Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Zusammenfassung

Die Fähigkeit von entzündetem Endothel Leukozyten aus Strömungs Rekrutierung von mesenchymalen Stromazellen geregelt. Wir beschreiben zwei in vitro Modelle mit primären humanen Zellen, die verwendet werden können, um neutrophilen Rekrutierung von Flow zu bewerten und zu prüfen, welche Rolle die mesenchymalen Stromazellen bei der Regulierung dieses Prozesses spielen.

Zusammenfassung

Stromazellen wird über die Einstellung der zirkulierenden Leukozyten bei Entzündungen durch Übersprechen mit benachbarten Endothelzellen. Hier beschreiben wir zwei in vitro "vaskuläre" Modelle für die Untersuchung der Rekrutierung von zirkulierenden Neutrophilen von Flow von entzündeten Endothelzellen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Modelle ist die Fähigkeit, jeden Schritt in der Leukozytenadhäsion Kaskade zu analysieren, wie es in vivo auftreten. Wir beschreiben auch, wie die beiden Modelle angepasst werden, um die Rolle von Stromazellen, in diesem Fall von mesenchymalen Stammzellen (MSC) zu untersuchen, bei der Regulierung der Leukozytenrekrutierung werden.

Primäre Endothelzellen wurden allein oder zusammen mit menschlicher MSC in direktem Kontakt auf Ibidi Mikroglaschen oder auf gegenüberliegenden Seiten eines Transwell-Filter für 24 h kultiviert. Die Kulturen wurden mit den Tumornekrosefaktor alpha (TNF & agr;) für 4 Stunden stimuliert und in eine flussbasierte Adhäsionsassay eingebaut. Bolus von Neutrophilen perfundiertüber das Endothel für 4 min. Die Erfassung des fließenden Neutrophilen und ihre Wechselwirkungen mit dem Endothel wurde durch Phasenkontrastmikroskopie visualisiert.

In beiden Modellen erhöhte Zytokin-Stimulation endothelialer Rekrutierung von Neutrophilen fließt in einer Dosis-abhängige Weise. Analyse des Verhaltens der rekrutierten Neutrophile zeigten eine dosisabhängige Abnahme der Walzen und eine Dosis-abhängige Zunahme der Transmigration durch das Endothel. Bei Co-Kultur, unterdrückt MSC neutrophile Adhäsion an TNF-stimulierte Endothelzellen.

Unsere flussbasierten Haftmodelle imitieren die ersten Phasen der Rekrutierung von Leukozyten aus dem Kreislauf. Neben Leukozyten, können sie verwendet werden, um die Einstellung von anderen Zelltypen, wie beispielsweise therapeutisch verabreicht MSC oder zirkulierenden Tumorzellen zu untersuchen. Unsere mehrschichtigen Co-Kulturmodelle haben gezeigt, dass MSC kommunizieren Endothel ihre Reaktion auf proinflammatorische Cytokine modifizieren altering die Rekrutierung von Neutrophilen. Weitere Untersuchungen mit Hilfe solcher Modelle ist erforderlich, um zu verstehen, wie Stromazellen aus verschiedenen Geweben und Bedingungen (entzündliche Erkrankungen oder Krebs) Einfluss auf die Rekrutierung von Leukozyten während der Entzündung.

Einleitung

Die Entzündung ist eine schützende Immunantwort gegen mikrobielle Infektionen oder Gewebeverletzung, die strenge Regulierung von Leukozyten-Eingangs- und Ausgangs aus dem entzündeten Gewebe benötigt, um die Auflösung ^1,2 erlauben. Übersprechen zwischen Endothelzellen (EC), dass Leitungsblutgefäße, zirkulierenden Leukozyten und gewebe Wohnsitz Stromazellen ist für die Koordinierung dieses Prozesses ^3. , Unkontrollierte Rekrutierung von Leukozyten und deren unwirksam Freiheit zu untermauern jedoch die Entwicklung von chronischen Entzündungskrankheiten ^4. Unser gegenwärtiges Verständnis der Rekrutierung von Leukozyten in Gesundheit und Krankheit ist unvollständig und robustere Modelle sind erforderlich, um diesen Prozess zu untersuchen.

