代表組織を収集しています。中間点から小腸を合わせます。
4. 次に、（i）は遠位小腸などの盲腸に先立って組織の最後の2センチメートルを収集、（ⅱ）5からの組織を収集 - 近位小腸などの中間点上記の7センチ、そして真ん中小腸などの中間点より5センチ - （iii）の3から組織を収集します。

11.肝臓の収集

1. 胃を除去した後のラットの肝臓の3ローブを識別します。
2. 細かい解剖鉗子を用いて腹腔からローブを引き離す。
3. 細かいハサミを使用して任意の添付靭帯を切断することによって肝臓を削除します。氷上で500μlの滅菌PBSと場所 - 300肝臓を置きます。

12.脾臓の収集

1. 脾臓を識別します。
2. 離れて胃から脾臓を引き、gastrosplenic靭帯をカットする微細なハサミを使用しています。
3. 氷上で500μlの滅菌PBSと場所 - 300に脾臓を置きます。

13.腎臓の収集

1. 消化管および他の器官の除去時に腹腔の奥に見えるようになります腎臓を特定します。
2. カット尿管および任意の添付靭帯のu細かい解剖ハサミを歌い、細かい鉗子を用いて腎臓を取り除く。副腎と細かい鉗子や解剖ハサミを使用して（まだ接続されている場合）は、任意の脂肪物質を取り除きます。
3. 300-500μlの滅菌PBS中に両方の腎臓を置き、氷上に置きます。

14.脳の収集

1. 断頭後、湾曲した鉗子を用いて直立した状態で頭部を保持します。縦方向に湾曲した鉗子の別のセットを使用して、頭の上に皮膚をつまみ、細かい解剖ハサミを使用して切開する。細かい解剖ハサミで縦方向に再び、首の近くに残りの皮膚をカット。
2. 頭蓋骨を明らかにし、細かい解剖ハサミを用いて皮膚フラップを除去するために両側に細かい鉗子を用いて外向きの方向に皮膚を引っ張る。脊髄開口部に微細な解剖ハサミを置き、演壇に向かって頭蓋骨に沿って切開する。
3. 細かい鉗子を用いて外向きの方向に頭蓋骨の両方のセクションを引き出します。頭蓋骨セグメントを削除するカット。
4. は演壇に向かって脊髄開口部から上向きにすくいモーションを使用して、広範な鉗子を用いて脳を削除します。断頭手順から任意の血液を除去するためにPBS中で2回の脳を洗ってください。

15.組織の処理および均質化

1. 滅菌PBSを含有する管に生存カウントまたはDNA抽出、場所の組織を必要とする実験のために。すぐに短期的には20％のグリセロールを-20℃で連続PBS中に希釈し、マッコンキー寒天培地プレートにプレーティング、または店舗により生菌数を測定。 DNA抽出、-20℃で保存組織のために。
2. RNA抽出、RNAlaterで液の適切なボリュームに場所組織（1 mgの組織あたり10μl）を必要とする実験のために、その後、短期または-80℃長期貯蔵で-20℃で直ちに保存してください。
3. イメージングを必要とする実験のために、場所次に10ミリリットルMethacarn溶液（60％メタノール、30％クロロホルム、10％酢酸）中で組織を保存するtはRT（20から25°C）まで3週間。
4. 組織の添加前後の管の重量を比較することによって組織重量を計算する。ホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズする。各サンプルの均質化の間に滅菌PBSで一度70％エタノールで二回ホモジナイザーを洗ってください。
   注：Methacarnの固定は、ムチン関連の粘膜防御構造を維持するために、腸の試料の固定のために望ましい。ホルマリン固定組織は、全身に使用することができる。

結果

E.ここで説明した大腸菌 K1の全身感染モデルは、ヒトにおける自然感染の多くの機能を複製します。細菌は、胃腸管にコロニーを形成する脳²⁴の関連した炎症、臓器特異的疾患を確立する前に、腸間膜リンパ節を介して血液区画内に移行し、摂取される。重要なことは、このモデルは強い年齢依存性を表示します。 図3に示すように、2日齢（P2）のラットの仔は、侵襲性疾患に対して非常に感受性であるが、7日間の期間にわたって動物が感染次第に不応性となったが、消化管のコロニー形成^を17 Giにない。血液区画へGIコロニー形成部位から通過した後、細菌は、脈絡叢²⁵で主にCNSに入る前に、蛍光顕微鏡（ 図4）により、血液サンプル中で視覚化することができる。いくつかの動物では、のような他の主要臓器の広範な浸潤がある肺、脾臓および腎臓^25。

