コカイン誘発性行動感作の評価とマウスにおける条件付け場所嗜好

要約

This protocol is intended to enable researchers to conduct experiments designed to test these aspects of addiction using the conditioned place preference and locomotor behavioral sensitization assays.

要約

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to drugs of abuse make lasting alterations in the brain function of vulnerable individuals, and these persistent alterations likely serve to maintain the maladaptive drug seeking and taking behaviors characteristic of addiction/dependence². In rodents, reward experience and contextual associations are frequently measured using the conditioned place preference assay, or CPP, wherein preference for a previously drug-paired context is measured. Behavioral sensitization, on the other hand, is an increase in a drug-induced behavior that develops progressively over repeated exposures. Since sensitized behaviors can often be measured after several months of drug abstinence, depending on the dose and length of initial exposure, they are considered observable correlates of lasting drug-induced plasticity. Researchers have found these assays useful in determining the neurobiological substrates mediating aspects of addiction as well as assessing the potential of different interventions in disrupting these behaviors. This manuscript describes basic, effective protocols for mouse CPP and locomotor behavioral sensitization to cocaine.

概要

Research aimed at understanding drug addiction using animal models must take a variety of approaches to address each of the assorted components that obstruct treatment success, including reward/reinforcement/motivation and withdrawal and relapse, as well as the general persistence that further complicates these issues in addiction. Since rewarding experiences associated with taking a drug of abuse are thought to motivate subsequent use, studies focusing on drug-context associations may be particularly useful for understanding brain mechanisms that contribute to drug taking and seeking. One such assay, conditioned place preference (CPP) is a high-throughput method for comparing group differences in reward sensitivity. The traditional interpretation of the task involves classical, or Pavlovian, conditioning, where a conditioned stimulus (CS) is paired with an unconditioned stimulus (UCS), and after multiple pairings, the CS elicits the same behavior as the UCS (however, see^39,40). Theoretically, animals learn to associate an interoceptive state (reward or aversion) with contextual cues. The relative aversive or appetitive intensity of the interoceptive state is then assessed by then determining the animal's preference for the contextual cues. The use of place conditioning to measure drug-reward associations dates back to at least 1957, to a study using morphine on rats in a Y-maze^3,4. Over the past several decades, variations on this method have been widely used to study place preference and aversion in rodents to various stimuli, and it remains particularly useful in the study of associations induced by drugs of abuse. In drug-addiction research, the assay has been used to assess the rewarding properties of a number of drugs and the contribution of different brain systems and proteins to drug reward (for reviews, see^5-7,44). While there are superior methods of assessing factors that contribute to drug addiction, namely drug self-administration, CPP is a simple and much more accessible approach to measuring reward function.

Most current protocols for conditioned place preference and aversion (CPA) use an apparatus that allows rodents to have access to two distinct chambers, either via a doorway or smaller connecting chamber. Distinctions between the two chambers are often based, at a minimum, on visual and tactile cues, including wall color and floor texture, but sometimes include other elements, such as olfactory cues. "Biased" designs typically attempt to reverse a pre-existing, innate preference for one chamber over the other, such as the one that rodents generally show for a black chamber over white. "Unbiased" designs aim to create a preference to one of two chambers that were initially equally appealing by randomly counterbalancing assignment to either chamber within a group. A "balanced" design is used when animals show small preferences, but do not, as a group, favor the same chamber. Goals of this latter design are to produce 1) pre-test preference scores for the (eventual) cocaine-paired chamber that are not significantly different between experimental groups and 2) negligible preference for the cocaine-paired chamber at pre-test, either positive or negative⁸. The balanced design is ideal for use with the described chambers, which utilize contradicting biases for wall color (black over white) and flooring (wire over bar), resulting in a roughly equal distribution of small preferences for both the black and white sides in different animals. Balancing calculations are described in further detail below.

