Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Özet

akışından lökositleri için iltihaplı endotel kabiliyeti mezenkimal stromal hücreler tarafından düzenlenir. Biz akışından nötrofil işe değerlendirmek ve mezenkimal stromal hücreler bu süreci düzenleyen oynadığı rolü incelemek için kullanılabilir birincil insan hücreleri içeren iki in vitro model tarif.

Özet

Stromal hücreler, komşu endotel hücreleri ile çapraz konuşma ile inflamasyon sırasında, dolaşımdaki lökositlerin işe düzenler. Burada iltihaplı endotel hücreleri tarafından akışından nötrofillerin dolaşımdaki işe okuyan iki in vitro "vasküler" modelleri açıklar. Bu modellerin önemli bir avantajı, in vivo olarak meydana gelen gibi, sırayla lökosit yapışma kademeli olarak her adımda analiz yeteneğidir. Biz de hem modeller lökosit düzenleyen, bu durumda mezenkimal kök hücrelerin (MSC) stromal hücrelerin rolü, çalışma adapte edilebilir açıklanmıştır.

Primer endotelyal hücreleri, Ibidi lamlara veya 24 saat süre ile bir Transwell filtrenin ters tarafta doğrudan temas eden insan MSC ile tek başına veya birlikte kültürlenmiştir. Kültürler, 4 saat süre ile, tümör nekroz faktörü alfa (TNFa) ile uyarılır ve bir akım bazlı yapışma deneyinde dahil edilmiştir. Nötrofil bolus serpildi4 dakika için endotel üzerinde. nötrofil ve endotel ile etkileşimlerini akan yakalama faz-kontrast mikroskobu ile görüntülendi.

Her iki modelde de, sitokin uyarım, doza bağımlı bir şekilde akan nötrofil endotel işe artmıştır. Işe nötrofillerin davranış analizi haddeleme doza bağımlı azalma, endotelyum içinden geçişe doza bağımlı bir artış göstermiştir. Ko-kültür olarak, MSC TNFa-uyarılmış endotele nötrofil yapışma bastırdı.

Bizim akış tabanlı-yapışma modelleri dolaşımdan lökosit işe başlangıç ​​aşamalarını taklit. Lökosit ek olarak, bu tür terapötik olarak uygulandığı, MSC veya dolaşımdaki tümör hücreleri gibi diğer hücre türleri, işe incelemek için kullanılabilir. Çok katmanlı ko-kültür modelleri MSC pro-enflamatuar sitokinlerin tepkilerini değiştirmek için endotel ile iletişim göstermiştir, alterinötrofil işe ng. Bu tür modeller kullanılarak daha fazla araştırma tamamen farklı doku ve koşullar (inflamatuar bozukluklar veya kanser) için nasıl stromal hücreler anlamak enflamasyon sırasında lökositlerin etkilemek için gereklidir.

Giriş

Enflamasyon çözünürlüğü ^1,2 izin vermek için, iltihaplı doku sıkı lökosit girişi düzenleme ve çıkış gerektiren mikrobik enfeksiyon veya doku yaralanmasına karşı koruyucu bir cevaptır. Endotel hücreleri (EC), bu hat, kan damarları, dolaşımdaki lökositlerin doku yerleşik stromal hücreler arasındaki çapraz konuşma Bu işlemi ³ koordine için gereklidir. Ancak, lökositlerin kontrolsüz alımı ve etkisiz boşluk kronik inflamatuar hastalıkların ⁴ gelişimini destekleyen. Sağlıkta ve hastalıkta lökosit işe Mevcut anlayış eksik ve daha sağlam modeller bu süreci analiz etmek gereklidir.

sonrası kılcal venüllerin vasküler EC kanın lökosit işe destek mekanizmaları iyi ^1,2,5 tarif edilmiştir. Dolaşım halindeki lökositler, özel bir reseptör (örneğin, VCAM-1, E-selektin, P-selektin) tarafından çekildiğiiltihaplı endotel üzerinde yukarı-regüle edilir. Bu geçici etkileşimler lökosit yüzey bağlı kemokin ve lökositler ^{6- 11} tarafından ifade integrinler aktive lipit kaynaklı mediatörler (kökenli endotel veya stromal ya) ile etkileşim sağlar. Bu da endotel genelinde ve doku ^{12- 15} içine yapışma ve sürücüler göç dengeler. Doku içinde, lökositler kendi motilite, fonksiyon ve yaşam ^16,17 etkileyen stroma türevli ajanlara maruz işe. Büyüyen kanıtlar güçlü sinyaller gelecek için işe alım süreci şartları lökositlerin her aşamasında alınan düşündürmektedir. Ancak, lökosit işe anlayışımız eksik kalır ve çok az doku içindeki bileşenler şekillendirme lökosit hareketi hakkında bilinmektedir.

