MALDI-TOF質量分析およびカスタムデータベースを使用すると、ユニークな洞窟環境（カーチェナー洞窟、AZ、USA）を常在菌を特徴づけるために

要約

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

要約

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

概要

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels^1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts^1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed¹. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies¹. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank⁶, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification¹.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria¹. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium^3,7, cultivation time⁸, sample preparation method³, and matrix used⁹, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels^1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

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プロトコル

注意 ：どのような環境からの未確認細菌は病原性とすることができ、適切なバイオセーフティプロトコルを使用して、慎重に処理する必要があります。ライブ文化との仕事は生物学的安全レベル2（BSL-2）の手順を使用して、クラスII安全キャビネットで実行する必要があります。 BSL-2手続きの詳細については、CDC / NIHのタイトルのマニュアル、「微生物学的および生物医学研究所でバイオセーフティ、「ページ33-38で利用可能です。ドキュメントは、オンラインで利用可能ですhttp://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf 。白衣/ガウン、安全眼鏡、及びニトリルまたはラテックス手袋など適切な個人用保護具（P​​PE）は、着用しなければならない。標準微生物学的慣行や注意事項に従わなければならず、バイオハザード廃棄物は適切に廃棄しなければならない。

このデモで使用される細菌は、カーチェナー洞窟から単離した、AZ、USA、ドライ鍾乳石、フロー石、湿った鍾乳石や鍾乳石のドリップ（ 表1）を含む4つの環境から。すべての分離株は、16S rDNAの塩基配列決定によって同定され、25％グリセロール、R ₂ B培地中で-80℃で保存した。すべての実験は、室温で完了した。

注：私たちは、データベース構築と未知数の質量スペクトルのための質量スペクトルを取得するために、同じサンプル調製方法を使用することをお勧めします。試料調製法は、スペクトルの品質および再現³に影響すること^が以前に示されている。異なる試料調製方法を使用すると、（株レベルで、例えば 、）より高い分類学的解像度が所望される場合は特に、未知数の誤った識別を引き起こし得る。

MALDIターゲット1.沈着

注意 ：タンパク質抽出物を得るためのいくつかのプロトコルは、酸とのguidに従って利用されなければならない有機溶媒の使用を必要とするそれぞれの材料安全データシート（MSDS）に含まれるelines情報。適切なPPEは、アセトニトリルなどの毒性、引火性溶剤、かなりの量で作業するときに使用する必要があります着用しなければならないと種類とボリューム使用される化学物質の（ 例えば 、白衣/ガウン、手袋、安全眼鏡、および呼吸器保護により変動するため、ギ酸およびトリフルオロ酢酸などの腐食性の酸、）。

1. ステンレス製MALDIターゲットプレート上に、それを乾燥させ（必要に応じて、以前に記載されているプロトコル^11-13を用いて得られた）は生細胞を含まないタンパク質抽出μlの預金1。 1μlのマトリックス溶液（αシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸溶液）を用いて乾燥させたタンパク質抽出物をオーバーレイし、それを乾燥させる。
2. 各生物学的反復のために、技術的反復（5から20技術的反復）の適切な数を見つける。ここでは、それぞれの生物学的複製のための10の技術的複製物および3生物学的複製ワットを発見ERE準備。
   注意：我々は、タンパク質抽出試料調製方法を使用している場合に磨かMALDI鋼ターゲットプレートを使用することをお勧めします。グランド鋼ターゲットプレートを使用すると、個々のサンプルウェルの外側の異なるサンプルの混合を拡散意図しない引き起こすことがある。
3. 預金1μlの較正用ターゲットプレート上の標準とそれを乾燥させる。 1μlのマトリックス溶液とオーバーレイし、それを乾燥させる。
4. 陰性対照として、ターゲットプレート上に堆積物2μlのマトリックス溶液。

