乳癌細胞における腫瘍形成の阻害剤を同定するための軟寒天コロニー形成アッセイの活用

要約

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

要約

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

概要

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

プロトコル

3％の2-ヒドロキシエチルアガロースの調製

1. 清浄な乾燥した100mlのガラス瓶に、2-ヒドロキシエチル0.9gのアガロースを添加（アガロースVII）を蒸留水30mlに続きます。
2. 電子レンジ15秒間混合し、穏やかに渦巻きます。アガロース粉末が完全に溶解するまで、この手順を少なくとも3回繰り返します。
3. 15分間この溶液を含むボトルをオートクレーブ。
4. アガロース溶液は、さらに、使用前に室温まで冷却します。この溶液を室温で保管してください。

底層の調製：0.6％アガロースゲル

1. 取り扱いの際にピペットで固化からアガロースを防止するために、37℃のインキュベーターで事前に暖かい、いくつかの5ミリリットルと10ミリリットルピペット。
2. 部分的にボトルの蓋や電子レンジで15秒のための前作られた3％の2-ヒドロキシエチルアガロース溶液を緩めます。そして、静かに別の15秒のためのソリューション、電子レンジが渦巻きます。注意：agaroを旋回するときは注意してくださいSEソリューションソリューションは、空気にさらされると波及することができたときに上昇するためです。
3. ボトル内の残留固体ゲル、さらに数秒間マイクロ波が存在する場合。
4. 途中で固化からアガロース溶液を防止するために、次のステップの間に45℃の水浴中でアガロース溶液の入ったボトルを保管してください。
5. 37℃の水浴中で暖かいMCF10DCIS媒体。注：MCF10DCISメディアはDMEM / F12、5％ウマ血清、5％のペニシリンストレプトマイシンから成ります。
6. 転送滅菌50mlコニカルチューブに予め温めたピペットを用いて、3％アガロース溶液3ml。
7. すぐに暖かいMCF10DCISメディアの12ミリリットルを加え、穏やかにメディアとアガロースを混合するためにコニカルチューブを反転。それは後にコロニー計数を妨害するように気泡を形成しないようにしてください。
8. ゆっくりと気泡を形成することなく、6ウェル培養プレートの各ウェルにこの混合物を2mlを加えます。
9. 6ウェル培養プレートのhorizo​​ntaをインキュベートLLY 1時間4℃で平らな面には、混合物が固化することを可能にします。
10. 混合物が固化した後、30分間37℃のインキュベーターにプレートを配置します。底層が使用できるようになりました。

細胞を含有する層の調製：0.3％アガロースゲル

1. トリプシン処理MCF10DCIS細胞および4×10 ⁴ / mlの細胞濃度になるように、それらを希釈します。
2. 予め温めたピペットを用いて、3％アガロースの2ミリリットルを取り、滅菌50mlコニカルチューブに移します。
3. すぐにコニカルチューブにMCF10DCISメディアの8ミリリットルを加え、穏やかにメディアとアガロースを混合することが反転します。任意の気泡を形成することは避けてください。
4. MCF10DCIS細胞（4×10 ⁴ / ml）を2ミリリットルを取り、BB-CLA（0μM（DMSO）または1μM）で処理します。
5. 1：1希釈、0.6％アガロースで細胞を混ぜます。
6. 細胞 - アガロース混合物の1ミリリットルを取り、静かに6ウェル培養pの底層の上に追加します後期（2×10 ⁴細胞/ ml）。
7. 上層が固化することを可能にするために、少なくとも15分間、4℃で平坦な面に水平に6ウェル培養プレートに置き。
8. 混合物が固化した後、給電層を追加する前の週の37℃のインキュベーターにプレートを配置します。

フィーダー層の4製造：0.3％アガロースゲル

1. 電子レンジ15秒あらかじめ用意された3％の2-ヒドロキシエチルアガロース溶液。静かに別の15秒のためのソリューション、電子レンジが渦巻きます。
2. 45℃の水浴中でアガロース溶液のボトルを平衡化します。
3. 37℃の水浴中でMCF10DCIS媒体を温めます。
4. 50mlコニカルチューブに暖かいMCF10DCISメディアの9ミリリットルで3％アガロース溶液1mlを混合し、穏やかにメディアとアガロースを混合するために反転します。気泡を形成することは避けてください。
5. BB-CLA（0μM（DMSO）または1μM）との混合物を扱います。
6. 静か用なし（この混合物の1ミリリットルを追加明は、底部とソフト層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに）泡。
7. 混合物を固化することを可能にするために、少なくとも15分間、4℃で平坦な面に水平に6ウェル培養プレートに置き。
8. フィーダー層が固化した後、37℃のインキュベーターにプレートを配置します。
9. コロニー形成が観察されるまで、新しいメディアで細胞を補充するために、既存のフィーダー層の上に、0.3％アガロース/中/処理溶液の1ミリリットルを重ねることによって、この給紙手順を毎週繰り返します。注：柔らかくフィーダー層で寒天は非常に柔らかく、従って、フィーダー層からの追加の栄養素が容易に細胞に到達するために、細胞を含有する層中に拡散しています。

5.データ収集

1. 軟寒天における細胞成長の2.5週間後、光学顕微鏡を用いて、各ウェル中のコロニーの数を数えます。定量化を容易にするために、透明性の上にグリッドを印刷しにグリッドを添付6ウェルプレートは、細胞がカウント中にある場所を特定するのに役立ちます。 （各コロニーの直径によって定量化されるように）、コロニーサイズが異なりますので、採点されるコロニーを判断するための基準コロニーサイズを事前に定義。例えば、70ミクロン以下のデータ分析が大きいのコロニーの大きさがあります。
2. さらにコロニー形成を防止し、将来のカウントのために4℃でサンプルを保管してください。乾燥からゲルを防ぐためにパラフィルムで6ウェル培養プレートをシール。

結果

軟寒天コロニー形成アッセイは、癌細胞の腫瘍形成能を記録幅広い用途に使用することができます。この手法の主な利点は、半固体マトリックスが選択的足場に依存しない方法で増殖できる細胞の増殖に有利に働くということです。この特性は、主に癌細胞によってではなく、正常細胞によって示されます。我々は、主に薬剤による腫瘍増殖阻害の有効性を試験するために、この技術を使用?...

ディスカッション

軟寒天におけるコロニー形成の速度は、細胞型⁹によって異なり。したがって、細胞の数を最適化し、それに応じて調整されるべきで開始します。提案さ始動範囲は6ウェルプレートを使用してあたり^{4×10 2〜1×10} 5細胞の間です。また、コロニーの大きさは、各細胞の増殖速度に応じて変化します。そのため、コロニーの大きさのために事前に定義されたカットオフは、下流定?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1