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요약

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

초록

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

서문

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed1. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies1. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank6, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification1.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria1. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium3,7, cultivation time8, sample preparation method3, and matrix used9, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

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프로토콜

주의 : 모든 환경에서 미확인 된 박테리아는 병원성 할 수 있으며, 적절한 바이오 안전성 프로토콜을 사용하여주의하여 취급해야합니다. 라이브 문화에 대한 작업은 생물 안전 레벨 2 (BSL-2) 절차를 사용하여 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. BSL-2 절차에 대한 자세한 내용은 페이지 33-38 "미생물 및 생물 의학 연구소에서 바이오 안전성"CDC / NIH의 제목 설명서,에서 사용할 수 있습니다. 문서에서 온라인으로 볼 수 있습니다 http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . 실험복 / 가운, 보호 안경, 니트릴 또는 라텍스 장갑을 포함 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다. 표준 미생물 학적 방법과주의 사항을 준수해야하며, 생물학적 폐기물은 적절히 폐기해야합니다.

이 데모에 사용 된 박테리아는 Kartchner 동굴에서 분리되었다,AZ, USA, 건조 스펠 레오 뎀, 흐름 돌, 촉촉한 스펠 레오 뎀과 종유석 드립 (표 1) 등 4 개 환경에서. 모든 균주의 16S rDNA 염기 서열 분석에 의해 확인 된 25 % 글리세롤 2 B-R 매체에서 -80 ° C에 보관 하였다. 모든 실험은 실온에서 완료 하였다.

참고 : 우리는 데이터베이스 구축 및 미지의 질량 스펙트럼에 대한 질량 스펙트럼을 획득하기 위해 같은 샘플 준비 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 시료 제조 방법은 스펙트럼의 품질 및 재현성에 영향을 미치는 세 이전에 도시되었다. 다른 샘플 준비 방법을 사용하는 것은 바람직하다 (변형 수준에서 예) 미지의 잘못된 식별, 특히 높은 분류 학적 해상도의 원인이 될 수 있습니다.

MALDI 대상 1. 증착

주의 : 여러 프로토콜 단백질 추출물 GUID에 따라 이용해야 산 및 유기 용매의 사용을 필요로 수득각각의 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)에 포함 elines 및 정보. 적절한 보호구 착용해야하며, 사용되는 화학 물질의 종류와 양에 따라 달라집니다 (예를 들어, 아세토 니트릴 등의 독성, 가연성 솔벤트의 상당 수, 작업 할 때 / 가운, 장갑, 보호 안경, 그리고 호흡 보호 장치를 사용해야합니다 실험실 코트, 포름산과 트리 플루오로 산과 같은 부식성 산).

  1. 스테인레스 스틸 MALDI 표적 판에하고 건조 할 수 있도록 (해당 앞에서 설명한 프로토콜 11-13을 사용하여 얻은)에는 가능한 세포를 포함하지 않는 단백질 추출물 μL 보증금 1. 1 ㎕의 매트릭스 용액 (α 아노 -4- 하이드 록시 - 신 남산 용액)와 단백질 건조 추출물을 오버레이하고 건조시켜야.
  2. 각 생물 복제의 경우, 기술 복제합니다 (5-20 기술 회 반복) 적절한 수의 자리. 여기서, 각 생물 복제에 대 한 (10) 기술 복제하고 3 생물 복제합니다 w를 발견오히려 준비했다.
    참고 : 우리는 단백질 추출 시료 전처리 법을 이용하는 경우 연마 MALDI 스틸 타겟 판을 사용하는 것을 권장. 스틸 그라운드 대상 플레​​이트를 사용하여 확산 및 개별 샘플 우물 외부의 다른 샘플의 의도하지 않은 혼합의 원인이 될 수 있습니다.
  3. 보증금 1 μL의 calibrant의 대상 판에 표준이 건조 할 수 있습니다. 1 μL 매트릭스 솔루션을 오버레이하고 건조 할 수 있습니다.
  4. 음성 대조군으로 대상 접시에 보증금 2 μL 매트릭스 솔루션입니다.

2. 질량 스펙트럼 취득

  1. 질소 레이저 (λ = 337 ㎚)를 구비 한 MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 브루 커 FlexControl 소프트웨어를 이용하여 동작.
  2. 100 샷 단위로 500 레이저 샷의 축적에 의해 긍정적 인 선형 모드에서 각 질량 스펙트럼을 수집합니다. 20kV의에 이온 원 (1) 전압을 설정; 이온 소스 (2) 18.15 kV의 전압을; 및 9.05 kV의에 렌즈 전압. 이러한 매개 변수는 악기 정시 참고및 FIC는 최적의 결과를 얻기 위해 다른 악기에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.
  3. 충전 당 2 ~ 20 kDa의 자동화 된 스펙트럼 평가를위한 대량으로 충전 범위를 설정합니다. 중심 피크 검출 알고리즘을 사용합니다. (100) 다에서 최소 해상도 임계 값을 설정합니다. 100에서의 최소 세기 임계 값을 설정 2.에서 역치 잡음비 (S N)에 신호를 설정한다.

