フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

要約

流れから白血球を募集する炎症を起こした内皮の能力は、間葉系間質細胞によって調節されている。我々は、フローからの好中球動員を評価し、間葉系間質細胞は、このプロセスの調節に果たす役割を調べるために使用することができる一次ヒト細胞を組み込んだ2 のインビトロモデルを記述する。

要約

間質細胞は、隣接する内皮細胞とのクロストークを通じて炎症の間に循環白血球の動員を調節する。ここでは、炎症を起こした内皮細胞によって流れから循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。また、両方のモデルは、白血球動員を調節する際に、この場合、間葉系幹細胞（MSC）は、間質細胞の役割を研究するために適合させることができる方法を記載している。

初代内皮細胞は、Ibidiマイクロスライド上または24時間トランスウェルフィルターの両側に直接接触したヒトMSCを単独で、または一緒に培養した。培養物を、4時間、腫瘍壊死因子α（TNFα）で刺激し、フローベースの接着アッセイに組み入れた。好中球のボーラスを灌流した4分間の内皮上。好中球と内皮との相互作用を流れるの捕獲は位相差顕微鏡により可視化した。

両方のモデルでは、サイトカイン刺激は、用量依存的に流れる好中球の内皮細胞の動員を増加させた。動員された好中球の挙動の分析は、ローリングの用量依存的減少および内皮を通じて遊走の用量依存的増加を示した。共培養では、MSCは、TNFαで刺激された内皮への好中球の接着を抑制した。

当社のフローベースの接着モデルが循環から白血球動員の初期段階を模倣する。白血球に加えて、彼らはそのような治療的に投与MSCまたは循環腫瘍細胞のような他の細胞型の動員を調べるために使用することができる。我々の多層共培養モデルは、MSCが炎症性サイトカインに対する応答を変更するために内皮と通信することが示されている、alteri好中球の動員をngの。このようなモデルを用いてさらに研究が完全に炎症中の白血球の動員をどのように影響するか、間質の異なる組織や条件から細胞（炎症性疾患または癌）を理解するために必要とされている。

概要

炎症は、微生物感染または白血球に入ると解像度^1,2を可能にするために炎症を起こした組織からの出口の厳しい規制を必要とする組織損傷に対する防御応答である。内皮細胞（EC）、その行血管、循環白血球および組織常駐間質細胞の間のクロストークは、このプロセス^3を調整^するために不可欠である。しかし、白血球およびそれらの無効なクリアランスの制御されない動員は、慢性炎症性疾患⁴の発展を支える。健康および疾患における白血球動員の我々の現在の理解は不完全であり、より堅牢なモデルは、このプロセスを分析するために必要とされる。

後毛細血管細静脈の血管ECを通して血液から白血球の動員を支援するメカニズムはよく^1,2,5に記載されている。循環白血球は、特殊な受容体（ 例えば、VCAM-1、E-セレクチン、P-セレクチン）によって捕捉される炎症性内皮上にアップレギュレートされている。これらの一時的な相互作用は、白血球が表面に結合したケモカインおよび白血球^{、6- 11}で表さインテグリンを活性化する脂質由来メディエーター（起源の内皮または間質のいずれか）と対話することを可能にする。これは、次に接着性を安定化し、内皮を横断し、組織^12〜15への移行を駆動する。組織内では、白血球がそれらの運動性、機能および生存^16,17に影響^を与える間質由来物質にさらされている募集。成長している証拠は、信号は、次のために募集プロセス条件白血球の各段階で受信したことを示唆している。しかし、白血球動員の我々の理解は不完全のままと非常に少ないが、組織内のコンポーネント整形白血球の動きについて知られている。

バーミンガムでは、からの白血球の動員を研究するためのin vitroでのいくつかの「血管」モデルを開発してきました流れ^9,18,19。私たちは現在、白血球動員の血管のEC行為として即時の規制当局は、地元の微小環境の変化に対応していることを理解しています。具体的には、組織常駐間質細胞が活発に動員³におけるそれらの役割に影響を与えるために、隣接する血管ECと会話によって部分的に、炎症反応を調節することができる。我々は以前、様々な間質細胞は、組織特異的に接着および白血球の移動をサポートするECの能力を調節することが示されており、これらの効果は、慢性疾患^13,16,20,21における変化したことになる。このように、間質細胞を各炎症反応²²のコンテキストを定義する組織「アドレスコード」を確立する。より最近では、我々は、骨髄由来MSC（BMMSC）は強力両方の好中球の動員の低下につながる、サイトカインに対するECの応答をダウンレギュレートし^{、23リンパ}球ことを実証した。