2.マススペクトルの取得

1. 窒素レーザー（λ= 337nmで）を備えたMALDI-TOF質量分析計を使用したBruker FlexControlソフトウェアを使用して動作する。
2. 100ショット単位で500レーザーショットの蓄積によって正の線形モードにおける各質量スペクトルを収集する。 20 kVのイオン源1の電圧を設定します。イオン源2電圧18.15 kVのに。と9.05 kVのにレンズ電圧。これらのパラメータは楽器-speciであることに注意してくださいFICと最適な結果を得るために、他の楽器に調整が必要になる場合があります。
3. 2からの充電あたりの20kDaに自動化されたスペクトル評価のための質量電荷範囲を設定します。重心ピーク検出アルゴリズムを使用してください。 100ダでの最小分解能しきい値を設定します。 100での最小強度しきい値を設定2.しきい値：ノイズ比（N S）に信号を設定します。

3.データベース構築

1. データベース設計
   1. 「新しいデータベースウィザード」を使用してBioNumerics 7.1で新しいデータベースを作成します。
   2. 「実験タイプ」パネルでコマンドを使用して、 例えば 、のMALDIスペクトル実験タイプを作成します。
   3. 「データベース設計パネル」を使用してレベルを作成します。 「データベース」メニューの「レベル>新しいレベルを追加... "コマンドを使用して新しいレベルを追加。ここで、「種」レベル、「生物学的複製 "レベル」と「技術複製」レベル、respectivを作成エリー。
2. 生の質量スペクトルのインポートと前処理
   1. 「ファイル」メニューの「エクスポート>マススペクトル」コマンドをクリックしてFlexAnalysisを使用して.txtファイルとして生の質量スペクトルをエクスポートします。
   2. 技術的反復のレベルのデータベースに生の質量スペクトル（.txtファイル）をインポートします。
   3. 生の質量スペクトル前処理を行います。
      1. インポートとリサンプル（二次フィッティングアルゴリズムを使用して）。
      2. （50点の大きさと転がりディスク付き）ベースライン減算を実行します。
      3. （20ポイントと10ポイントのベータのウィンドウサイズとカイザー窓）なめらかな、ノイズ[連続ウェーブレット変換（CWT）]を計算し、第二のベースラインの減算（200ポイントの大きさと転がりディスク）を行う。
      4. [10：ノイズ比（N S）の最小信号CWT]ピークを検出する。
   4. 前処理した後、そのようなピークを含むピークリストなどの各マススペクトルの特徴的なパターンを保存大きさ、ピーク強度、S：データベース内のN など 。
3. 複合質量スペクトルを作成する
   1. 「分析」メニューの「要約... "コマンドを使用して、前処理済みのスペクトルから複合スペクトルを作成します。目標レベルとして「生物学的複製」を選択してください。
   2. ここでは、「生物学的複製」レベルでの分離株の3つの複合質量スペクトルで、その結果、そのコロニーのための複合質量スペクトルを得るために、同じコロニーの10技術的反復の質量スペクトルを兼ね備えています。
   3. ここでは、それは「種」レベルで分離するための一つの複合スペクトルを作成するために3複合スペクトルをまとめる。
      注：複合スペクトルは、技術的反復のポイントバイポイント平均である。 95％未満（初期設定）の平均値との類似性（ピアソン相関）を複製する合成から除外される。彼らは、75％で存在する場合、複合スペクトル上のピークのみ（と呼ばれ含まの複製のデフォルト設定）。生物学的複製のために、これらの設定は、それぞれ、90および60％であった。