3. 데이터베이스 건설

  1. 데이터베이스 설계
    1. "새 데이터베이스 마법사"를 사용하여 BioNumerics 7.1에서 새 데이터베이스를 만듭니다.
    2. "실험 유형"패널에서 명령을 사용하여 스펙트럼 실험 유형, 예를 들어,을 Maldi를 만듭니다.
    3. "데이터베이스 디자인 패널"을 이용하여 레벨을 작성합니다. 사용하여 새로운 수준의 추가 "데이터베이스"메뉴의 명령 "레벨> 새로운 차원의 ... 추가". 여기에, "종"수준 "생물 복제"수준 "과"기술 복제 "수준 respectiv를 만들엘리.
  2. 가져 오기 및 원시 질량 스펙트럼을 전처리
    1. "파일"메뉴에서 "내보내기> 질량 스펙트럼"명령을 클릭하여 FlexAnalysis를 사용하여 .txt 파일로 원시 질량 스펙트럼을 보냅니다.
    2. 복제물 기술적 수준에서 데이터베이스로 원료 질량 스펙트럼 (.txt 파일)를 가져.
    3. 원시 질량 스펙트럼을 미리 처리.
      1. 가져 오기 및 재 샘플 (차 피팅 알고리즘을 사용하여).
      2. (50 점의 크기와 회전 디스크 포함) 기준 빼기를 수행합니다.
      3. (창 20 점의 크기와 10 점의 베타 카이저 창) 소음 [연속 웨이블릿 변환 (CWT)], 부드러운을 계산하고, 두 번째 기본 공제 (200 점의 크기와 디스크를 압연)을 수행합니다.
      4. [: 10 (N S) 잡음 비율 최소한의 신호와 CWT] 피크를 감지합니다.
    4. 전처리 한 후, 같은 피크를 포함하는 피크 목록과 같은 각각의 질량 스펙트럼의 특성 패턴을 저장크기, 피크 강도, S : 데이터베이스 N 등.
  3. 복합 질량 스펙트럼을 만들기
    1. "분석"메뉴의 "... 요약"명령을 사용하여 사전 처리 된 스펙트럼에서 복합 스펙트럼을 만듭니다. 목표 수준으로 "생물 복제"를 선택합니다.
    2. 여기에서, "생물 복제"수준에서 그 분리에 대 한 세 가지 복합 질량 스펙트럼의 결과로, 그 식민지의 복합 질량 스펙트럼을 산출하기 위해 같은 식민지의 10 기술 복제물의 질량 스펙트럼을 결합한다.
    3. 여기, 즉 "종"레벨에서 분리하기위한 하나의 복합 스펙트럼을 생성하기 위해 세 가지 복합 스펙트럼을 요약한다.
      참고 : 복합 스펙트럼은 기술 복제물의 포인트 별 평균입니다. 95 % 이상 (기본 설정)의 평균 유사도 (피어슨 상관 관계)를 복제 복합에서 제외됩니다. 그들은 (75 %에있는 경우 복합 스펙트럼의 봉우리 만이라고합니다포함 된 복제물의 기본 설정). 생물학적 복제판 들어, 이러한 설정은 각각 90 및 60 %였다.

4. 질량 스펙트럼 데이터 분석

  1. 데이터베이스의 항목을 선택하고 "비교"패널에서 "새로운 비교 만들기"명령을 클릭하여 비교를 만들 수 있습니다.
  2. 여기에, 비교 및​​ 분석을 보여주기 위해 "기술 복제"및 / 또는 "생명 복제"수준에서 질량 스펙트럼을 사용합니다.
  3. 비슷한 기반 클러스터 분석과 다차원 스케일링 (MDS)
    1. 색상 그룹을 만듭니다. 세 가지 생물학적 복합 질량 스펙트럼을 선택하고 해당 분리에 대 한 그룹을 만듭니다 "그룹"메뉴의 명령 "선택에서 만들기 새 그룹"을 클릭합니다. 자동 이러한 세 질량 스펙트럼에 사용 색을 지정한다.
    2. 또한,의 명령을 사용하여 해당 색상으로 필드 상태를 정의하는 "이 정의 필드를 기준으로 모든 그룹이 그룹에 대해 정의 된 같은 색을 사용하도록 데이터베이스 항목 "패널.
    3. 클러스터 분석을 수행합니다. "클러스터링"메뉴의 "클러스터 분석을 계산"명령을 클릭합니다. 비교 설정 1 페이지, "피어슨 상관 관계"를 선택하고 기본값으로 다른 매개 변수를 둡니다. 2 페이지에서 "UPGMA"를 선택합니다. 그런 다음 "마침"을 클릭합니다.
    4. "통계"메뉴의 MDS를 사용하여 플롯 "다차원 스케일링을 ..."명령을 얻습니다.
  4. 피크 일치
    1. "실험"패널의 스펙트럼 유형 "을 Maldi"을 클릭합니다. 그런 다음 "레이아웃> 이미지보기"를 선택합니다. 스펙트럼 겔 밴드로 표시됩니다.
    2. "스펙트럼"메뉴에서 "피크 일치를 수행"명령을 사용하여 피크 매칭을 수행합니다.
  5. 피크 클래스 식별
    1. 주성분 분석 (PCA)을 수행. 강조 "MALDI 실험 "실험의 유형" "패널과 사용"PCA를 수행하는 통계 "메뉴"에서 명령 "주 구성 요소 분석을 ....
    2. 양방향 클러스터링을 수행합니다. "비교"창에서 "통계> 매트릭스 마이닝을 ..."을 클릭합니다. 피크 클래스에 정합 피크의 세기는 서로 다른 색상 (열 맵)를 이용하여 표현된다.