組織中の細菌数は、個々の子犬²⁵が、時臓器浸潤に関して高度の再現性がある存在または不在のいずれかとしてバイオバーデンのスコアリングの間に、実質的に変化させることができる。単一のテストコホートとして12仔のごみで、G *電源ソフトウェアを使用して電源の計算は、このサンプルサイズは、すべての場合は、コホートおよび> 99％の確率で6匹の動物を使用して生存に基づいて効果を見つけることの98.6％の確率に相当することを決定12が考慮される。モデルは、特に新生児の細菌感染症の治療に合わせた新規薬剤の評価に適していると選択的に細菌表面^24-26からK1カプセルを除去しEndoE分解酵素カプセルの治療可能性を評価するための手順で使用されてきた。また、ホスト - 細菌相互作用をパットでその影響を調査するために使用することができるEのhogenesis コリ neuropathogens。この文脈内では、Eの研究のために採用されている大腸菌 A192PPのコロニー形成と普及。これは、ことが示されているE.大腸菌 A192PP細胞が大量にP2、P5及びP9仔のGI管内に固執。これらの三つのグループにおける植民地化の時間的側面 ​​（ 図5）非常に類似していたと複製し、腸内の人口密度を維持する細菌の能力を反映している。

臨床分離株A192の毒性は、動物使用のほとんど又は全く冗長性を確保するために、新生児ラットにおける連続継代によって増強された。E.大腸菌 A192は、100％の効率でP2新生ラットをコロニー形成した動物の35％に菌血症を誘発し^{、25〜27％}で致死効果をもたらした。継代派生A192PPは、胃腸管にコロニーを形成菌血症を生成し、すべてのP2の仔で致死性を引き起こす。したがって、モデルは、ジ毒性を調査するために使用することができるfferent K1は、コロニー形成部位からCNSおよび他の器官系に侵入するそれらの能力に関して株。この文脈において、Pluschke及び共同研究者^23は、95 E.の容量を決定するために、新生児ラット感染モデルを使用腸の植民地化の後に菌血症を引き起こすヒト由来の大腸菌のK1株。彼らは、Eのクローンな性質を支える、コロニー形成および侵襲能力の両方の効率の幅広い変動を観察した大腸菌 K1はneuropathogens。

図組織収集1.材料：（A）の重量計、（B）必要なメディアを含む予め計量したチューブ、（C）動作テーブル、定規や動物を突き止めるための針、（D）、70％（v / v）の組織収集機器を滅菌するエタノール及びPBS、 （E）組織採取キット、殺菌するための組織を維持するために（F）を、氷、（G）、70％（v / v）エタノール動作テーブルと取り囲んでいる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2 GI管の分離および腸間膜リンパ系。 （A）グリップ細かい切開鉗子で腸間膜リンパ系の中心質量（B）グリップ小腸の近位部、および反対方向に引っ張る。（C）GI管および腸間膜リンパ系完全separat意志E。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Eの経口投与後の9日間（P9）に2日間（P2）から歳の新生ラット仔の図3.サバイバル大腸菌 A192PPは、全身感染の強い年齢依存性を示す。各グループは24新生児を表します。

E. 4.蛍光画像を図細菌の経口投与後に感染したP2子犬から血液塗抹標本における大腸菌 A192PP細胞。細菌表面でのリポ多糖O抗原はSTたウサギ抗O18ポリクローナル抗体およびAlexa546結合ヤギ抗ウサギ二次抗体でained。 K1はカプセルがEndoE-GFP試薬で可視化した。血液試料中で検出実質的にすべての細菌は、保護K1カプセルを示した。画像は博士アンドレアZELMERによって捕獲された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5. E.細菌接種の投与後の大腸菌 A192PP腸の植民地化。DNAは、腸全体および大腸菌から抽出し、 polysialyltransferase（neuS）遺伝子を標的と定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によって決定大腸菌 K1コロニー形成単位/グラム（CFU / g）の組織が ​​他の場所¹⁷に記載^のように。 LOD：検出限界。