Die Mechanismen, die die Unterstützung der Rekrutierung von Leukozyten aus Blut durch Gefäß EG in post Venolen sind gut beschrieben ^1,2,5 worden. Zirkulierende Leukozyten werden von spezialisierten Rezeptoren (zB VCAM-1, E-Selektin, P-Selektin) erfasst dieauf entzündete Endothel hochreguliert. Diese transienten Interaktionen ermöglichen Leukozyten mit Oberfläche gebunden Chemokinen und Lipid abgeleiteten Mediatoren (entweder endothelialen oder Stroma Ursprungs), die Integrine durch Leukozyten ^{6- 11} ausgedrückt aktivieren interagieren. Dies wiederum stabilisiert die Haftung und Antriebe Migration über das Endothelium in das Gewebe ^{12 bis 15.} Im Gewebe rekrutiert Leukozyten zu Stroma stammenden Mittel, die ihre Beweglichkeit, Funktion und das Überleben ^16,17 beeinflussen unterzogen. Immer deutlicher, deutet stark darauf hin, dass die Signale in jeder Phase der Rekrutierung von Leukozyten Bedingungen für die nächste erhalten. Jedoch bleibt das Verständnis der Leukozytenrekrutierung unvollständig und sehr wenig über die Komponenten Formgebungs Leukozytenbewegung im Gewebe bekannt.

In Birmingham haben wir mehrere in vitro "vaskuläre" Modelle entwickelt, um die Rekrutierung von Leukozyten aus studierenfließen ^9,18,19. Wir verstehen jetzt, dass Gefäß EG fungieren als unmittelbare Regulatoren der Rekrutierung von Leukozyten reagieren auf Veränderungen in ihrer lokalen Mikroumgebung. Insbesondere können gewebe Wohnsitz Stromazellen aktiv reguliert die Entzündungsreaktion, teilweise im Gespräch mit benachbarten Gefäß EG, ihre Rolle bei der Einstellung ³ beeinflussen. Wir haben zuvor gezeigt, dass verschiedene Stromazellen modulieren die Fähigkeit von EG-Adhäsion und Migration von Leukozyten in einer gewebespezifischen Art und Weise zu unterstützen, und dass diese Effekte sich veränderten chronischer Erkrankungen ^13,16,20,21. So Stromazellen etablieren Gewebe "Adresse-Codes", die den Kontext der einzelnen Entzündungsreaktion ²² zu definieren. In letzter Zeit haben wir gezeigt, dass aus dem Knochenmark MSC (BMMSC) potent herunterregulieren die Reaktion der EG auf Zytokine, was zu einer Verringerung in der Rekrutierung von Neutrophilen und Lymphozyten beiden ^23.

Die Mechanismen govErning Rekrutierung aufgeklärt in vitro-Assays wurden weitgehend verwendet, das eine Zelltyp (zB EG) oder Protein isoliert. Allerdings sind diese Studien nicht berücksichtigt die Auswirkungen der lokalen Gewebeumgebung (dh die Anwesenheit von Stromazellen) auf Rekrutierung von Leukozyten und deren anschließende Migration in das Gewebe. Hier beschreiben wir zwei flussbasierte Verfahren, bei denen Stromazellen, insbesondere mesenchymale Stammzellen (MSC), co-kultiviert, das mit EC ^23. Solche Modelle ermöglichen es uns, die Wirkung von Stromazellen auf endothelialen Reaktionen, insbesondere ihre Fähigkeit zur Rekrutierung von Leukozyten aus Fluss unterstützen zu untersuchen.

