Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario

Riepilogo

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Abstract

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Introduzione

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

Protocollo

1. Preparazione del 3% 2-idrossietile Agarose

1. In un secco bottiglia di vetro pulito, 100 ml, aggiungere 0,9 g di 2-idrossietile agarosio (Agarose VII) seguiti da 30 ml di acqua distillata.
2. Forno a microonde la miscela per 15 secondi e delicatamente agitare. Ripetere questa operazione almeno altre tre volte fino a quando la polvere si dissolve completamente agarosio.
3. Autoclave la bottiglia soluzione contenente per 15 min.
4. Lasciare che la soluzione di agarosio raffreddare a RT prima di un ulteriore utilizzo. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.

2. Preparazione dello strato inferiore: 0,6% agarosio gel

1. Pre-warm vari 5 ml e 10 ml pipette a 37 ° C incubatore per impedire l'agarosio solidificazione nella pipetta durante la manipolazione.
2. Parzialmente allentare il coperchio della bottiglia e forno a microonde il 3% soluzione di agarosio 2-idrossietile pre-made per 15 sec. Quindi, agitare delicatamente la soluzione e forno a microonde per altri 15 secondi. ATTENZIONE: Fare attenzione quando roteando il agarosoluzione se perché la soluzione si alza quando esposto all'aria e può traboccare.
3. Se c'è gel solido residuo nella bottiglia, microonde per pochi secondi.
4. Mantenere il flacone contenente la soluzione di agarosio in un bagno d'acqua a 45 ° durante le fasi successive per impedire la soluzione di agarosio solidificazione prematuramente.
5. Supporti MCF10DCIS caldo in un bagno di 37 ° C Acque. Nota: MCF10DCIS supporto costituito da DMEM / F12, siero di cavallo 5%, 5% di penicillina streptomicina.
6. Trasferimento 3 ml della soluzione di agarosio al 3% usando le pipette preriscaldate in un tubo da 50 ml sterile.
7. Immediatamente aggiungere 12 ml di media MCF10DCIS caldi e capovolgere delicatamente il tubo conico per mescolare il agarosio con i media. Cercate di non formare eventuali bolle come essa possa interferire con la colonia conta più tardi.
8. Aggiungere delicatamente 2 ml di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 6 senza formare bolle d'aria.
9. Incubare il 6 pozzetti cultura horizontally su una superficie piana a 4 ° C per 1 ora per permettere la miscela a solidificare.
10. Dopo solidifica miscela, posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 30 min. Lo strato inferiore è ora pronto per l'uso.

3. Preparazione del Layer-cellulare contenente: 0,3% agarosio Gel

1. Cellule Trypsinize MCF10DCIS e diluire ad una concentrazione cellulare di 4 x 10 ⁴ / ml.
2. Take 2 ml di agarosio 3% con pipette preriscaldata e trasferire in un tubo da 50 ml sterile.
3. Immediatamente aggiungere 8 ml di MCF10DCIS media per il tubo conico e capovolgere delicatamente per miscelare il agarosio con i media. Evitare la formazione di bolle.
4. Prendete 2 ml di cellule MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / ml) e trattare con BB-CLA (0 micron (DMSO) o 1 micron).
5. In una diluizione 1: 1, mescolare le cellule con l'agarosio 0,6%.
6. Prendere 1 ml di miscela di cellule-agarosio e aggiungere delicatamente sullo strato inferiore del 6 pozzetti cultura pin ritardo (2 x 10 ⁴ cellule / ml).
7. Posizionare la piastra di coltura da 6 pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a 4 ° C per almeno 15 minuti per consentire lo strato superiore si solidifichi.
8. Dopo solidifica miscela, posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° per una settimana prima di aggiungere il livello di alimentazione.

4. Preparazione dello strato Feeder: 0,3% agarosio Gel

1. Forno a microonde il 3% soluzione di agarosio pre-fatto 2-Hydroxyethyl per 15 sec. ruotare delicatamente la soluzione e forno a microonde per altri 15 secondi.
2. Equilibrare la bottiglia di soluzione di agarosio in un bagnomaria a 45 ° C.
3. Riscaldare i media MCF10DCIS in un bagno d'acqua a 37 ° C.
4. Mescolare 1 ml di soluzione di agarosio al 3% con 9 ml di mezzi MCF10DCIS caldo in una provetta da 50 ml e capovolgere delicatamente per miscelare il agarosio con i media. Evitare la formazione di bolle d'aria.
5. Trattare il composto con BB-CLA (0 micron (DMSO) o 1 micron).
6. Aggiungere delicatamente 1 ml di questa miscela (senza perming bolle) in ciascun pozzetto della piastra di coltura a 6 pozzetti contenenti il ​​fondo e morbidi strati.
7. Posizionare la piastra di coltura da 6 pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a 4 ° C per almeno 15 minuti per permettere alla miscela di solidificare.
8. Dopo che lo strato alimentatore solidifica, posizionare la piastra in un incubatore a 37 °.
9. Ripetere questa procedura alimentazione settimanale sovrapponendo 1 ml di soluzione di agarosio / medio / trattamento 0,3% sullo strato alimentatore esistente per ricostituire le cellule con nuovi media fino a quando si osserva la formazione di colonie. Nota: Agar negli strati morbidi e alimentazione è molto morbido e, di conseguenza, i nutrienti aggiunti dallo strato alimentatore prontamente diffondere nello strato di cellule contenenti per raggiungere le cellule.

5. Data Collection

1. Dopo 2,5 settimane di crescita cellulare in soft agar, contare il numero di colonie in ogni pozzetto usando un microscopio ottico. Per facilitare la quantificazione, stampare una griglia su un foglio trasparente e fissare la griglia alla6-pozzetti per aiutare a localizzare dove le cellule sono durante il conteggio. Poiché le dimensioni delle colonie (quantificata dal diametro di ogni colonia) varierà, predefinire una dimensione di riferimento colonia per determinare quale colonie saranno segnati. Per esempio, includere dimensioni colonia di 70 micron o maggiore nell'analisi dei dati.
2. Conservare i campioni a 4 ° C per impedire ulteriore formazione di colonie e per future conteggio. Sigillare la piastra di coltura 6 pozzetti con Parafilm per evitare che il gel si secchi.

Risultati

L'agar morbido dosaggio formazione di colonie può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni documentano la tumorigenicità delle cellule tumorali. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che la matrice semisolida favorisce selettivamente la crescita di cellule che possono proliferare in modo ancoraggio-indipendente. Questa caratteristica è esposto principalmente dalle cellule tumorali, ma non dalle cellule normali. Usiamo soprattutto questa tecnica per testare l'efficacia di inibizione del...

Discussione

Il tasso di formazione di colonie in agar morbido varia a seconda del tipo di cellula ^9. Pertanto, il numero di cellule per cominciare dovrebbe essere ottimizzato e regolato di conseguenza. Un intervallo di partenza consigliato è tra i 5 x ^02-01 OTTOBRE x 10 ⁴ cellule per bene con un 6-pozzetti. Inoltre, le dimensioni delle colonie varia a seconda del tasso di crescita di ogni cella. Pertanto, è necessario un predefinito un cut-off per dimensioni delle colonie di annotare colonie indiv...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1