フィーチャー	健康	不健康
肌の色	ピンク	イエロー/ペール
アジリティ（立ち直り反射）	子犬はすぐに後方に配置に逆転し	後方配置を逆転させることが困難で（> 3秒）、または達成することはできません
腹部に穏やかな圧力	音が出ない	攪拌の音
胃/ミルクライン	目に見える、白	表示されていない
温度	暖かい	比較的低温*
重量	一日あたり1.5〜2グラムのゲイン	体重増加しないか、体重減少なし
ケージに入れ行動	母親に向かって移動するとfを開始eeding	母親やショー難易送りに向かって移動することはできません

表1. 7点スコアリングシステム：リストされた最初の3つのスコアは通常、最初の兆候が観察される。 *全身感染経験上昇体温（> 2℃）と新生児。しかし、動物の敏捷性の欠如のために体温を維持するために、自分の母親に到達するために、不健康な動物がごみから分離となり、素手に寒さを感じることがあります。

ディスカッション

ここで説明する動物モデルは、自然にヒトでの感染症発生の顕著な特徴を再現することを目的とした以前の研究に基づいています。新生ラットは、最初はHに起因する乳幼児の髄膜炎を研究するために採用された種は、感染の強固なモデルのための重要な基準を満たしたとして、 インフルエンザb型 。このように、関連する病原体のエントリのポータルは、天然のヒトへの感染のそれを反映しており、再現性治療的介入を可能にするために十分な期間の類似の病理を引き起こす必要があります。使用される技術は、手続きの適用可能性を制限してはならないと疾患の転帰²⁰に寄与するべきではありません。 Hのモデルモクソンらによって開発された幼児のラットにおけるインフルエンザ髄膜炎は、これらの基準^20を満たしている。自然感染は上気道の粘膜のコロニー形成後に発生し、この重要な機能は、非外傷によって仔ラットで再現された鼻腔の膜上の細菌のチック点滴。重要なことに、感染の年齢依存性の性質はモデルで再現された。

同じグループはまた、E.の非侵襲的モデルを開発した最初の新生ラット²²における大腸菌 K1のNBM。病原体フリーのSprague-Dawley仔ラットは、経口胃管を介して^8月10日から10月10日まで細菌を供給することによってコロニー形成された。接種物は、したがって、私たちが採用しよりもかなり高かった。調べた3のK1株による植民地化、C94（O7：K1は：H-）、EC3（O1：K1は：H-）とLH（ø75：K1は：H3）は、比較的高い割合の（48から74パーセント）で発生したK1-与えられた動物が、菌血症、髄膜炎および死亡の発生率は、変数と植民率よりも有意に低かった。 Eのクローン自然大腸菌 K1は実験的感染は後に²³に設立され、それが唯一O18ことが明らかである：K1はと、より少ない程度に、O7：K1の血清型が可能です一貫して全身感染を引き起こす。神経病原大腸菌の病因のこの理由のために、これらの調査K1の株A192PP： 大腸菌 K1は病原性強化O18の使用に基づいていた。 Eの比較大腸菌 Glodeと同僚²²によって使用されるように、胃管を通る新生ラットのK1を送り、液滴供給方法Achtmanのグループ²³で使用されるようなことで粘膜表面にほぼ確実に起因する損傷に、前者の方法を用いて、死亡の過剰な数を明らかにした胃管。コロニー形成率はこれらの2つの方法と同等であるように、この通信に記載されているように、滅菌チップを用いてピペットを用いて細菌の供給侵襲性の少ない方法を使用することが推奨される。