メカニズムGOVerning募集が明らかにin vitroでは、主に分離して単一の細胞型（ 例えば、EC）またはタンパク質を組み込んだアッセイを使用している。しかし、これらの研究を考慮に入れていない局所組織環境の影響（ すなわち、間質細胞の存在）の白血球の動員に関する組織へのそれらのその後の移行。ここでは、間質細胞は、特に間葉幹細胞た二フローベースの方法（MSC）を表すEC ²³と共培養する。このようなモデルは、流れから白血球動員をサポートするために、特に能力、我々は、内皮応答に対する間質細胞の効果を調べることを可能にする。

プロトコル

初代ヒト内皮細胞と間葉系幹細胞の単離および培養

1. ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の単離および培養：
   1. ペーパータオルでトレイにへその緒を入れて、70％エタノールでスプレー。組織培養フードに置きます。両端の静脈とカニューレを挿入を識別します。それを確保するためにカニューレを挿入端部の周りにケーブルタイを配置します。
   2. PBSを注射器を使用して静脈血を洗浄する。空気で注射器を記入し、残留PBSを除去し、廃棄するように静脈を通過する。
   3. 10 mg / mlのコラゲナーゼタイプIaの解凍および1mg / mlの最終濃度にPBSで1:10（カルシウムとマグネシウムと塩化）を希釈する。両方のカニューレが満たされるまで、静脈内にコラゲナーゼ溶液を渡します。両端にカニューレ上のクランプを閉じます。
   4. 組織とトレイをカバーし、70％エタノールでスプレー。 37℃で20分間、5％CO ₂インキュベーターにコードを配置します。
   5. コー​​ドを取り出しインキュベーターのとケーブルタイを締めます。 1分間静かにコードをマッサージします。 10mlのPBSで細胞懸濁液を洗​​浄し、50 ml遠心チューブに集める。
   6. 空気をシリンジに充填し、ステップ1.1.5で使用されるの50ml遠心分離管にPBSを集め、二回残留PBSを除去するために静脈を通過する。 RTで5分間400×gで遠心分離する。
   7. EC培地完全な1ミリリットル中に吸引し上清とペレットを再懸濁し。 EC培地は、35 / mlの硫酸ゲンタマイシン、10ng / mlのヒト上皮増殖因子、1μg/ mlのヒドロコルチゾン、を2.5μg/ mlのアンフォテリシンB、および20％ウシ胎児血清を補充したM199から成る。
   8. 25cm ²のフラスコに、EC媒体とECサスペンションの4ミリリットルを追加します。次の日に培地をした後、2日ごとに変更します。
   9. ECは玉石様の形態（ 図1Ai）を示す。彼らは100％のコンフルエンスに達したときに接着アッセイのために、ECは、一般的に播種する（1.4節を参照してください。 ）。
2. 人間の臍帯からウォートンのゼリー間葉系幹細胞（WJMSC）の単離：
   1. 新鮮な臍帯からか、既にECを単離するために使用されてきたコードからホウォートンゼリー由来MSC（WJMSC）を単離する。長さ5cmの片に臍帯をカット。血管を明らかにするために、長手方向に各部分をカット（2動脈[白、リジッド]と1静脈を[黄色、膨張した]）。
   2. 無菌のハサミとピンセットを使用すると、血管を除去し、廃棄する。 3mmの³枚- 2へのすべての組織を切断する。 50ミリリットルの遠心分離管に3ミリメートル³枚-鉗子場所2を使用する。
   3. 100mg / mlのストック型コラゲナーゼIIを解凍し、希釈1：1mg / mlの最終濃度に10mlのPBSで100。 2万U / mlのストックヒアルロニダーゼを解凍し、1を希釈：400コラゲナーゼ溶液中で50 U / mlの最終濃度に。
   4. 組織断片を含む遠心管に酵素カクテルを加える。組織fragmenをインキュベート遅い回転装置上で37℃で5時間tsが。