사용자 지정 데이터베이스 5. 박테리아 식별

  1. 비슷한 계수 기반 방법
    1. 비교를 만들고 단계 4.3.3에 설명 된대로 "기술 복제"수준의 질량 스펙트럼을 기반으로 Dendrogram이를 생성합니다. 유사성의 비교를 위해 Dendrogram이를 저장합니다.
    2. "선택 항목을 확인> 분석"알 수없는 질량 스펙트럼을 선택하고을 클릭합니다. 확인 대화 상자가 나타납니다.
    3. "비교를 기반으로"분류 유형 (또는 저장 classif를 선택IER) 및 "다음"을 클릭합니다. 다음 페이지에서 참조 비교로 저장 Dendrogram이를 선택하고 "다음"을 클릭합니다.
    4. 식별 방법으로 "기본 유사성"을 선택하고 "다음"을 클릭합니다.
    5. 채점 방법으로 "최대 유사성"을 선택합니다. 각 매개 변수에 대한 적절한 임계 값과 최소값의 차이 값을 입력하고 "다음"을 클릭합니다.
    6. 계산이 완료되면, 확인 창이 나타납니다. "결과"패널에서 가장 잘 알 수없는 일치하는 데이터베이스의 구성원이 나열됩니다.
    7. 식별 프로젝트를 저장하고 "확인 프로젝트"패널에서 "교차 유효성 검사 분석"명령을 사용하여 ID를 확인합니다.
  2. 잠재적 바이오 마커 기반 방법
    1. 피크 클래스를 정의합니다. "매트릭스 광업"창에서 공통적 인 특징을 공유하는 피크 세트를 선택하고 정시 이러한 피크를 정의FIC 피크 클래스 (잠재적 인 바이오 마커)를 사용하여 "스펙트럼> 피크 클래스 유형을 ... 관리" "비교 창"에서.
    2. 여기에, 모든 15 균주에 대한 격리 각 특정 피크 클래스를 정의합니다.
    3. 미지의 질량 스펙트럼을 선택하고, 전술 한 바와 같이 정의 피크 클래스 이러한 스펙트럼의 피크와 일치.

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결과

이 데모에 건설 데이터베이스는 "종", "생물 복제"와 "기술 복제"각각 (그림 1A)을 포함한 "모든 레벨"최고에서 최저 수준을 4 단계를했다. "기술 복제"수준의 기술 복제물의 모든 전처리 스펙트럼을 포함. "생물 복제"와 "종"레벨은 복합 (요약) 스펙트럼을 포함. "모든 레벨"모든 기술적 복제 스펙트럼뿐만 아니라 모든 복합 스펙...

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토론

이 데모는 특성화 및 MALDI-TOF MS와 사용자 지정 데이터베이스를 사용하여 세균의 식별의 세부 절차를 보여 주었다. 예를 들어 전통적인 분자 방법과 비교하여, 16S rDNA의 염기 서열, MALDI-TOF MS 기반 지문 방법은 다양한 박테리아의보다 신속한 식별을 용이하게한다. 견고성으로 인해,이 기술은 널리 임상 환경에서 설정 1,14-16에서 박테리아, 바이러스, 곰팡이 및 효모를 특성화하기 위해 사용된...

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공개

Authors Vranckx and Janssens are employees of Applied Maths NV, the manufacturer of data analysis software used in this video. Applied Maths NV provided select software modules highlighted in this video as well as a portion of the publication costs associated with this video.

감사의 말

This work was supported by the New College of Interdisciplinary Arts and Sciences at Arizona State University, Applied Maths NV, and by the National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the author(s) and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acidACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bruker FlexAnalysis softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bionumerics softwareApplied Mathsversion 7.1

참고문헌

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