Birmingham biz lökositlerin işe incelemek için in vitro "vasküler" modelleri birkaç geliştirdik^9,18,19 akar. Biz şimdi lökosit işe vasküler AK hareket olarak acil regülatörleri kendi yerel mikroçevresinin değişikliklere yanıt anlıyoruz. Özellikle, doku yerleşik stromal hücreler aktif işe ³ rollerini etkilemek için komşu vasküler AT ile söyleşmek kısmen, inflamatuvar yanıtı düzenler. Daha önce çeşitli stromal hücreler, bir doku-spesifik bir şekilde yapışmasını ve lökositlerin geçişini desteklemek için AT yeteneğini modüle göstermiştir, ve bu etkiler, kronik hastalıkların ^13,16,20,21 değişmiş da yol açabilir. Böylece, stromal hücreler her inflamatuar yanıt ²² bağlamı tanımlamanızı doku 'adres kodları' kurmak. Daha yakın bir zamanda, kemik iliği türevli MSC (BMMSC) potansiyel olarak her iki nötrofillerin alımına bir azalmaya yol açan, sitokinlere EC tepkisini aşağı regüle ve ²³ lenfosit olduğunu göstermiştir.

mekanizmalar governing işe aydınlatmıştır in vitro ölçüde izole bir tek hücre tipi (örn, AK) veya protein içeren deneyleri kullandık. Ancak bu çalışmalar dikkate almayın lokal doku çevrenin etkileri (örneğin, stromal hücrelerin varlığı) lökositlerin ve doku içine onların sonraki göç. Burada, stromal hücreleri, spesifik olarak mezenkimal kök hücreler içinde iki akış tabanlı yöntemler (MSC) tarif EC ²³ ile birlikte kültürlenmiştir. Bu modeller bize akışından lökosit işe desteklemek için özellikle kendi yeteneği endotel tepkiler üzerine stromal hücre etkisini incelemek için izin verir.

Protokol

1. İzolasyon ve Kültür İlköğretim İnsan endotel hücrelerinin ve Mezenkimal Kök Hücre