   5. 細胞懸濁液を希釈1：5をPBSで。新しい50ミリリットル遠心管に100ミクロンの孔フィルターを置きます。 100μmのポアフィルター上に細胞懸濁液を注ぐ。
      注：残りの組織フラグメントは、フィルター上に保持され、細胞を50mlの遠心分離管に収集することができる。
   6. フィルタを破棄。 RTで10分間400×gで細胞懸濁液を遠心します。 12ミリリットルで上清を吸引し再懸濁WJMSCペレット完全なWJMSC培養培地（DMEM低グルコース、10％のFCSおよび100U / mlのペニシリン+100μg/ mlのストレプトマイシンミックス）。
   7. 75cm ²の組織培養フラスコ中のすべての細胞を播種する。 WJMSC培地完全な12ミリリットルと24時間後に培地を変更します。 3日間 - ごとに2培地を交換してください。 2週間以内に80％のコンフルエンス - 細胞が70に到達する必要があります。 WJMSC 70達するパッセージ- 80％のコンフルエンス（1.4節を参照）。
3. 骨髄由来MSC（BMMSC）の拡大：
   1. 以前に^24を説明したように、人間の骨髄由来MSC（BMMSC）を単離する。 15mlの遠心管に10ミリリットル予め温めMSC増殖培地（MSCGM）を加える。
   2. 2分間37℃の水浴中に置くことによってp2のBMMSCのバイアルを解凍する。 MSCGMを含む遠心管にBMMSCサスペンションを追加します。ピペッティングでよく混ぜる。
   3. RTで5分間400×gで遠心分離する。完全に上清を吸引。
   4. 1ミリリットルMSCGMに再懸濁細胞や血球計算器またはそのようなcellometerなどのデジタル細胞カウンターを用いて細胞数を計測する。
   5. 12ミリリットルMSCGMで1cm ²当たり6000細胞- 5000の密度で75cm ²の培養フラスコにシード細胞。 12ミリリットルMSCGMと24時間後に培地を変更します。 12ミリリットルMSCGMとフィードセルごとに2から3日間。
   6. BMMSC 70達するパッセージ- 80％のコンフルエンス（1.4節を参照）。細胞は、線維芽細胞の形態（ 図1Aii）を示す。
4. EC及びMSCの分離：
   1. 25cm ²の培養フラスコから培地を吸引。約2分間の0.02％EDTAの2ミリリットルを追加します。吸引物EDTA、2mlのトリプシン（2.5 mg / mlの）を追加します。顕微鏡下で見る細胞がラウンドになるまで。
   2. 細胞を剥離するために、フラスコをタップします。培養フラスコと転写懸濁液を15mlの遠心管に、（HUVEC用EC媒体、BMMSCためWJMSCおよびMSCGMためDMEM LGの細胞型に依存）8ミリリットルの培地を添加することによってトリプシンを不活性化する。
   3. RTで5分間400×gで遠心分離する。上清を吸引し、下記のようにペレットを再懸濁。
      1. MSC 3mlの培養培地中で再懸濁ペレットの継代のために。 3つの別々の75cm ²の培養フラスコに11ミリリットルの培地を加える。 （3分割1）各培養フラスコに1ミリリットルの細胞懸濁液を加える。通路WJMSCと共培養アッセイにおける使用の前にBMMSC 3回（p3が）。
      2. 接着アッセイでEC又はMSCをシードするため- セクション2と3を参照してください。
5. 凍結MSC：
   1. 通路3デタッチMSCでは第1.4節で説明したように。 3ミリリットルの氷冷CryoSFMで吸引し上清および再懸濁。 1.5ミリリットルの氷冷クライオバイアルに細胞懸濁液をピペット1は、1mlのアリコート。冷凍コンテナにクライオバイアルを置きます。
   2. -80°CO / Nで容器に保管してください。液体窒素に移す。 MSCの解凍バイアル（ 手順1.3.1従い- 1.3.6）を 。再懸 ​​濁5ミリリットルの培養液中のMSC（WJMSCまたはBMMSCための適切なメディアを選択）し、25cm ²のフラスコに播種する。