Protokoll

1. Isolierung und Kultivierung von primären humanen Endothelzellen und mesenchymalen Stammzellen

1. Isolierung und Kultur von humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC):
   1. Setzen Nabelschnur auf einem Tablett mit Papiertüchern und Spray mit 70% Ethanol. Platzieren Sie in einer Gewebekultur Kapuze. Identifizieren Sie die Vene und kanülieren an beiden Enden. Legen Sie einen Kabelbinder um die Kanüle eingeführt Ende zu sichern.
   2. Waschen Sie die venöse Blut mit PBS mit einer Spritze. Füllen Sie Spritze mit Luft und durch die Vene zu entfernen und entsorgen Sie die restliche PBS.
   3. Tau-10 mg / ml Collagenase Typ Ia und verdünnt 1:10 in PBS (mit Calcium und Magnesiumchlorid), um eine Endkonzentration von 1 mg / ml. Pass Kollagenaselösung in die Vene, bis beide Kanülen gefüllt sind. Schließen Sie die Klemmen an Kanülen an beiden Enden.
   4. Decken Sie die Schale mit Gewebe und Spray mit 70% Ethanol. Stecken Sie das Kabel in einen Inkubator für 20 min bei 37 ° C und 5% CO _2.
   5. Nehmen Sie das Netzkabel ausdes Inkubators und Kabelbinder festziehen. Massieren Sie das Kabel vorsichtig für 1 min. Spülen Sie die Zellsuspension mit 10 ml PBS und sammeln Sie in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen.
   6. Füllen Sie Spritze mit Luft und durch die Vene, um restliche PBS zweimal zu entfernen, das Sammeln der PBS in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen in Schritt 1.1.5 verwendet. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei RT.
   7. Überstand entfernen und Pellet in 1 ml komplettes Medium EG. EC Medium aus M199 mit 35 ug / ml Gentamicinsulfat, 10 ng / ml humaner epidermaler Wachstumsfaktor, 1 & mgr; g / ml Hydrocortison 2,5 ug / ml Amphotericin B und 20% fötalem Kälberserum ergänzt.
   8. 4 ml der EC Medium und dem EC-Suspension in einen 25 cm ^{2 -Kolben.} Ändern Sie das Medium am nächsten Tag und dann alle 2 Tage.
   9. EG weisen eine pflastersteinartigen Morphologie (Abbildung 1Ai). Für Adhäsionsassays werden EG Allgemeinen ausgesät, wenn sie 100% Konfluenz zu erreichen (siehe Abschnitt 1.4 ).
2. Isolierung von Wharton Gelee mesenchymale Stammzellen (WJMSC) aus menschlichen Nabelschnüren:
   1. Isolieren Wharton Gelee abgeleitete MSC (WJMSC) aus frischen Nabelschnüren oder Schnüre, die bereits verwendet wurden, um EC isolieren. Schneiden der Nabelschnur in 5 cm lange Stücke. Schneiden Sie die einzelnen Stück in Längsrichtung, um die Blutgefäße zu offenbaren (2 Arterien [weiß, starre] und 1 Vene [gelb, aufgetrieben]).
   2. Mit Hilfe einer sterilen Schere und Pinzette entfernen Sie die Blutgefäße und entsorgen. Schneiden Sie alle Gewebe in 2 - 3 mm ³ Stück. Mit einer Pinzette Platz 2-3 mm ³ Stück in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen.
   3. Auftauen 100 mg / ml Stamm Kollagenase Typ II und verdünnt 1: 100 in 10 ml PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml. Auftauen 20.000 U / ml Hyaluronidase Lager und verdünnt 1: 400 bis zu einer Endkonzentration von 50 U / ml in der Collagenaselösung.
   4. Hinzufügen enzymatische Cocktail in das Zentrifugenröhrchen, die Gewebefragmente enthält. Die Gewebe Fragmentierung inkubierents für 5 Stunden bei 37 ° C auf einem langsamen Rotator.
   5. Verdünne die Zellsuspension 1: 5 in PBS. Legen Sie eine 100 um Porenfilter in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen. Gießen Sie die Zellsuspension auf die 100 um Porenfilter.
      HINWEIS: Restgewebefragmente werden auf dem Filter zurückgehalten werden, und die Zellen werden in der 50 ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt.
   6. Entsorgen Sie den Filter. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 · g für 10 min bei RT. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren WJMSC Pellet in 12 ml komplettes WJMSC Kulturmedium (DMEM niedrige Glucose, 10% FCS und 100 U / ml Penicillin + 100 ug / ml Streptomycin mix).
   7. Seed alle Zellen in einer 75 cm ² Zellkulturflasche. Ändern Sie das Medium nach 24 Stunden mit 12 ml Komplett WJMSC Kulturmedium. Ersetzen Medium alle 2 - 3 Tage. 80% Zusammenfluss innerhalb von 2 Wochen - Zellen sollten 70 zu erreichen. Passage, wenn WJMSC erreichen 70-80% Konfluenz (siehe Abschnitt 1.4).
3. Expansion von Knochenmark abgeleiteten MSC (BMMSC):
   1. Isolieren menschlicher Knochenmark stammenden MSC (BMMSC), wie zuvor beschrieben ^24. 10 ml vorgewärmtes MSC Wachstumsmedium (MSCGM) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
   2. Auftauen eine Phiole p2 BMMSC, indem in einem 37 ° C Wasserbad für 2 min. Hinzufügen des BMMSC Suspension in das Zentrifugenröhrchen, enthaltend MSCGM. Gut mischen durch Pipettieren.
   3. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei RT. Überstand entfernen vollständig.
   4. Zellen in 1 ml MSCGM und zähle die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers oder ein digitales Zellenzähler, wie einem Cellometer.
   5. Samenzellen in 75 cm ² Kulturkolben in einer Dichte von 5000 - 6000 Zellen pro cm ² in 12 ml MSCGM. Ändern Sie das Medium nach 24 Stunden mit 12 ml MSCGM. Feed-Zellen mit 12 ml MSCGM alle 2 - 3 Tage.
   6. Passage, wenn BMMSC erreichen 70-80% Konfluenz (siehe Abschnitt 1.4). Zellen eine Fibroblasten-Morphologie (Abbildung 1Aii).
4. Ablösung der EG und MSC:
   1. Absaugen Medium von 25 cm ² Kulturflaschen. 2 ml 0,02% EDTA für ca. 2 min. Saugen Sie EDTA und 2 ml Trypsin (2,5 mg / ml). Blick unter die Lupe genommen, bis die Zellen rund.
   2. Tippen Sie auf die Flasche, um die Zellen zu lösen. Inaktivierung des Trypsins durch Zugabe von 8 ml Kulturmedium (abhängig vom Zelltyp; EC Medium für HUVEC, DMEM LG für WJMSC und MSCGM für BMMSC) an den Kulturkolben und Transfersuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
   3. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei RT. Überstand wird abgesaugt und das Pellet, wie unten beschrieben.
      1. Für das Passagieren von MSC, Pellet in 3 ml Kulturmedium. Fügen Sie 11 ml Kulturmedium in drei separate 75 cm ² Kulturflaschen. 1 ml Zellsuspension in jede Kulturflasche (1: 3-Split). Passage WJMSC und BMMSC 3mal (P3) vor dem Einsatz in Co-Kultur-Assays.
      2. Für Aussaat EG oder MSC in Adhäsionsassays - siehe Abschnitt 2 und 3.
5. Freezing MSC:
   1. Bei Durchgang 3 detach MSC, wie in Abschnitt 1.4 beschrieben. Überstand entfernen und resuspendieren in 3 ml eiskaltem CryoSFM. Pipette 1 ml Aliquots der Zellsuspension in 1,5 ml eiskaltem Kryoröhrchen. Setzen Kryoröhrchen in einem Gefrierbehälters.
   2. Lagern Sie die Behälter bei -80 ° CO / N. Transfer zum flüssigen Stickstoff. Thaw Fläschchen MSC (Folge Schritte 1.3.1 - 1.3.6). Resuspendieren MSC in 5 ml Kulturmedium (wählen geeignete Medium für WJMSC oder BMMSC) und Saatgut in einen 25 cm ^2-Kolben.