1. İzolasyon ve Kültürü İnsan göbeğine yakın damar endotelial hücreleri (HUVEC):
   1. Kağıt havlu ile bir tepsi üzerinde göbek kordonunu koyun ve% 70 etanol ile sprey. Bir doku kültürü kaputu yerleştirin. Her iki ucunda ven ve cannulate belirleyin. Sabitlemek için kanüle sonuna etrafında bir kablo bağı yerleştirin.
   2. PBS bir şırınga kullanarak venöz kan yıkayın. Hava ile şırınga doldurun ve kaldırmak ve artık PBS atmak için ven geçer.
   3. Ve 10 mg / ml kollajenaz tip Ia çözülme 1 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar (bunlar kalsiyum ve magnezyum klorür) ile PBS içinde 1:10 seyreltin. Her iki kanüller dolana kadar damara kollajenaz çözümü geçirin. Her iki ucunda kanüller kelepçeler kapatın.
   4. Doku ile tepsiyi örtün ve% 70 etanol ile sprey. 37 ° C'de 20 dakika% 5 _CO2 için bir kuluçka makinesi içine kablosu yerleştirin.
   5. Dışarı kablosunu çekinve inkübatör kablo bağları sıkın. 1 dakika boyunca hafifçe kablosunu masaj. 10 ml PBS ile bir hücre süspansiyonu yıkayın ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde toplayın.
   6. Hava ile şırınga doldurun ve aşama 1.1.5 kullanılan bir 50 ml santrifüj tüpüne PBS toplama iki kez, herhangi bir kalıntı PBS kaldırmak için damar içinden geçmektedir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
   7. 1 ml tam AT orta aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet. EC ortam 35 ug / ml gentamisin sülfat, 10 ng / ml insan epidermal büyüme faktörü, 1 ug / ml hidrokortizon, 2.5 ug / ml amfoterisin B, ve% 20 cenin dana serumu ile takviye edilmiş M199 oluşur.
   8. 25 ^cm2 şişeye AT orta ve AT süspansiyonu 4 ml ilave edilir. Ertesi gün orta ve daha sonra her 2 günde değiştirin.
   9. AK Arnavut kaldırımı gibi morfoloji (Şekil 1Ai) sergiler. Yapışma deneyleri için, AK genelde% 100 izdiham ulaştığınızda (Bölüm 1.4 bakınız numaralı seribaşı ).
2. İnsan kordon Wharton jöle mezenkimal kök hücrelerin (WJMSC) İzolasyonu:
   1. Taze kordon ya da zaten EC izole etmek için kullanılmıştır kablolarından Wharton jöle-türetilmiş MSC (WJMSC) ayırın. 5 cm uzunluğunda parçalar halinde göbek kordonu kesti. Kan damarlarını ortaya çıkarmak için uzunlamasına her parça kesin (2 arterleri [beyaz, sert] ve 1 ven [sarı, şişmiş]).
   2. Steril makas ve forseps kan damarlarını çıkarın ve atın kullanma. 3 mm ³ adet - 2 içine tüm doku kesin. 50 ml'lik santrifüj tüpüne 3 mm ³ adet - forseps yerde 2 Kullanma.
   3. 100 mg / ml stok kolajenaz tip II çözülme ve 1 seyreltin: 1 mg / ml bir son konsantrasyona kadar, 10 ml PBS içinde 100. 20,000 U / ml stok hiyaluronidaz çözülme ve 1 seyreltin: 400 kolajenaz çözeltisi içinde 50 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyona seyreltildi.
   4. Doku parçaları içeren santrifüj tüpüne enzimatik kokteyl ekleyin. Doku fragmen inkübeYavaş bir döndürücü üzerinde, 37 ° C'de 5 saat için ts.
   5. Hücre süspansiyonu 1 seyreltin: 5 PBS. Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne 100 um gözenek filtresi yerleştirin. 100 um gözenek filtresi üzerine hücre süspansiyonu dökün.
      NOT: doku parçaları Kalan filtre üzerinde muhafaza edilecektir ve hücreler 50ml santrifüj tüpüne tahsil edilecektir.
   6. Filtreyi atın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. 12 ml tam WJMSC kültür ortamı (DMEM, düşük glukoz,% 10 FCS ve 100 U / ml penisilin + 100 ug / ml streptomisin karışımı) aspire süpernatan ve tekrar süspansiyon WJMSC pelet.
   7. 75 ^cm2'lik doku kültür şişesi tüm hücreleri Tohum. 12 mi tam WJMSC kültür ortamı ile, 24 saat sonra ortam değiştirin. 3 gün - her 2 orta değiştirin. 2 hafta içinde% 80 izdiham - Hücreler 70 ulaşmalıdır. Passage WJMSC 70 ulaştığınızda -% 80 izdiham (Bölüm 1.4 bakınız).
3. Kemik iliğinden türetilen MSC (BMMSC) genişlemesi:
   1. Daha önce tarif edildiği gibi ^24, insan kemik iliği kökenli MSC (BMMSC) izole edin. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine 10 ml önceden ısıtılmış MSC büyüme ortamı (MSCGM) ekleyin.
   2. 2 dakika için 37 ° C su banyosu içine yerleştirmek suretiyle p2 BMMSC bir şişe çözülme. MSCGM ihtiva eden bir santrifüj tüpüne BMMSC süspansiyonu ekleyin. Pipetleme tarafından iyice karıştırın.
   3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Aspire tamamen süpernatanlarına.
   4. 1 ml MSCGM yeniden süspanse hücreleri ve böyle bir cellometer gibi bir hemositometre veya dijital hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak.
   5. 12 mi MSCGM olarak ^cm2 başına 6000 hücrelerinin - 5.000 yoğunluğunda 75 ^cm2'lik kültür şişeleri içine tohum hücreleri. 12 ml MSCGM 24 saat sonra orta değiştirin. 12 mi MSCGM ile besleme hücreleri her 2-3 gün.
   6. Passage BMMSC 70 ulaştığınızda -% 80 izdiham (Bölüm 1.4 bakınız). Hücreler, bir fibroblastik morfolojisi (Şekil 1Aii) bulunmaktadır.
4. EC ve MSC Dekolmanı:
   1. 25 cm ² kültür şişelerinden orta aspire. Yaklaşık 2 dakika süre ile% 0.02 EDTA 2 ml ilave edilir. Aspire EDTA ve 2 ml tripsin ilave (2.5 mg / ml) eklenmiştir. Mikroskop altında Görünüm hücreleri yuvarlak hale gelene kadar.
   2. Hücreleri ayırmak için şişeyi dokunun. 8 ml kültür ortamı eklenerek tripsin inaktive, bir 15 ml santrifüj tüpüne kültür şişesine transfer süspansiyonuna (hücre tipine bağlı HUVEC, BMMSC için WJMSC ve MSCGM için DMEM LG EC ortamı).
   3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Aşağıda tarif edildiği gibi aspire süpernatan ve topak, yeniden süspanse edin.
      1. MSC, 3 ml kültür ortamında tekrar süspansiyon pellet geçirilmesi için. Üç ayrı 75 ^cm2'lik kültür şişeleri içine 11 ml kültür ortamı ekleyin. (: 3 bölünmüş 1), her bir kültür şişesine 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin. Geçiş WJMSC ve ko-kültürü deneylerinde kullanılmadan önce BMMSC 3 kez (p3).
      2. Yapışma tahlillerinde AK veya MSC tohumlama için - Bölüm 2 ve 3 bkz.
5. Donma MSC:
   1. Geçidi 3 ayırmak MSC de Bölüm 1.4 de tarif edildiği gibi. 3 ml buz gibi soğuk CryoSFM aspire süpernatan ve süspansiyon haline getirin. 1.5 ml buz gibi soğuk cryovials hücre süspansiyonu pipetle 1 ml'lik eş payları. Bir donma kapta cryovials koyun.
   2. -80 ° CO / N de kabı saklayın. Sıvı azot transfer. MSC çözülme flakon (takip 1.3.1 adımları - 1.3.6). 5 ml kültür ortamı içinde yeniden süspanse MSC 25 ^cm2 şişe içine ve tohum (uygun WJMSC veya BMMSC ortamını seçin).