2. Ibidiマイクロスライド上の内皮間葉系幹細胞の共培養の確立

1. （; セクション1.4のように〜1.5×10 ⁶細胞）のECのコンフルエント25cm ²のフラスコをトリプシン処理。 380μlのMSCGMに再懸濁EC（1×25cm ²のフラスコを、全ての細胞TY接着アッセイのために、2つの6チャンネルIbidiのマイクロスライド（〜1.25×10 ⁵ /チャネル）シードますPESは）MSCGMで培養される。各チャンネルにEC懸濁液の30μlのを追加します（これは、毛細管現象による成長エリアをカバーします）。 1時間CO _2を 37℃でIbidiのマイクロスライドをインキュベートし、5％。
2. 各チャンネルに140μlのMSCGMを追加し、それをオフに吸引除去する。 3回の洗浄の合計のために二回繰り返します。 24時間CO _2を 37℃のインキュベーター中で140μlのMSCGMと場所を追加し、5％。
3. 共培養のためには、MSC（1.4節 ） を切り離す。血球計数器またはcellometerを用いて細胞数を実行します。 1.5×10 ⁵細胞/ mlにMSCの濃度を調整する。
4. Ibidiチャネル（媒体中のチャンネルの唯一の成長分野を離れる）から吸引する過剰メディア。 IbidiチャネルにMSC懸濁液の30μlのを追加します。チャンネルの成長分野から排出された培地を吸引し、MSCのサスペンションの別の30μlを添加する。 _<もう一度繰り返し、その後、37℃のインキュベーター中Ibidiのマイクロスライドを配置し、5％CO ₂1時間/サブ>。
5. 各チャンネルに140μlのMSCGMを追加し、それをオフに吸引除去する。 3回の洗浄の合計のために二回繰り返します。 24時間CO _2を 37℃のインキュベーター中で各チャンネルの場所に140μlのMSCGMの最終容量を追加し、5％。
6. 1×10 ⁵ U / mlストックTNFαを解凍し、1希薄：100 U / mlの最終濃度（等価へ〜10ng / mlの）にMSCGMで1000。 10 U / mlのを得るために、MSCGMで1:10 100 U / mlのTNFαを希釈することにより、連続希釈を行います。 1 U / mlのを取得するために、MSCGMで1:10によって10 U / mlのTNFαを希釈する。
7. アッセイの前に4時間、37℃でTNFαとのチャンネルを扱う。サイトカイン処理時の温度変動が観察された好中球動員のパターンを変える。未処理のチャンネルに新鮮なMSCGMを追加します。

3.内皮間葉系を確立することはフィルター上の細胞共培養を幹

1. 第1.4節で説明したようにWJまたはBMMSCを切り離します。ペレットを再懸濁1ミリリットルMSCGMで。血球計数器またはcellometerを使用して細胞数細胞を実行します。
2. 最終濃度がMSCGMの500μlの5×10 ⁵ MSCになるように音量を調整します。
3. 滅菌ピンセットを使用すると、無菌ボックスで6ウェル、0.4μmのPETトランスウェルフィルターと場所を反転。
4. フィルタの外 ​​表面上にシード5×10 ⁵ MSC。 1時間、CO _2、37℃で、5％のフィルターをインキュベートする。
5. フィルタの外表面からメディアを収集します。メディアにおける非接着MSCの数をカウントします。 3ミリリットルMSCGMを含む一致する6ウェルプレート中の滅菌鉗子と場所を使用して再反転フィルター。
6. フィルタ（ 図1B）の内面にMSCGMの2ミリリットルを追加します。 24時間CO _2を 37℃のインキュベーター中に置き、5％。 EC（; セクション1.4のように、図1Ai）のコンフルエント25cm ²のフラスコをトリプシン処理。
7. 8ミリリットルMSCGMでECを再懸濁し（1×25センチメートル²フラスコのWi4つの6ウェルフィルターをシードちゃう。 〜5×10 ⁵ EC /フィルタ）。多孔質フィルターの頂部及び底部から吸引する媒体。 （フィルターの下に）下部チャンバーに3ミリリットルの新鮮なMSCGMを追加します。各フィルタの内面に2ミリリットルEC懸濁液を加える。 37°Cで1時間、5％CO ₂でインキュベート。
8. 非接着ECを洗い流し、新鮮なMSCGMに交換する培地を吸引。最初の播種MSCずに内面に細胞を播種することにより、並列ECモノカルチャー·フィルタを設定します。 37℃でO / Nインキュベートし、5％CO _2。
9. EC単層がコンフルエントで、隙間が含まれていないことを確認してください。サブコンフルエントな単層を、接着アッセイ（ 図1B）のために使用することができない。
10. 前（ セクション2を参照）アッセイを4時間37℃で（〜10ng / mlのに相当）1、10、または100 U / mlのTNFαでのフィルターの上部および下部チャンバを扱う。