4.マススペクトルデータ解析

1. データベース内のエントリを選択し、「比較」パネルに「新しい比較を作成する」コマンドをクリックして、比較を作成。
2. ここで、比較·分析を表示するには「技術の複製」および/または「生物学的複製」のレベルで質量スペクトルを使用しています。
3. 類似性に基づくクラスター分析および多次元スケーリング（MDS）
   1. 色でグループを作成します。 3生物学的複合マススペクトルを選択し、対応する分離株のためのグループを作成するには、「グループ」メニューの「選択範囲から新しいグループを作成」コマンドをクリックします。自動的にこれら3質量スペクトルに使用する色を指定します。
   2. あるいは、「でコマンドを使用して対応する色で、フィールドの状態を定義するこの定義されたフィールドに基づくグループ化がこのグループのために定義された同じ色を使用するように、データベースエントリ」パネル。
   3. クラスター分析を行います。 「クラスタリング」メニューの「クラスター分析の計算」コマンドをクリックします。比較設定の1ページ目で、「ピアソン相関」を選択し、デフォルトなどの他のパラメータを残す。 2ページ、「UPGMA」を選択します。その後、「完了」をクリックします。
   4. 「統計」メニューの「多次元スケーリング... "コマンドを使用して、MDSプロットを取得します。
4. ピークマッチング
   1. 「実験」のパネルで、スペクトルタイプ「MALDI」をクリックします。その後、「レイアウト>の表示画像」を選択します。スペクトルは、ゲルのバンドとして示されている。
   2. 「スペクトラ」メニューの「ピークマッチングを行い "コマンドを使用してピークマッチングを行います。
5. ピーククラスの識別
   1. 主成分分析（PCA）を実行する。強調表示」実験MALDI」の実験タイプ ""パネルと使用し、「PCAを実行するために統計的「メニュー」でコマンドを「主成分分析...。
   2. 2-Wayクラスタリングを実行します。 「比較」ウィンドウの「統計>マトリックスマイニング」を...クリックします。ピークのクラスに一致するピークの強度は、異なる色（ヒートマップ）を用いて表される。

カスタムデータベース5.細菌同定

1. 類似性係数に基づく方法
   1. 比較を作成し、ステップ4.3.3で説明したように「技術の反復 "レベルで質量スペクトルに基づく系統樹を生成する。類似性の比較のために系統樹を保存します。
   2. 「選択したエントリの識別>分析 "未知の質量スペクトルを選択し、クリックします。識別ダイアログボックスが表示されます。
   3. 「比較に基づく「分類器の種類（またはストアドclassifを選択IER）と「次へ」をクリックします。次のページで、「次の「参照比較として保存樹形図を選択し、[OK]をクリックします。
   4. 識別方法として「基本類似性」を選択し、「次へ」をクリックします。
   5. 採点方法として「最大類似性」を選択してください。各パラメータの適切なしきい値と最小差分値を入力し、「次へ」をクリックします。
   6. 計算が完了すると、識別ウィンドウが表示されます。 「結果」パネルで、最高の未知の一致するデータベースのメ​​ンバーが一覧表示されます。
   7. 識別プロジェクトを保存し、「識別プロジェクト」パネルで、「クロス検証解析」コマンドを使用して識別を検証する。
2. 潜在的なバイオマーカーに基づく方法
   1. ピークのクラスを定義します。 「マトリックスマイニング」ウィンドウで、共通の特性を共有するピークのセットを選択し、speciとしてこれらのピークを定義する使用してFICピーククラス（潜在的なバイオマーカー）」スペクトル>ピーククラスタイプの管理...」「比較ウィンドウ」で。
   2. ここでは、すべての15の分離株のために隔離するごとに、特定のピークのクラスを定義します。
   3. 未知数の質量スペクトルを選択し、前述のように定義されたピークのクラスにこれらのスペクトルのピークと一致する。

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結果

このデモで構築したデータベースは、「すべてのレベル」、「種」、それぞれ「生物学的複製」と「技術複製」、（ 図1A）を含む、最高に最低レベルから、4つのレベルを持っていた。 「技術の複製」レベルは技術的反復のすべての前処理されたスペクトルを含んでいた。 「生物学的複製」と「種」レベルはコンポジット（サマリー）スペクトルを含んでいた。 「すべてのレベ?...

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ディスカッション

このデモでは、特性評価およびMALDI-TOF MSおよびカスタム·データベースを使用して、細菌の同定の詳細な手順を示した。例えば、伝統的な分子的方法、16S rDNAの塩基配列決定と比較して、MALDI-TOF MSベースのフィンガープリント法は、多様な細菌のより迅速な識別を容易にする。 、そのロバスト性のため、この技術は、広く環境から臨床現場^1,14-16細菌、ウイルス、真菌および酵母を特?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid	ACROS Organics	163440050	≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software	Bruker Daltonics		version 3.0
Bruker FlexAnalysis software	Bruker Daltonics		version 3.0
Bionumerics software	Applied Maths		version 7.1