2. Ibidi lamlara üzerinde endotel-mezenkimal kök hücre Co-kültürler oluşturulması

1. (; Bölüm 1.4 olarak ~ 1.5 x 10 ⁶ hücre) EC bir birleşik 25 cm ² şişesi Trypsinize. Süspanse EC 380 ul MSCGM içinde (1 x 25 cm ² şişe yapışma deneyleri tüm cep ty için iki adet 6-kanallı Ibidi lamlara (~ 1.25 x 10 ⁵ / kanal), tohum olacakPes) MSCGM kültürlenir. Her kanala AK süspansiyonu 30 ul ekleyin (bu kılcal eylem yoluyla büyüme alanı kapsayacak). 1 saat boyunca _CO2 37 ° C'de Ibidi mikroslayd inkübe ve% 5.
2. Her kanala 140 ul MSCGM ekleyin ve sonra aspire. 3 yıkamadan toplam iki kez tekrarlayın. 24 saat boyunca _CO2 37 ° C'de inkübatör içinde 140 ul MSCGM ve yer ekleyin ve% 5.
3. Ko-kültürler için MSC (Bölüm 1.4) ayırın. Bir hemositometre veya cellometer kullanarak bir hücre sayımı yapın. 1.5 x 10 ⁵ hücre / ml olacak şekilde MSC konsantrasyonunu ayarlayın.
4. (Orta kanalın sadece büyüme alanını terk) Ibidi kanallardan aspire aşırı ortam. Ibidi kanal MSC süspansiyon 30ul ekleyin. Kanalın büyüme alanı çıkartıldı, orta aspire ve MSC süspansiyon bir 30 ul ekle. Bir kez daha tekrar ve daha sonra 37 ° C ve% 5 _{CO2 Ibidi mikroslayd yer1 saat / sub>.}
5. Her kanala 140 ul MSCGM ekleyin ve sonra aspire. 3 yıkamadan toplam iki kez tekrarlayın. 24 saat boyunca _CO2 37 ° C'de inkübatör içinde her bir kanalın ve yerine 140 ul MSCGM bir son hacim ekleme ve% 5.
6. 1 x ^{10, 5} U / ml stok TNFa çözülme ve 1 seyreltin: 100 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyona (eşdeğer ± 10 ng / ml) MSCGM ise 1.000. 10 U / ml elde etmek üzere MSCGM olarak 1:10 ile 100 U / ml TNFa seyreltilmesi ile bir seri seyreltme yapın. 1 U / ml elde etmek üzere MSCGM olarak 1:10 ile 10 U / ml TNFa seyreltin.
7. Tahlilden önce 4 saat boyunca 37 ° C'de, TNFa ile kanal tedavi edin. Sitokin tedavisi sırasında sıcaklık dalgalanmaları gözlenen nötrofil işe kalıplarını değiştirecektir. Muamele edilmemiş kanallara taze MSCGM ekleyin.