During conditioning, animals are exposed to a drug and quickly placed into one of these two environments for a limited time period. Exposure is typically via intraperitoneal (i.p.) or sometimes subcutaneous (s.c.) injection, although paradigms for intravenous (i.v.) self-administration⁹, and intracranial infusions³⁸ in a place preference apparatus have also been developed. These pairings are complemented by non-drug (vehicle) pairings of the same length conducted in the opposite chamber, which can take place on the same day as drug pairings or on separate days. In general, when allowed to explore the apparatus after conditioning, animals will spend more time where they received a rewarding drug (i.e., one that humans and animals will voluntarily self-administer), while they will avoid a place where they were given a drug that induced illness (e.g., lithium chloride). Several studies have been dedicated to optimizing the conditions for place preference to different drugs of abuse (for review, see⁷). Cocaine doses (i.p.) for mice generally range from 1 to 20 mg/kg, with doses less than 5 mg/kg often used to parse high sensitivity in one group. Two or more drug pairings are typically required for adult mice¹⁰, and the length of these pairings is an important consideration. Very low doses of cocaine require an immediate and brief conditioning, likely because this method captures the most rewarding period of the exposure. Delayed or very long conditioning periods can result in no preference, or may even induce aversion^11,12. Here is presented a basic method for obtaining conditioned place preference to cocaine in adult mice.

While the CPP assay is an ideal method for assessing reward-related learning and memory of drug-context associations, behavioral sensitization is arguably easier to perform and allows the assessment of changes that develop over repeated treatment. Also known as reverse-tolerance, behaviors undergoing sensitization are incrementally enhanced over repeated exposures to a particular drug of abuse, especially psychostimulants, and cross-sensitization is known to occur between some, but not all, of these drugs. One of the first assessments of cocaine-induced locomotor sensitization, in particular, in rodents was published in 1976¹³. A number of labs have shown that sensitized locomotion is detectable long after drug cessation, depending on the original length, location and dose of exposure^14-17, and the current protocol has been used to detect sensitization as long as 10 months following seven days (30 mg/kg) of cocaine treatment in mice¹⁸. The test can be performed using either photobeam or video-tracking technologies, in apparatuses of differing sizes and shapes, making it simple for many labs to perform. The robust nature, simplicity and persistence of locomotor sensitization makes its assessment an ideal part of examining basic mechanisms of long-lasting changes in drug-induced behavior.

As is expanded upon in the discussion, an important consideration when performing the locomotor sensitization assay is whether drug is given in the home- or test-cage environment. To take advantage of the robust sensitization that occurs when drug administration occurs outside of the home cage, this protocol employs this method. However, it has been observed that when animals are not adequately habituated to a new environment before drug exposure, a novelty-induced ceiling effect occurs on Day 1, which can partially or fully mask the progressive nature of sensitization. It is likely that this represents synergistic locomotor-activating effects of the drug together with novelty, and while the mechanisms underlying such effects may be interesting, the method described is designed to reduce the role of novelty and allow the effects of the drug to be measured more independently. While it is expected this method will be useful in the assessment of other locomotor-sensitizing drugs, it has primarily evaluated its effectiveness with cocaine in C57BL/6 mice.

プロトコル

全ての実験手順は、マクリーン病院施設内動物管理使用委員会によって承認されています。注：以下のプロトコルは、単一のCPPへのアプローチと運動感を説明し、多くの詳細については、他の成功したプロトコル （例えば、軽対など暗い相試験、連続した対間欠投与、）とは異なります。初心者は、手元の実験の質問（複数可）に基づいて、文献からの変化を適応させる、これらのプロトコルで始まる、または単にガイドとしてそれらを使用することもできます。自動測定方法が記載されています。しかしながら、各アッセイ（ すなわち 、ビデオ録画、ハンドスコア）のために非自動化手段を使用することが可能です。

