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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

Abstract

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Introduzione

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed1. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies1. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank6, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification1.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria1. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium3,7, cultivation time8, sample preparation method3, and matrix used9, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

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Protocollo

Attenzione: i batteri non identificati da qualsiasi ambiente possono essere patogeni e devono essere trattati con cautela utilizzando protocolli di biosicurezza adeguate. Lavora con fermenti vivi deve essere eseguita in un armadio biosicurezza Classe II utilizzando biologica Livello di sicurezza 2 (BSL-2) procedure. Maggiori informazioni su BSL-2 procedure sono disponibili nel manuale CDC / NIH intitolato "biosicurezza in microbiologiche e Biomediche Laboratories," pagine 33-38. Il documento è disponibile online all'indirizzo http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui camici / camici, occhiali di sicurezza e guanti di lattice o di nitrile, deve essere indossato. Pratiche microbiologiche standard e precauzioni devono essere seguite, e rifiuti biologici devono essere eliminati in modo appropriato.

I batteri utilizzati in questa manifestazione sono stati isolati da Kartchner Caverns,AZ, USA, da quattro ambienti, tra cui speleothem secca, pietra flusso, speleothem umido e stalattiti gocciolatoio (Tabella 1). Tutti gli isolati sono stati identificati mediante sequenziamento del 16S rDNA e conservati a -80 ° C in 25% glicerolo-R media 2 B. Tutti gli esperimenti sono stati completati a RT.

Nota: Si consiglia di utilizzare lo stesso metodo di preparazione del campione per acquisire spettri di massa per la costruzione di database e gli spettri di massa di incognite. Metodo di preparazione del campione è stato dimostrato in precedenza di influenzare la qualità dello spettro e riproducibilità 3. Utilizzando un metodo di preparazione del campione diverso può causare non corretta identificazione di incognite, soprattutto quando a risoluzione più elevata tassonomica (es, a livello del ceppo) è desiderato.

1. Deposizione sul MALDI destinazione

Attenzione: Diversi protocolli per ottenere estratti di proteine ​​richiedono l'uso di acidi e solventi organici che devono essere utilizzati in conformità con guidElines e le informazioni contenute nei rispettivi Schede di sicurezza dei materiali (MSDS). Adeguato DPI devono essere indossati e varia in base al tipo e il volume di prodotti chimici utilizzati (ad esempio, camici / camici, guanti, occhiali di sicurezza, e la protezione delle vie respiratorie devono essere utilizzati quando si lavora con grandi quantità di solventi infiammabili, tossiche, come acetonitrile, e acidi corrosivi, come acidi formico e trifluoroacetico).

  1. Deposito 1 ml estratto proteico che non contiene cellule vitali (ottenute utilizzando opportuni protocolli, descritte in precedenza 11-13) su una piastra segnale MALDI acciaio inox e lasciarlo asciugare. Sovrapporre l'estratto proteico secco con una soluzione di matrice 1 ml (soluzione di acido-4-idrossi cinnamico α-ciano-), e lasciarlo asciugare.
  2. Per ogni replica biologica, individuare un numero adeguato di repliche tecnici (da 5 a 20 replicati tecnici). Qui, individuare 10 replicati tecnici per ogni replica biologica e 3 repliche biologiche were preparati.
    Nota: Si consiglia di utilizzare una piastra segnale MALDI acciaio lucido quando si utilizza il metodo di preparazione del campione di estrazione di proteine. Utilizzando piastre di acciaio di destinazione terra può causare la diffusione e la miscelazione involontaria di diversi campioni di fuori dei singoli pozzetti del campione.
  3. Deposito 1 ml calibrante di serie sulla piastra segnale e lasciare asciugare. Sovrapposizione con la soluzione di matrice 1 ml e lasciare asciugare.
  4. Deposito soluzione di matrice 2 microlitri sulla piastra porta come controllo negativo.

2. Mass Spectra Acquisition

  1. Utilizzare uno spettrometro di massa MALDI-TOF dotato di un laser di azoto (λ = 337 nm) e gestito utilizzando il software Bruker FlexControl.
  2. Raccogliere ogni spettro di massa in modalità lineare positiva da accumulo di colpi 500 laser con incrementi colpo 100. Impostare la tensione della sorgente di ioni 1 a 20 kV; sorgente di ioni 2 tensione 18.15 kV; e la tensione lenti a 9,05 kV. Si noti che questi parametri sono strumento di specific e potrebbe richiedere una regolazione su altri strumenti per ottenere risultati ottimali.
  3. Impostare l'intervallo di massa-a-charge per la valutazione dello spettro automatica da 2 a 20 kDa per carica. Utilizzare l'algoritmo di rilevamento di picco baricentro. Impostare la soglia minima risoluzione a 100 Da. Impostare il rapporto segnale rumore (S: N) soglia 2. Impostare la soglia minima di intensità a 100.