3. Endotel-Mezenkimal Filtreler hücre Co-kültürler Kök kurulması

1. Bölüm 1.4 de tarif edildiği gibi WJ veya BMMSC çıkarın. Pelletini1 mi MSCGM de. Bir hemositometre veya cellometer kullanarak bir hücre sayımı hücreleri gerçekleştirin.
2. Son konsantrasyon MSCGM 500 ul 5 x 10 ⁵ MSC şekilde ses seviyesini ayarlayın.
3. Kullanımı steril forseps steril bir kutuda 6-kuyu, 0.4 mikron PET Transwell filtreleri ve yer ters.
4. Filtrelerin dış yüzeyi üzerine Tohum, 5 x 10 ⁵ MSC. 1 saat boyunca _CO2, 37 ° C'de filtre inkübe ve% 5.
5. Filtrenin dış yüzeyinden ortamı toplayın. Medyada yapışmaz MSC sayısını. 3 ml MSCGM içeren eşleşen 6 plaka steril forseps ve yer kullanarak yeniden invert filtreler.
6. Filtre (Şekil 1B) iç yüzeyi üzerine MSCGM 2 ml ilave edilir. 24 saat boyunca _CO2 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin ve% 5. (; Bölüm 1.4 Şekil 1Ai) AT bir birleşik 25 cm ² şişesi Trypsinize.
7. 8 ml MSCGM içinde AK süspanse (1 x 25cm ² şişe will tohumu dört 6-kuyu filtreleri; ~ 5 x 10 ⁵ EC / filtre). Gözenekli filtrelerin üst ve alt orta aspire. (Filtre altında) alt odasına 3 ml taze MSCGM ekleyin. Her filtrenin iç yüzeyine 2 mi AT süspansiyonu ekleyin. 37 ° C'de 1 saat ve% 5 _CO2 inkübe edin.
8. Aspire orta yapışmayan EC yıkayın ve taze MSCGM ile değiştirmek için. İlk tohumlama MSC olmadan iç yüzeyinde hücreleri tohumlama yoluyla paralel AK mono-kültür filtreleri ayarlayın. 37 ° C'de O / N inkübe ve% 5 _CO2.
9. AK tek tabakalı birleşen ve hiçbir boşluk içerdiğini kontrol edin. Alt-konfluen mono tabakalar yapışma tahlilleri (Şekil 1B) için kullanılamaz.
10. 1, 10 veya 100 U / ml TNFa filtrelerin üst ve alt bölmeleri tedavi (eşdeğer ± 10 ng / ml) ile 4 saat boyunca 37 ° C 'de (Bölüm 2'de anlatıldığı gibi) deneyin öncesine.

Lökositlerde 4. İzolasyonu

1. Venöz alSağlıklı gönüllüler ve alikosunadn hemen EDTA tüpleri içine kan. Haricindekileri tüpleri hafifçe karıştırın.
2. 10 ml 2.5 mi Histopaque 1119 üzerine 1077 Histopaque tabaka 2.5 ml'lik yuvarlak dipli tüp. Katman 5 ml Histopaque degrade üzerine tam kan. Oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
3. (Eritrosit katman üzerinde) Histopaque 1077 ve 1119 arayüzünde Hasat periferik polimorfonükleer nötrofil (PMN). Yuvarlak tüp dipli bir 10 ml yerleştirin ve albümin ile 10 ml makyaj. Yavaşça oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüpü ve ters.
4. (; PBSA ile yıkandı w / v)% 0.15 nihai konsantrasyona (kalsiyum ve magnezyum klorür) ile, 100 ml PBS içerisinde% 7.5 BSA çözeltisi 1:50 seyreltin. 10 ml albümin aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
5. 1 ml albümin süspanse. Hücre süspansiyonu 20 ul bir kısım almak ve 380 ul PBSA (1:20 seyreltme) ekleyin. Bir hemositometre veya cellometer kullanarak hücreleri saymak. Gerekli conce seyreltinntration albümin (Transwell filtre ve Ibidi mikroslayd 1 x 10 ⁶ / ml). Deneye kadar oda sıcaklığında nötrofil süspansiyon muhafaza edin.

