소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는

요약

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

초록

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

서문

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

프로토콜

3 % 아가 로스 2- 히드 록시 에틸의 제조 1.

1. 깨끗하고 건조한 100 ml의 유리 병에, 30㎖의 증류수이어서 2- 히드 록시 아가 (아가 로스 VII) 0.9 g을 추가한다.
2. 15 초 부드럽게의 혼합물이 소용돌이 전자 레인지. 아가로 오스 분말이 완전히 용해 될 때까지이 단계를 적어도 세 번 이상 반복합니다.
3. 15 분 동안 용액을 함유 한 병을 압력솥.
4. 아가로 오스 솔루션을 추가로 사용하기 전에 실온까지 냉각 할 수 있습니다. 실온에서 솔루션을 저장합니다.

아래 층의 2. 준비 : 0.6 % 아가 로스 젤

1. 취급시 피펫에 응고에서 아가로 오스를 방지하기 위해 5 ㎖와 37 ° C 배양기에서 10 ml의 피펫 사전 따뜻한 몇 가지.
2. 부분적으로 병 뚜껑 마이크로파 15 초 동안 미리 만들어진 3 % 2- 히드 록시 아가로 오스 용액을 느슨하게. 그런 다음, 부드럽게 또 다른 15 초에 대한 솔루션과 전자 레인지를 소용돌이 친다. 주의 : 아가 소용돌이 때주의자체 솔루션 용액이 공기에 노출 이상 유출 할 수있을 때까지 상승하기 때문이다.
3. 병에 잔류 고체 젤, 몇 초 동안 전자 레인지가있는 경우.
4. 조기 고화 아가 용액을 방지하기 위해 다음 단계에서 45 ° C의 물 중탕에서 아가로 오스를 포함하는 용액을 보관 용기.
5. 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 MCF10DCIS 미디어. 참고 : MCF10DCIS 미디어는 DMEM / F12, 5 % 말 혈청, 5 % 페니실린 스트렙토 마이신으로 구성되어 있습니다.
6. 전송 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 예열 피펫을 사용하여 3 % 아가 로즈 용액 3 ㎖.
7. 즉시 따뜻한 MCF10DCIS 미디어의 12 ml에 추가하고 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합 원뿔 튜브를 반전. 그것은 식민지 나중에 계산을 방해하므로 모든 거품을 형성하지보십시오.
8. 부드럽게 기포를 형성하지 않고 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에,이 혼합물을 2 ㎖를 추가한다.
9. 6 웰 배양 판 horizo​​nta을 품어에서야 1 시간 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 혼합물이 응고 할 수 있도록합니다.
10. 혼합 응고 후, 30 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 바닥 층을 사용할 준비가 된 것입니다.

셀 함유층 3. 제조 : 0.3 % 아가로 스겔

1. 를 Trypsinize MCF10DCIS 세포를 4 × ¹⁰⁴ / ml의 세포 농도로 희석.
2. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 미리 예열 피펫 및 전송을 사용하여 3 % 아가로 오스의 2 mL를 취하여.
3. 즉시 원뿔 튜브에 MCF10DCIS 미디어의 8 ml에 추가하고 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합하는 반전. 모든 거품을 형성하지 마십시오.
4. (0 μM (DMSO) 또는 1 μM)을 MCF10DCIS 세포 (4 × ¹⁰⁴ / ㎖) 2 mL를 취하여 BB-CLA로 처리.
5. 1 : 1 희석, 0.6 % 아가로 오스와 세포를 섞는다.
6. 세포 혼합물을 아가로 1 ㎖를 취하여 부드럽게 6 웰 배양 (P)의 바닥층 상에 추가후반 (2 × ¹⁰⁴ 세포 / ㎖).
7. 상단 층이 응고 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 수평으로 6 웰 배양 판을 놓습니다.
8. 혼합 응고 후, 공급 층을 추가하기 전에 일주일 동안 37 ° C의 인큐베이터에 접시를 놓습니다.

세포층 4. 준비 : 0.3 % 아가 로스 젤

1. 전자 렌지 15 초 동안 미리 만들어진 3 % 2- 히드 록시 아가 용액. 부드럽게 다른 15 초에 대한 솔루션과 전자 레인지를 소용돌이 친다.
2. 45 ° C의 물을 욕조에 아가로 오스 솔루션 병 평형.
3. 37 ° C의 물을 욕조에 MCF10DCIS 미디어를 따뜻하게.
4. 50 ML 원뿔 튜브에 따뜻한 MCF10DCIS 미디어의 9 ml의 3 % 아가로 오스 액 1ml를 섞어 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합하는 반전. 공기 방울을 형성하지 마십시오.
5. BB-CLA와 혼합물 (0 μM (DMSO) 또는 1 μM)을 치료.
6. 부드럽게에 대한없이 (이 혼합물 1 ㎖를 추가밍 바닥 연질 층을 포함하는 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에) 거품.
7. 혼합물이 응고 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 수평으로 6 웰 배양 플레이트를 놓습니다.
8. 피더 층이 굳은 후, 37 ° C 배양기에 접시를 놓습니다.
9. 콜로니 형성이 관찰 될 때까지 새로운 매체를 사용하여 세포를 보충하기 위해 기존의 세포층에 0.3 % 아가로 오스 / 중 / 처리 용액 1 ㎖를 중첩하여이 공급 절차 주간를 반복합니다. 주 : 한천 부드럽고 피더 레이어 것은 따라서, 피더 레이어에서 추가 영양분 용이 세포에 도달하는 셀 - 함유 층으로 확산되며, 매우 부드럽고.

5. 데이터 수집

1. 소프트 한천에 세포 성장 2.5 주 후, 각 웰을 광학 현미경을 사용하여 콜로니 수를 카운트. 정량을 용이하게하기 위해, 투명도에 그리드를 인쇄에 그리드를 부착6 웰 플레이트는 세포가 계산하는 동안 어디에 찾을 수 있도록 도와줍니다. (각 식민지의 직경에 의해 정량화 등) 식민지의 크기가 달라질 수 있기 때문에, 채점되는 식민지 결정하는 기준 식민지 크기를 미리 정의. 예를 들어, 70 μm의 또는 데이터 분석의 큰 콜로니의 크기를 포함한다.
2. 더 콜로니 형성과 미래에 대한 계산을 방지하기 위해 4 ° C에서 샘플을 저장합니다. 이 건조 겔을 방지 파라 필름 6 웰 배양 접시를 밀봉.

결과

소프트 한천 콜로니 형성 분석은 암세포의 종양 유발 문서화 광범위한 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 기술의 주요 장점은 반고체 매트릭스 선택적 앵커리지 독립적 인 방식으로 증식 할 수있는 세포의 성장을 선호한다는 것이다. 이 특성은 주로 암세포가 아닌 일반 세포에 의해 발휘된다. 우리는 주로 약물에 의해 종양 성장 억제의 효과를 테스트하고 유방암 세포의 종양 유발에서 과발현 또...

토론

소프트 한천 콜로니 형성 속도는 세포의 종류에 따라 달라 ^9. 따라서, 셀의 수는 최적화하고 그에 따라 조정되어야로 시작. 제안 된 초기 범위는 잘 6- 웰 플레이트를 이용하여 당 ^4~10 X ^10월 2일부터 1일까지 X (5) 사이의 세포이다. 또한, 콜로니 크기는 각 셀의 성장 속도에 따라 변화한다. 따라서, 콜로니 크기 소정 컷오프 하류 정량적 분석에 대한 개별 콜로니 주석 필요하다...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1