2. Festlegung Endothelial-mesenchymale Stammzellen Co-Kulturen auf Ibidi Mikroobjekt

1. Trypsinieren eine konfluente 25 cm ^2-Kolben der EG (~ 1,5 x 10 ⁶ Zellen, wie in Abschnitt 1.4). Resuspendieren EG in 380 ul MSCGM (1 x 25 cm ² Kolben werden zwei 6-Kanal-Mikroobjekt Ibidi (~ 1,25 x 10 ⁵ / Kanal), für Adhäsionsassays alle Zell ty Saatgutpes kultiviert in MSCGM). In 30 ul EG Suspension auf jeden Kanal (dies wird die Wachstumsbereich durch Kapillarwirkung zu decken). Inkubieren Ibidi Mikrodia bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 1 Stunde.
2. Fügen Sie 140 ul MSCGM jedem Kanal und dann saugen sie ab. Wiederholen zweimal für insgesamt 3 Waschungen. Hinzufügen 140 ul MSCGM und in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 24 Stunden.
3. Für Co-Kulturen lösen MSC (Abschnitt 1.4). Führen Sie eine Zellzahl mit einem Hämozytometer oder ein Cellometer. Die Konzentration ist anzupassen MSC bis 1,5 x 10 ⁵ Zellen / ml.
4. Aspirat überschüssige Medium aus den Ibidi Kanäle (wobei nur die Wachstumsfläche des Kanals in Medium). In 30 ul MSC Suspension auf die Ibidi Kanäle. Saugen Sie das Medium, das aus dem Wachstumsbereich des Kanals ausgestoßen wurde, und fügen Sie weitere 30 ul MSC Federung. Wiederholen Sie noch einmal und dann die Ibidi Mikroobjekt im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO _{2 <}/ Sub> 1 Stunde.
5. Fügen Sie 140 ul MSCGM jedem Kanal und dann saugen sie ab. Wiederholen zweimal für insgesamt 3 Waschungen. Hinzufügen eines Endvolumens von 140 ul MSCGM jedem Kanal und in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 24 Stunden.
6. Auftauen 1 x 10 ⁵ U / ml stock TNFa und verdünnt 1: 1.000 in MSCGM bis zu einer Endkonzentration von 100 U / ml (äquivalent zu ~ 10 ng / ml). Durchführen einer seriellen Verdünnung durch Verdünnen von 100 U / ml TNF durch 1:10 in MSCGM bis 10 U / ml zu erhalten. Verdünnen Sie 10 U / ml TNF von 1:10 in MSCGM bis 1 U / ml zu erhalten.
7. Saures Kanäle mit TNFa bei 37 ° C für 4 h vor dem Test. Temperaturschwankungen während der Zytokin-Behandlung wird die Muster der Rekrutierung von Neutrophilen beobachtet ändern. Frisches MSCGM zu unbehandelten Kanäle.