5. Akış Sistemi Montaj

1. Şekil 1C gösterildiği gibi akış sistemi kurun. Isıtıcı açın ve 37 ° C'ye ayarlanır. 3-yollu bir musluğa bir 20 ml şırınga (piston kaldırmak) ve 5 ml şırınga takın. Micropore bandı kullanarak Perspex odasına musluğu takın.
2. Tedbir ve yaklaşık vana ve 3-yollu musluk arasındaki mesafedir silisyum 2/4 mm (kalın) boru uzun bir parça kesti. 03/01 mm (ince) boru, 10 mm uzunluğunda bir parça ve kalın hortumun bir ucuna yerleştirin - 8 kesin. 3-yollu musluğa üzerine kalın boru tarafı takın.
3. Elektronik 3-yollu Mikrovalf bir liman üzerine ince boru ucunu. Bu "yıkama rezervuar" dir. Kalın ve ince boru 8 mm uzunluğunda bir parça - 6 kesti.
4. Kalın hortumun bir ucunu ince boru yerleştirin. Avkalın boru 2 ml şırınga üzerine sona ach (pistonu çıkartın).
5. "Örnek rezervuar" yapmak için elektronik Mikrovalf bir liman üzerine 2 ml şırınga ince boru ucunu. Ölçülmesi ve Mikrovalf ve mikroskop kademesinin merkezi arasındaki mesafedir ince borunun uzun bir parça kesilerek filtre akış odacığına valfi bağlayın.
6. İnce boru ucuna kalın boru, 10 mm bir parçası - mikroslayd modelinde, 8 ekleyin. Kalın boru sonuna konektörü şeklinde bir L yerleştirin. Bu mikroslayd bağlanacaktır. İnce boru sonuna boru bağlantı Portex Blue Line Manometre 10 mm parça - filtre modeli için, bir 8 ekleyin.
7. Mikrovalf üzerine ince boru ucunu yerleştirin. Bu yıkama ve örnek rezervuarlar için ortak çıkış. Albümin ile rezervuarları doldurun. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için onları aracılığıyla PBSA akan Başbakan boru.
8. 29 mm'lik (50 ml) bir cam s manometre boru takınyringe. 10 ml albümin ile doldurarak Başbakan şırınga. Boru bağlı uç yukarı bakacak şekilde şırınga ters çevirin ve tüm hava kabarcıklarını dışarı itmek. 5 ml albümin ile doldurun.
9. Cam şırınga giden Manometre hortumunun ucuna kalın boru 12 mm'lik bir parçası - sadece mikroslayd modelinde, 10 ekleyin. Kalın boru ucuna konnektör şeklinde bir L yerleştirin. Enfüzyon / geri çekilmesi için, bir şırınga pompası içine cam şırınga yerleştirin.
10. 0.1 Pa (Transwell filtreler) ya da 0.05 Pa (Ibidi lamlara) aşağıdaki formüller kullanılarak istenen duvar kesme stresini üretmek için gerekli yeniden doldurma akış hızı (Q), (τ Pascal _w, PA) hesaplayın:
    γ _W = (6.Q) / (WH ²⁾
    τ = n.γ
    W = iç genişlik ve akış kanalı h = iç derinliğe sahiptir. n = akan çözelti viskozitesi; PBSA ile yıkandı, n = 0.7 mPa.s. Paralel plaka filtre akış bölmesi için, genişlik (w), 4 mm ve derinliği (h) 0.133 mm'dir. dOdanın epth nedeniyle kullanılan Parafilm conta kalınlığı farklılıklar biraz değişebilir. Ibidi mikroslayd için, genişlik 3.8 mm ve derinlik 0.4 mm 'dir.
    NOT: akış kanalı boyutları ve yakalama dinamikleri farklılıklar biz filtre modeli ⁶ kıyasla mikroslayd modeli için farklı kesme gerilmeleri kullanmak nedeniyle.

6. Filtreler birleştirilerek Paralel Plate Akış Odası Kurma

1. Metal şablonu kullanarak Parafilm bir parça (cam lamel aynı boyut) kesin. Bir metal şablonu kullanarak (akış kanalı oluşturmak için) Parafilm bir 20 x 4 mm yuvası kesin. Cam lamel akış kanalı işaretlemek için conta kullanın.
2. Cam lamel 6-kuyu filtre kenarlarını hizalayın. Filtre akış kanalı işaretler kapsar emin olun. Dikkatlice tipi 10A neşter kullanılarak filtre kesip.
3. Dikkatle sağlanması, bir Parafilm conta ile filtre kapsayan akış kanalıyuva filtresi (Şekil 1D) ortasında. Temiz bir doku parçası kullanın ve herhangi bir kabarcıkları dışarı itmek.
4. Perspex akış odasının alt plaka girinti içinde lamel yerleştirin. Conta üstünden üst Perspex plakasını yerleştirin ve birlikte plakaları (Şekil 1D) vida.
5. Yıkama tamponu (PBSA) vana akmasına izin vermek için 3-yollu musluğu çevirin. Üst Persex plakanın giriş portuna Manometre boru bağlayın. Baloncuklarının geçmesine izin vermek için akış kanalı yoluyla, albümin çalıştırın.
6. Perspex plaka çıkış portuna şırınga pompası Manometre hortumunu bağlayın. Dolum ve basın çalıştırmak için şırınga pompası ayarlayın. Odanın üst plaka üzerine damladı herhangi bir PBSA temizleyin.
7. Bir ters faz-kontrast mikroskop sahnede odasına yerleştirin. Üstü filtreler AK (Şekil 1B) görselleştirmek için odağı ayarlayın.