白血球の4.絶縁

1. 静脈を取る健康なボランティアと分量からすぐにEDTAチューブへの血液。反転チューブを静かに混合する。
2. 10ミリリットルの丸底チューブで1119ヒスト2.5ミリリットルに1077ヒスト2.5ミリリットルレイヤ。ヒスト勾配上に層5ミリリットルの全血。 RTで40分間800×gで遠心分離する。
3. （赤血球層の上）のHistopaque 1077と1119の界面での収穫周辺多形核好中球（PMN）。 10ミリリットルで行わ丸底チューブとPBSAで10mlに構成している。ゆっくりと室温で5分間400×gでチューブと遠心分離機を反転。
4. （; PBSA w / v）の0.15％の最終濃度まで（カルシウムおよび塩化マグネシウムを有する）を100 mlのPBS中7.5％BSA溶液を1:50に希釈する。 10ミリリットルPBSAで吸引し上清および再懸濁。 RTで5分間400×gで遠心分離する。
5. 1ミリリットルPBSAに懸濁します。細胞懸濁液の20μlのアリコートを取り、380μlのPBSA（1:20希釈）に追加する。血球計数器またはcellometerを用いて細胞数を計測する。必要なconceに希釈するPBSAでntration（1×10 ⁶ / mlのトランスウェルフィルターとIbidiのマイクロスライド用）。アッセイまでRTでの好中球サスペンションを維持します。

5.フローシステムを組み立てる

1. 図1Cに示すように、フローシステムをセットアップする。ヒーターの電源を入れ、37℃に設定。 3ウェイタップに20ミリリットルのシリンジ（プランジャーを削除します）し、5ミリリットル注射器を取り付けます。微細孔テープを使用してパースペックスチャンバにタップを取り付けます。
2. 約バルブ、3方向タップとの間の距離であるシリコン2/4ミリメートル（厚さ）チューブの長い部分を測定し、切断した。 1/3ミリメートル（薄い）チューブの10ミリメートル、長ピースと太いチューブの一端に挿入 - 8をカット。 3方向タップ上に厚いチューブ側を接続してください。
3. 電子3ウェイマイクロバルブのポート上に薄いチューブの端を接続します。これは、「洗浄槽」である。厚いと薄いチューブの8ミリメートル長い作品 - 6をカット。
4. 太いチューブの一端に細いチューブを挿入します。 ATT太いチューブが2ミリリットルの注射器の上に終わるACH（プランジャーを削除します）。
5. 「試料容器」を作るために、電子マイクロバルブのポート上に2ミリリットルの注射器の薄いチューブの端を接続します。マイクロバルブ及び顕微鏡ステージの中心間の距離である細い管の長い部分を測定して切断することにより、フィルタフローチャンバーにバルブを接続する。
6. 細いチューブの端に太いチューブの10ミリメートルピース - マイクロスライドモデルの場合、8を取り付ける。太いチューブの端にL字コネクタを配置します。これはマイクロスライドに接続します。細いチューブの端にチューブを接続するPortexブルーラインマノメータの10ミリメートルピース - フィルタモデルの場合は、8を取り付ける。
7. マイクロバルブの上に薄いチューブ先端を置きます。これは洗浄およびサンプル貯水池のための一般的な出力です。 PBSAと貯水池を埋める。気泡を除去するためにそれらを介してPBSAを流すことによって、プライムチューブ。
8. 29ミリメートル（50ml）中のガラスsに圧力計チューブを取り付けるyringe。首相10ミリリットルPBSAで充填することによって、注射器。チューブに接続された端部が上方に向くように、注射器を逆さにし、すべての気泡を押し出す。 5ミリリットルPBSAで補充します。
9. ガラスシリンジにつながる圧力計のチューブの端に太いチューブの12ミリメートルピース - のみマイクロスライドモデルの場合は、10を取り付ける。太いチューブの端にL字コネクタを配置します。点滴/撤退のためのシリンジポンプにガラスシリンジを置きます。
10. を0.1Pa（トランスウェルフィルター）0.05 Paの（Ibidiマイクロスライド）は以下の式を使用して、所望の壁せん断応力を生成するために必要なリフィル流量（Q）（τパスカルで_ワット 、ペンシルベニア）を計算する。
    （6.Q）/（WH ^2）= _ワット γ
    τ=n.γ
    W =内部幅と流路のH =内部の深さ。 nは、流れる溶液の粘度、 PBSAは、n = 0.7·sである平行平板フィルタ流チャンバーは、幅（w）は4mmであると深さ（h）は0.133ミリメートルである。 Dチャンバーのepthは、使用されるパラフィルムガスケットの厚さの違いにより若干異なる場合があります。 Ibidiのマイクロスライドのために、幅が3.8ミリメートルであり、深さは0.4mmである。
    注：ための流路の寸法の違い、そして我々はフィルタモデル⁶に比べてマイクロスライドモデルごとに異なるせん断応力を使用し、キャプチャダイナミクスへ。