3. Aufbau Endothelial-mesenchymale Stammzellen Co-Kulturen auf Filter

1. Nehmen WJ oder BMMSC wie in Abschnitt 1.4 beschrieben. Das Pelletin 1 ml MSCGM. Führen Sie eine Zellzahl Zellen unter Verwendung einer Zählkammer oder eines Cellometer.
2. Stellen Sie die Lautstärke, so dass die Endkonzentration ⁵ × 10 5 MSC in 500 ul MSCGM.
3. Mit einer sterilen Pinzette invertieren 6 Vertiefungen, 0,4 & mgr; m PET-Transwell-Filter und in eine sterile Box.
4. Seed 5 x 10 ⁵ MSC auf die Außenfläche der Filter. Filter bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 1 Stunde.
5. Sammeln Medien von der Außenfläche des Filters. Die Anzahl der nicht-haftenden MSC in den Medien. Re-Invert-Filter mit einer sterilen Pinzette und in einen passenden 6-Well-Platte mit 3 ml MSCGM.
6. 2 ml MSCGM auf die innere Oberfläche des Filters (Figur 1B). Platzieren in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 24 Stunden. Trypsinieren eine konfluente 25 cm ^2-Kolben der EG (Abbildung 1Ai, wie in Abschnitt 1.4).
7. Resuspendieren EG in 8 ml MSCGM (1 x 25 cm ^2-Kolben will Samen vier 6-Well-Filter; ~ ⁵ × 10 5 EG / Filter). Aspirat Medium von oben und unten an den porösen Filter. 3 ml frisches MSCGM in die untere Kammer (unter dem Filter). 2 ml EC Suspension auf die innere Oberfläche eines jeden Filters. Inkubieren für 1 h bei 37 ° C und 5% CO _2.
8. Absaugen Medium zu waschen nicht haft EG und ersetzen Sie sie durch frische MSCGM. Einrichten parallel EC Monokultur Filter durch Impfen Zellen an der Innenfläche ohne zuerst seeding MSC. Inkubieren O / N bei 37 ° C und 5% CO _2.
9. Prüfen, ob die EG-Monolayer konfluent und enthält keine Lücken. Subkonfluente Monoschichten können nicht für Adhäsionsassays (1B) verwendet werden.
10. Behandlung der oberen und unteren Kammern der Filter mit 1, 10 oder 100 U / ml TNF (entsprechend ~ 10 ng / ml) bei 37 ° C für 4 h vor dem Assay (in Abschnitt 2).

4. Isolierung von Leukozyten

1. Nehmen VenenBlut von gesunden Probanden und aliquoten sofort in EDTA-Röhrchen. Invert Röhrchen vorsichtig mischen.
2. Schicht 2,5 ml Histopaque 1077 auf 2,5 ml Histopaque 1119 in einem 10 ml-Rundrohr. Schicht 5 ml Vollblut auf die Histopaque Gradienten. Zentrifuge bei 800 × g für 40 min bei RT.
3. Ernte peripheren polymorphkernigen Neutrophilen (PMN) an der Schnittstelle von Histopaque 1077 und 1119 (über die Erythrozytenschicht). In einem 10 ml-Rundrohr lösen und bis zu 10 ml mit PBSA. Vorsichtig umdrehen Rohr und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei RT.
4. Verdünnter 7,5% BSA-Lösung 1:50 in 100 ml PBS (mit Calcium und Magnesiumchlorid), um eine Endkonzentration von 0,15% (w / v; PBSA). Überstand entfernen und Resuspension in 10 ml PBSA. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei RT.
5. Ein Resuspendieren in 1 ml PBSA. Nehmen Sie ein 20 ul-Aliquot der Zellsuspension und fügen Sie 380 ul PBSA (1:20 Verdünnung). Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer oder ein Cellometer. Verdünnen Sie auf die gewünschte concentration (1 x 10 ⁶ / ml Transwell-Filtern und Ibidi Mikrodia) in PBSA. Pflegen Neutrophilensuspension bei RT bis zum Test.