7. Akış

1. Bir ters faz kontrast mikroskop sahneye mikroslayd yerleştirin. Bir kanalın giriş portuna L şeklinde konnektörünü bağlayın. Akış kanalı ile, albümin çalıştırın.
2. Kanalın çıkış portuna şırınga pompası konnektörü şeklinde L yerleştirin. Dolum ve basın çalıştırmak için şırınga pompası ayarlayın. Mikroslayd üzerine damladı herhangi bir PBSA temizleyin. AK tek tabaka görselleştirmek için odağı ayarlayın.

Lökositler üzerinde Endotel Hücreleri 8. Perfüzyon

1. Örnek haznesine saflaştırılmış nötrofillerin 2 ml koyun ve 2 dakika boyunca ısınmaya bırakın. 2 dakika boyunca, albümin ile endotel yıkayın.
2. Endotele üzerinde nötrofillerin serpmek için AÇIK vanayı çevirin. 4 dakika nötrofil bolus sunun. Valf kapatın ve deney kalanı için yıkama haznesindeki PBSA serpmek.
3. Bu AK monolay bozacak gibi kabarcıklar tahlil sırasında herhangi bir noktada akış kanalından geçemiyor hava oluner ve yapışık nötrofil nedeni müfrezesi.

9. Kayıt Nötrofil Yakalama ve Davranış

1. Kayıt nötrofil işe ya nötrofil akışı veya post-perfüzyon sırasında.
2. Akış kanalının merkezinde 10 alanları - en az 5, tüm dijital kayıt edin. Giriş limanında kanalın kenarına hedefi hareketli ve limanın orta belirleyerek kanalın merkezini belirleyin.
   1. Nötrofil akışı sırasında kayıt için, 1 dakika boyunca tek bir alanda her 10 sn görüntüleri çekmek. Kanal boyunca hareket ettirin ve 1 dakika boyunca başka alan kaydedin. Bolus süresince tekrarlayın.
   2. (Nötrofil bolus bittikten sonra genellikle 2 dk) lökosit davranışını değerlendirmek için akış kanalının merkezinde aşağı 10 alanlar - post-perfüzyon kayıt için, 5 10 sn kayıt olun. Görüntüleri 10 sn aralığında her saniye sürer. Bu akışından yakalama ve yapışık Neutro davranışı için yeterli zaman tanırPhil'ler analiz edilmesi.
   3. Görüntüleri her 30 saniyede bir alan, 5 dakika boyunca en az 10 transmigrant nötrofilleri içeren tek bir alan kaydedin. Bu (yukarıdaki veya endotel altına ya da) geçirilmiş hücrelerin hızını hesaplamak için kullanılabilir.
   4. 10 sn alanları (genellikle 9 dakika sonrası perfüzyon) başka dizi kaydedin. Bu nötrofiller zaman endotel tek tabaka ile göç sağlar.
   5. Şırınga pompası durdurun ve tüp çıkarın. Akış odasına sökün ve örnek rezervuar ve tüp durulayın. Sonraki filtreler / mikroslayd kanallar için tekrarlayın.

