Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Riepilogo

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Abstract

La conversione della luce in impulsi elettrici avviene nella retina esterna e si realizza in gran parte da coni e bastoncelli fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) cellule. RPE fornisce il supporto critico per fotorecettori e la morte o la disfunzione delle cellule RPE è caratteristico di età degenerazione maculare (AMD), la principale causa di perdita permanente della vista nelle persone 55 anni in su. Mentre è stato identificato alcuna cura per AMD, l'impianto di RPE sana in occhi malati potrebbe rivelarsi essere un trattamento efficace, e un gran numero di cellule RPE può essere facilmente generato da cellule staminali pluripotenti. Molte domande interessanti per quanto riguarda la sicurezza e l'efficacia della consegna delle cellule RPE possono ancora essere esaminate in modelli animali, e sono stati sviluppati protocolli ben accettate utilizzati per iniettare RPE. La tecnica qui descritta è stata utilizzata da più gruppi in vari studi e implica prima la creazione di un foro in un occhio con un ago tagliente. Poi una siringa con un blunt ago caricato con cellule viene inserito attraverso il foro e attraverso il vitreo fino a toccare delicatamente il RPE. Usando questo metodo di iniezione, che è relativamente semplice e non richiede attrezzatura minima, otteniamo integrazione coerente ed efficiente di cellule RPE cellule staminali derivate tra RPE host che impedisce quantità significativa di fotorecettori degenerazione in modelli animali. Pur non parte del protocollo attuale, abbiamo anche descritto come determinare l'entità del trauma indotto dall'iniezione, e come verificare che le cellule sono state iniettate nello spazio sottoretinico usando modalità di imaging in vivo. Infine, l'uso di questo protocollo non è limitato alle cellule RPE; può essere utilizzato per iniettare qualsiasi composto o cella nello spazio sottoretinico.

Introduzione

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

Protocollo

NOTA: Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida etiche stabilite dalla Scripps Research Institute.

1. Preparazione di materiali per l'iniezione (~ 20 min)

1. Soluzione dissociazione cellulare Pre-caldo (preferibilmente uno che è inattivato tramite diluizione, non con siero), PBS sterile, e mezzi di coltura (Tabella 1).
2. Sterilizzare la siringa con un ago smussato smontando e bollendo le parti in acqua per 15 min.

2. Preparazione delle cellule RPE per iniezione (~ 30 minuti a 1 ora)

1. Staccare le cellule RPE utilizzando soluzione dissociazione delle cellule pre-riscaldato per 5-8 minuti a 37 ° C.
2. Raschiare le cellule delicatamente per rilasciare qualsiasi che sono ancora attaccato.
3. Diluire le cellule con un grande volume di coltura (riempire una provetta da 15 ml) per inattivare la soluzione di dissociazione e contarli.
4. Centrifugare a 800 xg per 5 minuti per far sedimentare le cellule.
5. Risospendere le cellule a 200.000 cellule / microlitro (per fornire 100.000 cellule in un volume di 0,5 ml) in PBS sterile preriscaldata e trasferirli in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
6. Facoltativamente, aggiungere un marcatore fluorescente transitoria cellule vive e incubare a 37 ° C per 30-45 min.
7. Caricare la siringa con un ago senza punta con 0,5 ml di cellule. Iniettare le cellule appena possibile.

3. Sub-retinica Injection (~ 5 min per iniezione)

NOTA: Se possibile, imparare la tecnica con ratti albini adulti, poiché le imbarcazioni limbus sono molto più facili da visualizzare. Iniettare veloce soluzione verde quando l'apprendimento (prima di tentare di iniettare le cellule) per agevolare più facilmente la visualizzazione del sito di iniezione.