5. Montage der Flow System

1. Einrichten des Strömungssystems, wie in 1C gezeigt. Schalten Sie die Heizung und auf 37 ° C eingestellt. Schließen Sie einen 20-ml-Spritze (Entfernen Sie den Kolben) und eine 5-ml-Spritze mit einem 3-Wege-Hahn. Bringen Sie den Hahn in die Plexiglaskammer mit Mikroporenband.
2. Zuschneiden und ein langes Stück Silizium 2/4 mm (dick) Schläuche, die in etwa der Abstand zwischen dem Ventil und dem 3-Wege-Hahn. Cut eine 8 - 10 mm langes Stück 1/3 mm (dünn) Schlauch legen und in das eine Ende des dicken Schlauch. Befestigen Sie die dicke Schläuche Seite auf die 3-Wege-Hahn.
3. Schließen Sie das dünne Schlauchende auf einen Anschluss des elektronischen 3-Wege-Mikroventil. Dies ist die "Reinigungswanne". Schneiden Sie ein 6 - 8 mm langes Stück dicken und dünnen Schlauch.
4. Legen Sie die dünnen Schlauch in ein Ende des dicken Schlauch. Attach das dicke Schlauchende auf eine 2 ml Spritze (Entfernen Sie den Kolben).
5. Schließen Sie das dünne Ende des Schlauchs 2 ml Spritze auf einen Port auf dem elektronischen Mikroventil, um den "Probenbehälter" zu machen. Das Ventil an der Filterströmungskammer durch Messen und Schneiden eines langen Stück eines dünnen Schlauch, der der Abstand zwischen dem Mikroventil und dem Zentrum der dem Mikroskoptisch ist.
6. Für die Mikroobjektmodell, schließen Sie einen 8 - 10 mm Stück dicken Schlauch am Ende des dünnen Schlauch. Ein L-förmige Anschluss mit dem Ende des dicken Schläuche. Dieser wird dem Mikroobjekt verbinden. Für die Filtermodell, schließen Sie einen 8-10 mm Stück Portex Blue Line Manometer Anschluss von Rohren bis zum Ende der dünnen Schlauch.
7. Legen Sie die dünne Schlauchende auf das Mikroventil. Dies ist die gemeinsame Ausgabe für die Wasch- und Probenbehältern. Füllen Behälter mit PBSA. Prime Schlauch durch fließendes PBSA durch sie, um Luftblasen zu entfernen.
8. Befestigen Manometer Schlauch mit einer 29 mm (50 ml) Glas syringe. Prime die Spritze durch Auffüllen mit 10 ml PBSA. Drehen Sie die Spritze so, dass das Ende mit dem Rohr verbunden ist nach oben zeigt und schieben Sie alle Luftblasen. Refill mit 5 ml PBSA.
9. Denn nur die Mikroobjektmodell, fügen Sie eine 10-12 mm dicken Stück Schlauch an das Ende der Manometer Gasweg des Glasspritze. Ein L-förmigen Stecker auf das Ende des dicken Schlauch. Setzen Sie den Glasspritze in eine Spritzenpumpe Infusions / Entzug.
10. Berechnen Sie die Refill-Durchflussmenge (Q) erforderlich, um die gewünschte Wandschubspannung erzeugen (τ _w in Pascal, Pa) von 0,1 Pa (Transwell-Filter) oder 0,05 Pa (Ibidi Mikroobjekt) mit den folgenden Formeln:
    γ _w = (6.Q) / (wh ²⁾
    τ = n.γ
    Wo w = Innenbreite und h = innere Tiefe des Strömungskanals. n = Viskosität der strömenden Lösung; PBSA ist n = 0,7 mPa.s. Für den Parallelplattenfilter Strömungskammer ist die Breite (w) 4 mm und der Tiefe (h) ist 0,133 mm. Der depth der Kammer kann leicht aufgrund der Unterschiede in der Dicke der verwendeten Para Dichtung variieren. Für die Ibidi Mikrodia ist die Breite 3,8 mm und die Tiefe beträgt 0,4 mm.
    Hinweis: Wegen der Unterschiede in den Abmessungen des Strömungskanals und das Einfangen Dynamik verwenden wir verschiedene Schubspannungen für die Mikroobjektmodell im Vergleich zum Filtermodell ^6.

6. Einrichten der Parallelplattenflusskammer Einbeziehung Filter

1. Ein Stück Parafilm (der gleiche Größe wie das Deckglas) unter Verwendung einer Metallschablone. Ausschneiden eines 20 x 4 mm Schlitz in der Parafilm (um den Strömungskanal zu erzeugen) unter Verwendung einer Metallschablone. Verwenden der Dichtung an der Strömungskanal auf der Deckglas markieren.
2. Ausrichten der Kanten der 6-well-Filter auf dem Deckglas. Stellen Sie sicher, dass der Filter umfasst die Strömungskanal Markierungen. Den Filter sorgfältig mit einer Art 10A Skalpell ausgeschnitten.
3. Sorgfältig abdecken den Filter mit einem Parafilm Dichtung, so dass der StrömungskanalSchlitz in der Mitte des Filters (Figur 1D). Verwenden Sie ein Stück sauberen Tuch ab und schieben Sie keine Blasen.
4. Legen Sie das Deckglas in der Aussparung der Bodenplatte des Plexiglas Flusskammer. Positionieren Sie den oberen Plexiglasplatte über der Oberseite der Dichtung und schrauben Sie die Platten zusammen (1D).
5. Drehen Sie die 3-Wege-Hahn, damit Waschpuffer (PBSA) durch das Ventil fließen. Verbinden Manometer Schlauch an die Einlassöffnung der oberen Persex Platte. Führen PBSA durch den Strömungskanal, damit Luftblasen passieren.
6. Schließen Sie das Manometer Schlauch von der Spritzenpumpe in die Austrittsöffnung der Plexiglasplatte. Stellen Sie die Spritzenpumpe zum Nachfüllen und drücken Lauf. Säubern Sie PBSA, die auf der oberen Platte der Kammer getropft ist.
7. Legen Sie die Kammer auf der Stufe einer Invert-Phasenkontrastmikroskop. Stellen Sie den Fokus auf die EG über den Filter (1B) zu visualisieren.