Lökosit İşe Alım ve Davranış 10. Analizi

1. 2 dakika zaman noktasında 10 saniye kayıtları sırasında her alanda nötrofil sayısını. Tüm hücreler sayılır için birinci, ikinci alanda mevcut olmalıdır. Görüş alanı 2 taraftan (örneğin, üst / sağ sınır) ile alanında kısmen hücreler dahildirsayımları, sürece tam 10 saniye sahada kalır gibi.
2. Alan başına yapışık nötrofil ortalama sayısını hesaplayın. Kaydedilen alanın uzunluğunu ve genişliğini ölçün. Alan alanını hesaplayın. 1 mm ² kaç alanlar var hesaplayın. 1 mm ² alanların sayısına göre ortalama nötrofil sayımı çarpın.
3. Perfüze nötrofil miktarı çarpılarak perfüze nötrofillerin toplam sayısını hesaplayın (örneğin, 2 x 10 ⁶ / ml * Q [örneğin, paralel plaka akış odası için 0,0999 ml / dak]) bolus süresine göre (örneğin, 4 dakika ).
4. Yapışmış hücrelerinin toplam sayısını (hem yapışık hücre / mm perfüze ^{10/02 6)} belirlenmesi için perfüze nötrofillerin sayısı ile nötrofil sayısı / mm ² bölün.
5. Yapışık nötrofiller sıkıca yapışık veya (Ek Video 1 ve 2) transmigrant, haddeleme olup olmadığını değerlendirin.
   1. Birnötrofil haddeleme faz parlak ve yavaş yavaş endotel tek tabaka boyunca hareket edecek (1 - 10 mm / sn; Ek Video 1).
   2. Sıkıca yapışık hücreler ya (yani, kayıt sırasında hareket etmiyor) veya şekil değişikliği geçirmiş ve AK yüzeyi (Şekil 1Ei) üzerinden göç etmekte sabit kalan, AK yüzeye faz aydınlık ve bağlı bulunmaktadır.
   3. Bir transmigrant nötrofil karanlık ve AK tabakası (Şekil 1Eii) altında aşamasıdır.
6. Sabit ve transmigrant, haddeleme yapışık hücre yüzdesini hesaplayın. Seçenek olarak ise, nötrofil davranışı (- 10.7 adımda 10.6 tarif edildiği gibi) toplam yapışma hesaplamak için kullanılan aynı formül uygulanarak, farklı davranışlar sergileyen toplam hücre sayısı olarak ifade edilebilir.
   1. Mark haddeleme nötrofil öncü. 10 sn dizisinin sonunda aynı hücrenin ön kenarını işaretleyin. Bir çizgi çizin bahis2 puan ween ve hücre seyahat etti mesafeyi ölçün.
   2. Hücre haddeleme olduğu kayıt (yani, 10 sn) süresine göre bu değeri bölün. Deneyin ve tüm 10 sn aralığı için alanında bulunmaktadır nötrofiller seçin.
7. Yüzeyi (şekilli değiştirilen faz parlak) veya endotel (faz karanlıkta) altında üzerinde göç nötrofil hızını hesaplamak için (Ek video 2) kayıt 5 dk kullanın.
   1. Dizisinin başında göç hücrelerin bir taslağını çizin ve dizi boyunca hareketlerini izleyebilirsiniz. Her hücrenin her 1 dk aralığında sentroid X ve Y pozisyonları not edin. İkinci görüntüde değerlerden dizisinin ilk görüntüden X ve Y pozisyon değerlerini çıkarın. Bu Pisagor teoremi dayanmaktadır.
   2. Üçüncü görüntüde ikinci resimdeki değerleri çıkarın. Dizideki tüm görüntüler için bunu yapın. Kare tO X ve Y değerleri ve bunları birbirine ekleyin.
   3. Karekök elde edilen değer. Her dakika aralıklarla hesaplanan hızları ortalaması alınarak her bir hücre için hız hesaplayın. Parça 10 nötrofil göç ve ortalama hızı hesaplar.

Sonuçlar

Başlangıçta, biz Ibidi mikroslayd modeli (- 9 Bölüm 7) kullanılarak akışından nötrofillerin istihdamı TNFa ile AK uyarıcı etkisi analiz. TNFa, herhangi bir nötrofiller endotel tek tabaka yapıştırılır eğer biraz (Şekil 2A) yokluğunda. Bu ^25,26 bağlayıcı desteklemek için gerekli yapışma molekülleri (selektinler) veya kemokinleri ifade etmeyen AK dinlenme / işlenmemiş olarak, bekleniyordu. Bunun aksine, sitokin uyarım önemli bir doza bağlı bir ...

Tartışmalar

Burada iltihaplı endoteli tarafından nötrofillerin dolaşımdaki işe okuyan iki in vitro "vasküler" modelleri açıklar. Bu modellerin önemli bir avantajı, in vivo olarak meydana gelen gibi, sırayla lökosit yapışma kademeli olarak her adımda analiz yeteneğidir. Daha önce TNFa ile uyarılan EC ^9,29 ile doza bağlı, nötrofil adhezyonunun artış ve transmigrasyonun gözlemledik. Biz de hem modeller lökosit işe üzerindeki stromal hücrelerin etkilerini incelemek iç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
25 cc tissue culture flask	SLS	353109
75 cc tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
6-well, 0.4 µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
10 ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4 °C.
20 ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5 ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2 ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50 ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.