懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

要約

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

要約

電気インパルスへの光の変換は、網膜の外側で発生し、桿体および錐体光受容体および網膜色素上皮（RPE）細胞によって主に達成される。 RPEは、光受容体と死亡またはRPE細胞の機能障害、加齢黄斑変性症（AMD）、人々の年齢55歳以上で永久的な失明の主要な原因の特徴であるための重要なサポートを提供します。 AMDの治療法は同定されていないが、罹患した眼における健康RPEの移植が有効な治療であることを証明することができ、RPE細胞の多数は容易に多能性幹細胞から生成することができる。 RPE細胞送達の安全性および有効性に関するいくつかの興味深い問題は、依然として動物モデルにおいて試験することができ、RPEを注入するために使用される広く受け入れられたプロトコルが開発されている。ここに記載された技術は、様々な研究に複数のグループによって使用されており、最初の鋭い針で目に穴を作成することを含む。ブルーレイとシリンジ細胞を装填した針が穴を通って挿入され、それは穏やかにRPEに接触するまで、硝子体を通過するのnt。比較的単純であり、最小限の設備を必要とするこの注入法を用いて、動物モデルにおける光受容体変性のかなりの量を防止するホストRPEとの間に幹細胞由来のRPE細胞の一貫性のある効率的な統合を達成する。実際のプロトコルの一部ではないが、我々はまた、注射によって誘導外傷の程度を決定する方法について説明し、どのように細胞は、生体内の画像診断法で使用して網膜下腔に注入したことを確認します。最後に、このプロトコルの使用は、RPE細胞に限定されるものではない。それが網膜下腔への任意の化合物又は細胞を注入するために使用することができる。

概要

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

プロトコル

注：すべての動物は、スクリップス研究所によって確立倫理指針に従って処理した。

注射用材料の作製（〜20分）

1. 前加温細胞解離溶液（好ましくは血清を、希釈によって不活性化されているもの）、滅菌PBS、および培養培地（ 表1）。
2. それを分解し、15分間水で部品を沸騰させることによりブラントニードル付きシリンジを殺菌する。

注射用RPE細胞の調製（1時間に約30分）

1. 37℃で5-8分間予め温め細胞解離溶液を使用してRPE細胞を切り離す。
2. まだ接続されているものを解放するために静かに細胞をこすり。
3. 解離溶液を不活性化し、それらをカウントする（15mlチューブを埋める）培地の大容量で細胞を希釈する。
4. 細胞をペレットに5分間800×gで遠心分離する。
5. 無菌予め温めPBSに（0.5μlのボリュームに100,000細胞を提供するために）/μL200,000細胞で細胞を​​再懸濁し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにそれらを転送する。
6. 必要に応じて、生細胞一過性の蛍光マーカーを追加し、30〜45分間37℃でインキュベートする。
7. 細胞の0.5μlの鈍針で注射器をロードします。できるだけ早く細胞を注入する。

3.網膜下注射（注射当たり〜5分）

注：可能であれば、輪部の血管が視覚化する方がはるかに簡単であるため、大人のアルビノラットとテクニックを学ぶ。より簡単に注射部位の視覚化を容易にするために、（細胞を注入しようとする前に）学習するときにファストグリーンソリューションを注入。

1. 齧歯類を麻酔。 100 mg / mlのケタミンおよび10mg / mlのキシラジンの腹腔内注射（20μL/ 10グラムボディWを使用して、イソフルラン吸入以上8個）が、げっ歯類を操縦し、吸入器で鼻と眼の中に注入することが困難であるため。
   1. 動物が深く、その足の1をつまんで麻酔をかけていることを確認します。それはフリンチ行動する場合は、さらに数分待ってから網膜下注射を開始する前に、再試行してください。
2. 注入されます目を天井に直面しているように、その側に齧歯類を配置します。
3. 目がソケット（一時的な眼球突出）からわずかに浮き上がるとちょうど耳の上とその顎によると優しくまぶたに皮膚と平行に伸びる2本の指で頭を保持することで、よりアクセス可能になるように解剖顕微鏡下で優しく肌を伸ばす目が（ 図1Cを参照してください）わずかにソケットから飛び出して外れるようにします。喉に近すぎる齧歯類を把握しないでください。
4. 30 Gシャープ使い捨て滅菌済み注射針を使用すると、血管がヒットしている場合は、出血をbします（すぐに輪部の下に穴を作る重要なメールと、後で穴を見つけることは困難である）との角度で針（ 図1D）でレンズに触れないように。発生するシャープ（または鈍い）針または即時白内障形成のレンズに触れないようにしてください。
   注：注射は2人とのより良い仕事。このように1人は、彼らが穴がどこに焦点を維持するために、鋭利な使い捨て針で最初の穴を作成した後に注入を行う人に鈍い針で注射器を渡すことができます。
5. 頭の上にグリップを維持しながら、眼から使い捨て鋭い針を撤回。穴がある場所を正確に覚えておいてください。
6. マイクロマニピュレータに鈍い針で事前にロードされた注射器を取り付けたり、手でそれを保持しているいずれかの後、穴を介して鈍針で注射器の先端を挿入し、レンズに触れないように再び注意しながら、静かに目を通してそれをプッシュするとても優しく感じ抵抗（ 図1D）まで、。
7. K最小限にすべての動きをeeping、慎重にゆっくりと網膜下腔へのRPE細胞を注入する。
   注：RPE /網膜剥離が誘発されます。これは避けられない。しかし、クリーナー注入は剥離を最小限に抑え、大幅に再付着（ 図1E）の可能性を向上させます。任意の誇張された動きが戻って網膜に針を移動させることができる、と横の動きが網膜を損傷することがあります。噴射ポンプの使用は任意であるが、非常に正確な送達を可能にする。
8. ゆっくりと注射器を撤回。目の保湿を適用することは、水和目を維持するためにドロップされます。
9. それは胸骨横臥位を取り戻すまで、動物を監視し続ける。それは胸骨横臥位を取り戻すまで、無人の動物を残したり、他の警報動物とケージに戻らないでください。

結果

我々は、この原稿に記載された技術を使用して迅速かつ一貫してげっ歯類の網膜下腔へのRPE細胞の懸濁液を提供することができます。必須ではありませんが、外傷が大幅に図1A＆Bでマイクロマニピュレーターで示した設定を使用して最小限に抑えることができます。一時的な眼球突出については、図1（c）に示すように齧歯類を持ってください。マイクロマニピュレ?...

ディスカッション

この記事では、ラットおよびマウス中に懸濁したRPE細胞の網膜下注射を実行するための比較的簡単な方法を記載する。プロトコルは、学習が容易で技術に多くの経験が（ 図3;これは、より良い注射のうちの1つを表す）より少ない外傷に翻訳し、マイクロマニピュレーターが（ 図1A）を使用している場合は特に。任意の外傷CSLOおよびOCTシステム（ 図2）利...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1