7. Aufsetzen der Mikroobjekt für Durchfluss

1. Setzen Sie den Mikroobjekt auf die Bühne einer Invert-Phasenkontrastmikroskop. Schließen Sie den L-förmigen Stecker in die Einlassöffnung eines Kanals. Führen PBSA durch den Strömungskanal.
2. Platzieren Sie die L-förmigen Stecker von der Spritzenpumpe in die Auslassöffnung des Kanals. Stellen Sie die Spritzenpumpe zum Nachfüllen und drücken Lauf. Säubern Sie PBSA, die auf den Mikroobjekt getropft ist. Stellen Sie den Fokus, um die EC-Monoschicht zu visualisieren.

8. Perfusion von Leukozyten über Endothelzellen

1. Geben Sie 2 ml gereinigtem Neutrophilen in den Probenbehälter und lassen Sie es 2 Minuten erwärmen. 2 min waschen das Endothel mit PBSA.
2. Drehen Sie das Ventil ON an Neutrophile über Endothel durchströmen. Geben Sie sich die Neutrophilen-Bolus für 4 min. Das Ventil OFF und perfundieren PBSA aus dem Waschbehälter für den Rest des Experiments.
3. Darauf achten, dass keine Luftblasen durch den Strömungskanal zu jedem Zeitpunkt während des Tests übergeben, da dies die EG monolay störener und eine Ablösung von anhaftenden Neutrophilen.

9. Aufnahme Neutrophile Capture and Behavior

1. Nehmen Neutrophilenrekrutierung entweder während neutrophile Fluss oder Post-Perfusion.
2. Stellen Sie alle digitalen Aufnahmen von mindestens 5 bis 10 Felder in der Mitte des Strömungskanals. Identifizieren der Mitte des Kanals, indem die Objektiv an den Rand des Kanals an der Einlaßöffnung und das Identifizieren der Mitte der Schnittstelle.
   1. Für Aufnahmen bei Neutrophilen Fluss, nehmen Sie Bilder von einem einzigen Feld alle 10 Sek 1 Min. Bewegen entlang des Kanals und notieren ein weiteres Feld für 1 min. Wiederholen Sie für die Dauer des Bolus.
   2. Zum Aufzeichnen nach Perfusion, machen 10 sec Aufzeichnungs 5 ​​- 10 Felder in der Mitte des Strömungskanals für die Beurteilung Leukozyten Verhalten (typischerweise 2 min nach dem Ende der Neutrophilen Bolus). Nehmen Sie Bilder in jeder Sekunde im 10 Sekunden-Intervall. Dies ermöglicht eine ausreichende Zeit für die Erfassung von Strömungs und dem Verhalten von adhärenten neutrophils analysiert werden.
   3. Nehmen Sie ein einzelnes Feld, die mindestens 10 transmigrierten Neutrophilen für 5 min, wobei Bilder alle 30 Sekunden. Dies kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit der migrierten Zellen (entweder oberhalb oder unterhalb des Endothels) zu berechnen.
   4. Nehmen Sie eine Serie von 10 sec Felder (in der Regel 9 min nach der Perfusion). Dies ermöglicht Neutrophilen Zeit, um durch die endotheliale Monoschicht zu migrieren.
   5. Stoppen Sie die Spritzenpumpe und die Schläuche entfernen. Demontieren Sie die Flusskammer und spülen Sie den Probenbehälter und Schläuche. Wiederholen Sie für die nachfolgenden Filter / Mikroobjekt Kanäle.