1. Anestetizzare il roditore. Utilizzare iniezioni intraperitoneali di 100 mg / ml ketamina e 10 mg / ml xilazina (20 microlitri / 10 g corpo wotto) su inalazione isofluorano poiché è difficile da manovrare il roditore e iniettare nell'occhio col muso nella inalatore.
   1. Assicurarsi che l'animale è profondamente anestetizzato pizzicando una delle sue zampe. Se indietreggia, attendere alcuni minuti e riprovare prima di iniziare l'iniezione sottoretinico.
2. Posizionare il roditore su un lato in modo che l'occhio che verrà iniettata è rivolto verso il soffitto.
3. Sotto un microscopio da dissezione allungare delicatamente la pelle così l'occhio si apre un po 'fuori dal socket (proptosi temporaneo) e diventa più accessibile tenendo la testa con due dita appena sopra l'orecchio e per la sua mascella e allungare delicatamente la pelle parallela alle palpebre in modo che l'occhio si apre un po 'fuori dal socket (Vedi Figura 1C). Non afferrare il roditore troppo vicino alla gola.
4. Con un forte ago pre-sterilizzato monouso 30 G, fare un buco immediatamente sotto il limbus (se le navi sono colpiti, sanguinamento si ball'e significativo e che sia difficile trovare il foro di seguito) e un angolo per evitare di toccare la lente con l'ago (Figura 1D). Evitare di toccare l'obiettivo con l'ago affilato (o spuntato) o immediata formazione di cataratta si verificherà.
   NOTA: Le iniezioni funzionano meglio con due persone. In questo modo una persona può passare la siringa con l'ago smussato alla persona che esegue l'iniezione dopo aver creato il primo foro con l'ago monouso affilato per mantenere la concentrazione sul dove il foro.
5. Allontanare l'ago appuntito monouso dall'occhio mantenendo la presa sulla testa. Ricorda esattamente dove il buco è.
6. Dopo il montaggio o la siringa pre-caricato con un ago senza punta su un micromanipolatore o tenendolo per mano, inserire la punta della siringa con l'ago senza punta attraverso il foro, prendendo di nuovo attenzione a non toccare l'obiettivo e spingere delicatamente attraverso l'occhio molto delicatamente fino a sentire resistenza (Figura 1D).
7. Keeping tutti i movimenti al minimo, iniettare attentamente le cellule RPE lentamente nello spazio sottoretinico.
   NOTA: il distacco RPE / retina sarà indotta; questo è inevitabile. Tuttavia, una iniezione di detergente minimizza il distacco e migliora notevolmente le possibilità di riattacco (Figura 1E). Eventuali movimenti esagerati possono spostare l'ago nella retina, e movimenti laterali possono danneggiare la retina. L'impiego di una pompa di iniezione è opzionale ma permette una consegna molto precisa.
8. Ritrarre la siringa lentamente. Applicare idratante collirio per mantenere l'occhio idratato.
9. Continuare a monitorare l'animale fino a che riacquista decubito sternale. Non lasciare animali incustoditi o tornare a una gabbia con altri animali allarme fino a quando riacquista decubito sternale.

Risultati

Possiamo fornire una sospensione di cellule RPE nello spazio sottoretinico di roditori rapidamente e costantemente usando la tecnica descritta in questo manoscritto. Anche se non richiesto, traumi possono essere notevolmente ridotti al minimo con la configurazione mostrata con un micromanipolatore in Figura 1A & B. Mantenere il roditore come mostrato nella Figura 1C per proptosis temporanea. I passaggi sono gli stessi, se eseguita con micromanipolatore oa mano; questi sono rappresen...

Discussione

In questo articolo si descrive un metodo relativamente semplice per eseguire iniezioni subretiniche di cellule RPE in sospensione in ratti e topi. Il protocollo è facile da imparare e più esperienza con la tecnica si tradurrà in un minor numero di traumi (Figura 3, che rappresenta una delle iniezioni migliori), specialmente se viene utilizzato un micromanipolatore (Figura 1A). Qualsiasi trauma può essere monitorata in vivo con un sistema cSLO e PTOM (Figura 2)

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1