私たちの研究で使用された大腸菌菌株A192PPはO18です：K1は。それは、臨床株Eのより病原性誘導体である元々敗血症²⁷の患者から回収した大腸菌 A192 。株の増加病原性は、新生ラット²⁶を介して連続継代することにより得た。 2日齢の動物に投与した場合に²⁸株は、100％の菌血症および死亡率、年齢依存性疾患の重症度を誘発する。対照的に、9日齢の動物は、疾患に対して完全に耐性である。 K1固有溶菌バクテリオファージはE.を区別するために使用することができ他のEから大腸菌 K1は大腸菌は ²⁹株。本研究では、バクテリオファージK1Eの生菌の感受性は、（i）に使用されるべきであるE.の純度を確認する大腸菌 K1懸濁液を動物に供給するように準備し、及び（ii）E.を区別するために肛門周囲のスワブ、血液および組織サンプル中の生存率を計算するために、他の大腸菌からの大腸菌 K1。コロニーは、Eである場合大腸菌 K1は、バクテリオファージK1E溶解に感受性となり、細菌の増殖は、バクテリオファージ接種部位で阻害される。コロニーE.でない場合大腸菌 K1は、それがbになりますKIEバクテリオファージ溶解に耐性e及びバクテリオファージ接種部位での細菌増殖の面積があるはずです。また、動物モデルは、天然に存在する疾患のすべての機能を反映していないことを留意すべきである。現在のモデルは、E以外の神経病原性細菌の毒性特性を調べるために修飾することができる大腸菌 A192PPおよびコロニー接種物のサイズの変化に対応することができる。技術の将来のアプリケーションは、状態を治療すると植民地化および組織の侵入に対する宿主応答の詳細を明らかにするために大いに必要と薬の評価を含めることができます。

ここで説明する方法はシンプルだが効果的である。 10のシングルリットル - 12の仔は、試験または対照群として用いた。この中で、ごみのアプローチは、再現性と統計的妥当性の高い学位を保証します。それは子犬がどのprocedur後できるだけ早く彼らの自然な母親に返されることが肝要であるeと同腹は、したがって、異なる介入を受けている動物を含んでいてはいけません。これは、供給された接種物はそうでない子犬が提供文化を拒否し温めていることが重要である。子犬は急速に複雑な細菌叢を開発し、出産の2日以内に、胃腸管は、幼児と成人の腸内で最も豊富な微生物として設立門からの細菌の広い範囲で植民地化されています。 E.を与えられていない子犬大腸菌 A192PPはEを運ばない植民地化の速度の消化管における大腸菌 K1は¹⁷とそう判断は比較的簡単です。しかし、neuSは、Eコロニー形成の検出のための定量PCR法をベース大腸菌 K1は、従来の培養方法、そのはるかに敏感であり^、17を強くお勧めします。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)	Harlan, UK
E. coli K1 A192PP	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Glycerol	Sigma, UK	G5516
Mueller-Hinton Agar	Oxoid, UK	CM0037
Mueller-Hinton Broth	Oxoid, UK	CM0405
MacConkey Agar	Oxoid, UK	CM0007
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma, UK	P4417
Ethanol 100%	Sigma, UK	E7023
Heparin Sodium Salt	Sigma, UK	84020	Prepare 20 - 50 units/ml
RNAlater Solution	Sigma, UK	R0901	10 μl/mg tissue
Acetic Acid	Sigma, UK	320099
Chloroform	Sigma, UK	C2432
Methanol	Sigma, UK	322415
Cotton-tipped swabs	Fisher Scientific, UK	11542483
Alcotip Swabs	Scientific Laboratory Supplies, UK	SWA1000
Petri dishes	Sigma, UK	P5856
30 ml Universal Tube	AlphaLaboratories, UK	CW3890
0.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1405-1500
1.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1415-1000
0.1 μl calibrated loops	StarLab, UK	E1412-0112
L-shaped spreaders	StarLab, UK	E1412-1005
Cuvettes	Fisher Scientific, UK	10594175
Forceps straight with fine points	Fisher Scientific, UK	12780036
Forceps straight with blunt tips	Fisher Scientific, UK	12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points	Fisher Scientific, UK	12740926
Scissors straight with very fine points	Fisher Scientific, UK	12972055
Laboratory Scissors	VWR, UK	USBE4251
25 G Syringe Needles	Greiner Bio-One Ltd	N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers	PerkinElmer, UK	L60000BB
Unitemp Incubator	B&T, UK	OP958
Multitron shaking incubator	INFORS HT, UK	AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer	IKA Werke	0003737000