10. Die Analyse der Leukozyten-Rekrutierung und Verhalten

1. Zählen Sie die Anzahl von Neutrophilen in den einzelnen Feldern während der 10 Sekunden-Aufnahmen im 2 Minuten-Zeitpunkt. Alle Zellen in der ersten zweiten Feld vorhanden sein muß, um gezählt. Zellen, die teilweise in dem Bereich von 2 Seiten (beispielsweise oben / rechten Rand) des Sichtfeldes sind, enthalten indie Zählungen, solange sie im Bereich bleibt für die volle 10 sec.
2. Berechnen Sie die mittlere Anzahl von anhaftenden Neutrophilen pro Feld. Die Länge und Breite der aufgezeichneten Bereich. Berechnen der Fläche des Feldes. Berechnen Sie, wie viele Felder gibt es in 1 mm ^2. Multipliziert man den Mittelwert Neutrophilenzahl durch die Anzahl der Felder in 1 mm ^2.
3. Berechnen der Gesamtanzahl der Neutrophilen durch Multiplizieren der Menge an Neutrophilen perfundiert perfundiert (beispielsweise 2 x 10 ⁶ / ml * Q [zB 0,0999 ml / min für Parallelplattenflusskammer]) durch die Dauer des Bolus (zB 4 min ).
4. Teilen die Neutrophilenzahl / mm ² durch die Gesamtzahl der Neutrophilen perfundiert, um die Gesamtzahl von Zellen, die eingehalten wurden (adhärente Zellen / mm ^{2/10 6} perfundiert) zu bestimmen.
5. Festzustellen, ob die anhaftenden Neutrophilen rollen, fest haft oder transmigrierten (Ergänzende Video 1 und 2).
   1. ARoll Neutrophilen ist Phase hell und langsam entlang der endothelialen Monolayer verschieben (1-10 & mgr; m / sec; Ergänzende Video 1).
   2. Fest haftenden Zellen Phase hell und gebunden an die EG-Oberfläche, entweder stationär bleibt (dh nicht in Bewegung während der Aufnahme) oder haben Form gewandelt und über die EG-Oberfläche (Abbildung 1Ei) migrieren.
   3. Ein transmigrierten Neutrophilen ist Phase dunkel und unter dem EC-Schicht (Abbildung 1Eii).
6. Der prozentuale Anteil von adhärenten Zellen, die den Roll werden, stationären und transmigrierten. Alternativ können neutrophile Verhalten als Gesamtzellzahl, die die verschiedenen Verhaltensweisen aufweisen, indem die gleiche Formel auf die Gesamthaftung zu berechnen (- 10.7 wie in den Schritten 10.6) ausgedrückt werden.
   1. Mark die Vorderkante eines Walz Neutrophilen. Markieren die Vorderkante der gleichen Zelle am Ende des 10-Sekunden-Sequenz. Ziehen Sie eine Linie Wetteschen den 2 Punkten und den Abstand, der die Zelle gereist.
   2. Dividieren dieses Werts durch die Dauer der Aufzeichnung, in dem die Zelle Walzen (dh 10 Sekunden). Versuchen Sie, und wählen Sie Neutrophilen, die auf dem Gebiet der gesamten 10 Sekunden Intervall sind.
7. Zur Berechnung der Geschwindigkeit der Neutrophilen die Migration über die Oberfläche (förmigen veränderten Phasen hell) oder unter dem Endothel (Phase dunkel) mit der 5 min-Aufnahme (Ergänzende Video 2).
   1. Den Umriss der migrierten Zellen am Anfang der Folge und verfolgen ihren Weg innerhalb der Sequenz. Notieren der X und Y-Positionen des Schwerpunktes bei jeder 1 min-Intervall für jede Zelle. Subtrahieren von Werten der X- und Y-Position von dem ersten Bild der Sequenz aus den Werten in dem zweiten Bild. Dies basiert auf der Satz von Pythagoras basiert.
   2. Subtrahieren der Werte von dem zweiten Bild aus dem dritten Bild. Tun Sie dies für alle Bilder in der Sequenz. Platz ter X- und Y-Werte, und fügen Sie sie zusammen.
   3. Quadratwurzel der resultierende Wert. Berechnen Sie die Geschwindigkeit für jede Zelle durch Mittelung der an jedem Minutenintervall berechneten Geschwindigkeiten. Track 10 migrierten Neutrophilen und berechnet die mittlere Geschwindigkeit.

Ergebnisse

Zunächst untersuchten wir den Effekt der Stimulierung mit TNF EG über die Rekrutierung von Neutrophilen aus Fluss mit dem Ibidi Mikroobjektmodell (Abschnitt 7-9). In Abwesenheit von TNF & alpha;, wenig oder gar keine Neutrophilen an der endothelialen Monoschicht anhaftet (2A). Dies war zu erwarten, da nicht behandelte / Ruhe EG nicht über die erforderliche Adhäsionsmoleküle (Selektine) oder Chemokine Ausdruck zu unterstützen verbindlich ^25,26. Im Gegensatz dazu deut...

Diskussion

Hier beschreiben wir zwei in vitro "vaskuläre" Modelle für die Untersuchung der Rekrutierung von zirkulierenden Neutrophilen durch entzündete Endothel. Ein wesentlicher Vorteil dieser Modelle ist die Fähigkeit, jeden Schritt in der Leukozytenadhäsion Kaskade zu analysieren, wie es in vivo auftreten. Wir haben bereits festgestellt, eine Dosis-abhängige Zunahme der Neutrophilen-Adhäsion an und Transmigration durch TNF-stimulierte EC ^9,29. Wir beschreiben auch, wie die beiden M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
25 cc tissue culture flask	SLS	353109
75 cc tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
6-well, 0.4 µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
10 ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4 °C.
20 ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5 ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2 ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50 ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.