6.平行平板フロー商工会議所の組み込みフィルタの設定

1. 金属テンプレートを使用してパラフィルム片（カバーガラスと同じ大きさ）に切断。金属テンプレートを使用して（流路を作成する）パラフィルムで20×4 mmのスロットを切り取り。カバーガラスの流路をマークするガスケットを使用してください。
2. ガラスカバースリップ上の6ウェルフィルターの端を揃えます。フィルタは流路マーキングをカバーすることを確認してください。慎重にタイプ10Aはメスを使用してフィルタを切り出す。
3. その流路を確保し、パラフィルムガスケットのフィルタを注意深くをカバースロットは、フィルタ（ 図1D）の真ん中にある。クリーンな組織片を使用し、すべての気泡を押し出す。
4. パースペックスのフローチャンバーの底板の凹部にカバースリップを置きます。ガスケットの上にトップパースペックスプレートを置き、一緒にプレートをネジ（ 図1D）。
5. 洗浄バッファー（PBSA）が弁を通って流れるように3方向タップをオンにします。トップPersexプレートの入口ポートに圧力計チューブを接続します。気泡が通過することを可能にする流路を介して実行PBSA。
6. パースペックスプレートの出口ポートにシリンジポンプからの圧力計チューブを接続します。リフィルを押し実行するようにシリンジポンプを設定します。チャンバーの上部プレートに滴下しているすべてのPBSAを清掃してください。
7. 反転位相差顕微鏡のステージ上のチャンバを配置します。フィルター上のEC（ 図1B）を可視化するためにフォーカスを調整します。

7. <フローのためのマイクロスライドの設定/ pの>

1. 反転位相差顕微鏡のステージ上にマイクロスライドを置きます。チャネルの入口ポートにL字型コネクタを接続します。流路をPBSAを実行します。
2. チャネルの出口ポートにシリンジポンプからL字コネクタを配置します。リフィルを押し実行するようにシリンジポンプを設定します。マイクロスライド上に滴下しているすべてのPBSAを清掃してください。 EC単層を可視化するためにピントを調整します。

白血球オーバー内皮細胞の8灌流

1. サンプルリザーバに精製された好中球の2ミリリットルを入れ、2分間温めておきます。 2分間PBSAで内皮を洗ってください。
2. 内皮上の好中球を灌流するバルブをONにします。 4分間の好中球のボーラスを配信。バルブをOFFにし、実験の残りのための洗浄槽からPBSAを灌流。
3. これはEC monolayが中断されるように、気泡がアッセイ中の任意の時点での流路を通過しないことを確認してくださいERおよび接着性好中球の原因剥離。

9.録音好中球のキャプチャと行動

1. どちら好中球の流れやポスト灌流中に記録好中球動員。
2. 流路の中央に10個のフィールド - 少なくとも5のすべてのデジタル録音を行います。入口ポートにおけるチャンネルの端に目標を移動すると、ポートの中央を識別することによって、チャネルの中心を特定する。
   1. 好中球の流れの間に記録する場合、1分ごとに10秒単一のフィールドの画像を撮影する。チャネルに沿って移動し、1分間別のフィールドを記録する。ボーラスの期間について繰り返します。
   2. （好中球ボーラスの終了後に、典型的には2分）、白血球の挙動を評価するための流路の中央下に10フィールド - ポスト灌流を記録するために、図5の10秒の記録を行う。イメージを10秒間隔内の毎秒してください。これは流れ、付着の挙動から捕獲のための十分な時間を可能にする中球分析すべきフィルス。
   3. 画像ごとに30秒を取って、5分間、少なくとも10転生好中球を含む単一のフィールドを記録します。これは、（内皮上または下のいずれか）移動した細胞の速度を計算するために使用することができる。
   4. 10秒のフィールド（通常は9分後に灌流）別の一連を記録します。これは、好中球時間は内皮単層を通過して移動することができます。
   5. シリンジポンプを停止し、チューブを外す。フローチャンバーを分解し、試料容器とチューブをすすぐ。その後のフィルター/マイクロスライドチャンネルに対して繰り返します。