3. Database di costruzione

  1. Progettazione di database
    1. Creare un nuovo database in BioNumerics 7.1 utilizzando la "procedura guidata Nuovo database".
    2. Creare un tipo di esperimento spettro, ad esempio, Maldi, utilizzando i comandi nel pannello "Tipi di esperimento".
    3. Creare i livelli utilizzando il "pannello di progettazione del database". Aggiungere nuovi livelli utilizzando il "Livello> Aggiungi nuovo livello ..." comando nel menu "Database". Qui, creare "specie" di livello, "replica biologica" "e" replica tecnici "livello, respectively.
  2. Importazione e pre-elaborazione spettri di massa grezza
    1. Esportare gli spettri di massa crudo come file .txt utilizzando FlexAnalysis cliccando sul pulsante "Esporta> Spettro di massa" comando nel menu "File".
    2. Importare gli spettri di massa grezza (.txt) nel database del livello dei replicati tecnici.
    3. Pre-elaborazione spettri di massa grezza.
      1. Importazione e resample (utilizzando un algoritmo quadratico raccordo).
      2. Eseguire una sottrazione della linea di base (con un disco di rotolamento con una dimensione di 50 punti).
      3. Calcola rumore [continua Wavelet Transformation (CWT)], liscia (Finestra Kaiser con una dimensione della finestra di 20 punti e beta di 10 punti), ed effettuare una seconda sottrazione di base (disco a rotazione con dimensioni di 200 punti).
      4. Rileva picchi [CWT con un segnale minimo di rumore (S: N) di 10].
    4. Dopo la pre-elaborazione, salvare modelli caratteristici di ogni spettro di massa, come le liste contenenti picco piccodimensioni, intensità dei picchi, S: N, ecc, nel database.
  3. Creazione di spettri di massa composita
    1. Creare spettri composito da spettri già preparati usando il comando "Riassumere ..." nel menu "Analisi". Scegliere la "replica biologica" come livello target.
    2. Qui, unire spettri di massa di 10 replicati tecnici della stessa colonia per produrre uno spettro di massa composito per quella colonia, con conseguente tre composito spettri di massa per isolare che a livello "replica biologica".
    3. Qui, riassumere i tre spettri composito per creare uno spettro composito per isolare che a livello "Specie".
      Nota: Lo spettro composito è la media punto per punto dei replicati tecnici. Replica con una similitudine (Pearson di correlazione) alla media di inferiore al 95% (impostazione di default) sono esclusi dal composito. Peaks sul spettri compositi sono chiamati solo se sono presenti nel 75% (impostazione di default) dei replicati inclusi. Per le repliche biologiche, queste impostazioni sono state 90 e 60%, rispettivamente.

Analisi 4. Messa Spectrum dati

  1. Selezionare le voci nel database e creare un confronto facendo clic sul comando "Crea nuovo confronto" nel pannello "Confronti".
  2. Qui, utilizzare gli spettri di massa al "replicare tecnici" e / o livelli "replicati biologica" per visualizzare i confronti e analisi.
  3. Analisi cluster basato somiglianza e scalabilità multi-dimensionale (MDS)
    1. Creare gruppi di colori. Selezionare i tre biologica spettri di massa composita e fare clic su "Crea nuovo gruppo dalla selezione" comando nel menu "gruppi" di creare un gruppo per la corrispondente isolato. Designare un colore usato automaticamente per questi tre spettri di massa.
    2. In alternativa, definire gli stati di campo con i colori corrispondenti utilizzando i comandi del "Database voci pannello "tale che qualsiasi raggruppamento basato su questo campo definito utilizza lo stesso colore definito per questo gruppo.
    3. Eseguire l'analisi cluster. Fare clic sul comando "Calcola cluster analysis" nel menu "Clustering". In Impostazioni di confronto Page 1, selezionare il "Pearson di correlazione" e lasciare gli altri parametri di default. A pagina 2, selezionare "UPGMA". Quindi fare clic su "Fine".
    4. Ottenere una trama MDS utilizzando il "ridimensionamento Multi-dimensionale ..." comando nel menu "Statistica".
  4. Corrispondenza Peak
    1. Cliccate sul tipo di spettro "Maldi" nel pannello "Esperimenti". Quindi selezionare "Layout> Immagine". Spectra sono presenti come bande gel.
    2. Eseguire corrispondenza picco con il comando "Do corrispondente picco" nel menu "Spectra".
  5. Individuazione delle classi di punta
    1. Effettuare analisi delle componenti principali (PCA). Evidenziare il "Maldi "tipo di esperimento nel" sperimentale "del pannello e utilizzare la funzione" Analisi delle Componenti Principali ... "comando nel menu" statistico "per eseguire PCA.
    2. Eseguire due vie clustering. Fare clic su "Statistiche> mining Matrix" ... nella finestra "Confronto". L'intensità dei picchi corrispondenti alle classi di punta è rappresentata utilizzando colori diversi (mappa di calore).

5. Batteri identificazione con un database personalizzato

  1. Metodo coefficiente a base di somiglianza
    1. Creare un confronto e generare un dendrogramma basato su spettri di massa a livello di "replicare tecnici" come descritto al punto 4.3.3. Salvare il dendrogramma per il confronto di similarità.
    2. Selezionare uno spettro di massa sconosciuta, e fare clic su "Analisi> Identificare le voci selezionate". Verrà visualizzata la finestra di dialogo di identificazione.
    3. Selezionare la "base di confronto" tipo classificatore (o un classif memorizzataier) e cliccare su "Avanti". Nella pagina successiva, scegli il dendrogramma salvato come un confronto di riferimento e quindi fare clic su "Avanti".
    4. Scegliere la "somiglianza di base" come un metodo di identificazione e quindi fare clic su "Avanti".
    5. Scegliere la "somiglianza Massimo" come metodo di punteggio. Digitare appropriati valori soglia e valori minimi di differenza per ogni parametro e quindi fare clic su "Avanti".
    6. Una volta che i calcoli sono stati completati, viene visualizzata la finestra di identificazione. Nel "Risultati" pannello, vengono elencati i membri del database che meglio corrispondono l'ignoto.
    7. Salvare il progetto di identificazione e validare l'identificazione con il "analisi cross-validazione" comando nel pannello "progetto di identificazione".
  2. Potenziale metodo basato biomarcatore-
    1. Definire le classi di picco. Nella finestra "Matrix Mining", selezionare serie di cime che condividono caratteristiche comuni e definire questi picchi come speciclassi fic picco (potenziali biomarkers) usando "Spectra> Gestisci tipi di classe picco ..." nella "finestra di confronto".
    2. Qui, definire classi di picco specifici per ogni isolano per tutti i 15 isolati.
    3. Selezionare spettri di massa di incognite e abbinare i picchi di questi spettri alle classi picchi definiti come precedentemente descritto.

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Risultati

Le basi di dati costruiti in questa manifestazione ha avuto quattro livelli, dal più alto al più basso livello, tra cui "tutti i livelli", "Species", "replica biologica" e "replicare tecnici", rispettivamente (Figura 1A). La "replica tecnici" livello conteneva tutti gli spettri di pre-elaborato replicati tecnici. La "replica Biologica" e livelli di "specie" contenevano il (sommario) spettri composito. "Tutti i livelli" con...

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Discussione

Questa dimostrazione ha mostrato le procedure dettagliate di caratterizzazione e identificazione di batteri utilizzando MALDI-TOF MS e un database personalizzato. Rispetto ai metodi tradizionali molecolari, per esempio, metodi di impronte 16S rDNA sequenziamento, MS MALDI-TOF facilitano più rapida identificazione di diversi batteri. A causa della sua robustezza, questa tecnica è ampiamente utilizzata per caratterizzare i batteri, virus, funghi e lieviti dall'ambiente e in ambito clinico 1,14-16. Inoltre...

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Divulgazioni

Authors Vranckx and Janssens are employees of Applied Maths NV, the manufacturer of data analysis software used in this video. Applied Maths NV provided select software modules highlighted in this video as well as a portion of the publication costs associated with this video.

Riconoscimenti

This work was supported by the New College of Interdisciplinary Arts and Sciences at Arizona State University, Applied Maths NV, and by the National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the author(s) and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acidACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bruker FlexAnalysis softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bionumerics softwareApplied Mathsversion 7.1

Riferimenti

  1. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  2. Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
  3. Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
  4. Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
  5. Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
  6. Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
  7. Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
  8. Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
  9. Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
  10. Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
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  15. Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
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  17. Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
  18. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).

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