白血球募集と行動の10の分析

1. 2分の時点で10秒間の録音中に、各フィールドにおける好中球の数を数える。すべての細胞を計数するために、第1番目のフィールドに存在しなければならない。視野の2辺（ 例えば、上/右境界）のフィールドに部分的に細胞が含まれている数限り、それらは完全な10秒間のフィールドに残るように。
2. フィールドあたりの付着性好中球の平均数を計算します。記録されたフィールドの長さと幅を測定します。フィールドの面積を計算します。 1ミリメートル²であるかを多くのフィールドを計算します。 1ミリメートル²のフィールドの数によって平均好中球数を掛けます。
3. 算出した好中球の量を乗じることによって灌流された好中球の総数は、ボーラス（ 例えば、4分の持続時間によって（ 例えば、2×10 ⁶ / mlの* Q [パラレルプレートフローチャンバーのための、例えば、0.0999ミリリットル/分]）を灌流）。
4. 付着した細胞の総数（接着細胞/ mmの灌流10分の^{2 6）を}決定するために灌流した好中球の総数で好中球数/ mm ^2で割る。
5. 接着性好中球がしっかりと接着性または（ 補足ビデオ1と2）転生、ローリングされているかどうかを評価する。
   1. A好中球ローリング相明るく、ゆっくり内皮単層に沿って移動します（1から10ミクロン/秒、 補足ビデオ1）。
   2. しっかりと接着細胞のいずれか（ すなわち、記録中に移動していない）、または形状変化を受けており、ECの表面（ 図1Ei）上に移行している静止残り、EC面に相明るいと結合している。
   3. 外遊中球は暗く、EC層（ 図1Eii）を下回る相である。
6. 静止して遊出し、展開している接着細胞の割合を計算します。代替的に、好中球の動作が（ - 10.7ステップ10.6に記載されているように）、総接着性を計算するために使用したのと同じ式を適用して異なる挙動を示し、総細胞数として表すことができる。
   1. マーク·ローリング好中球の先端。マーク10秒シーケンスの終わりに同じセルの先端。ラインベットを描く2点をWEENし、細胞が移動した距離を測定します。
   2. セルが圧延されている記録（ すなわち、10秒）の持続時間によって、この値を割る。試してみて、全体の10秒間隔のフィールドである好中球を選択します。
7. 表面（成形、変更された位相明るい）または内皮（位相ダーク）の下の上に移行する好中球の速度を計算する（ 補足ビデオ2）を記録し 、5分を使用しています。
   1. シーケンスの始めに移動した細胞の輪郭を描き、シーケンス全体で彼らの動きを追跡。セルごとに各1分間隔で重心のXとYの位置をメモします。第2の画像内の値からシーケンスの最初の画像から、XとYの位置の値を減算する。これは、ピタゴラスの定理に基づいています。
   2. 第三の画像から第二の画像から値を減算します。シーケンス内のすべての画像のためにこれを行う。スクエアトン彼は、XとYの値と一緒にそれらを追加。
   3. 平方根結果の値。各分間隔で計算速度を平均化することによって、各セルのための速度を計算します。トラック10は、好中球を移行し、平均速度を計算する。

結果

当初、我々はIbidiのマイクロスライドモデル（ - 9第7節 ） を使用して、フローからの好中球の募集にTNFαでECを刺激する効果を分析した。 TNFα、任意の好中球は、内皮単層に付着した小さな場合（ 図2A）の非存在下で。これは^、25,26を結合サポートするために必要な接着分子（セレクチン）またはケモカインを発現しないEC休止/未処理として、期?...

ディスカッション

ここでは、炎症を起こした内皮によって循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。我々は以前、TNFαで刺激されたEC ^9,29を通じて用量依存的に好中球の接着の増加と転生を観察している。また、両モデルは...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
25 cc tissue culture flask	SLS	353109
75 cc tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
6-well, 0.4 µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
10 ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4 °C.
20 ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5 ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2 ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50 ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.