1.条件付け場所嗜好

1. 機器やルームセットアップ：
   1. 試験前に、少なくとも3〜5日間、毎日1-3分間実験用マウスを処理します。
      注：-取り扱うことはありませんマウスは、チャンバSTREからの除去を見つけることができますssful、妨害またはコンディショニングを変更することができます。
   2. 好ましくは、自動データ収集¹⁸ photobeamsを装備した4以上の三室のCPP装置を得ます。確保各チャンバを高めることができるドアを介して小さく、中性のチャンバに接続する2つの大きく、visually-及び触覚的に異なるチャンバを有すること/アクセスを制御するために低下しました。各チャンバ上の蓋は、マウスの挿入/除去のために開く必要と小さな、個別に制御可能（調光可能）ライト（室につき1）を搭載したこと。
      注：CPPチャンバの設計は異なり、商業的に購入するか、または研究者によって構成することができます。 「バランスのとれた「デザインのために、推奨方式は、白い壁と黒い壁、バーの床とワイヤグリッドフローリングやその他とのうち大きい方のチャンバです。中間室は、灰色の壁と灰色固体プレキシガラスの床を持っている必要があります。説明の目的のために、これらのチャンバは、「白」、「黒」と「中と呼ぶことにします。 "ふたは透明プレキシガラスでなければなりません。代替コンパートメント構成（1または2室）も可能であり、（説明を参照）別の場所で説明。
   3. セットアップそれがテスト中であるように部屋：オフにするか、または最も暗い設定に頭上の照明を設定し、ドアを閉めます。各チャンバ内の露出計を使用して、中央の室が時間を費やしてからマウスを阻止するために、黒と白のチャンバー（6-10ルクス）よりも（15-20ルクス）少し明るくなるように蓋ライトを設定します。
      注：途中で費やした平均時間は、黒または白のチャンバに比べて同程度以上であれば、さらにステップ1.1.3で説明した照明のコントラストを高めます。また、中央のためにあまり魅力的な床材を使用しています。 （ 例えば 、均等に6×3.5×¼ "プレキシガラスに離間〜220直径0.5cmの穴、）が、このチャンバは嫌悪することを避ける。パイロットその中間の時間の減少を確実にする任意の変更は、総探査（交差）が減少したことによるものではありません。
   4. P以下のパラメータに従って自動データ収集（「手順、「 図1A）rogram、または手動でデータを収集します。空調室のいずれかにおける第1のビームブレイク時に開始する試験を設定します。長さは20分であることを「テスト」のセッションを設定し、各チャンバーで費やされた時間とビーム休憩を追跡します。各チャンバ内のビームブレークを測定するために（必要に応じて）30分長くなるように「コンディショニング」のセッションを設定します。試験中に照明するために、すべての室内灯を設定します。
   5. 手元の実験に必要なコカイン液のフルボリュームを準備します。 0.1ミリリットル/ 10g体重の注射容量で最終濃度を基づか、0.9％のNaCl（食塩水）でコカインのHClを溶解し（5ミリグラム/ kgの用量のために、 例えば 、溶液濃度は、0.5 mg / mlです）。 RTで30-45秒、滅菌フィルター（0.2μmのシリンジフィルター）とストアの渦混合物。
2. テスト：
   注：CPPのための一般的なタイムラインがPRE-TEST、コンディショニングされ、その後、POST-TEST。予備試験は、1-3日間コンディショニングから分離することができます。しかし、コンディショニングとポストテストの日は連続した日（ 図2A）に場所を取る必要があります。このタイミングは、同じ実験内のすべてのコホートに対して同じに保つ必要があります。
   1. 日全体で各動物の同じ装置を用いて、動物の光フェーズ中のテスト。
   2. 各試験日（ すなわち 、テスト、コンディショニング日）、行動の控え室にマウスを移動し、それらを裁判前に1〜1.5時間のために彼らのホームケージに静置することができます。裁判が始まるとマウスは、最小限の中断で、装置に彼らのケージから迅速に移動することができる場所を選択します。テスト（ 例えば 、機器のファン）に関連付けられている任意のノイズが存在するように、すべての機器の電源をオンにします。
   3. 徹底的にSAMを使用（前各マウスにし、後に軽度の、アルコール、グリコールエーテル系やアンモニア系消毒ワイプで各機器（内壁、床、トレイを）きれいに実験を通してクリーナーのEタイプ）。無視フローリングの下面ないでください。
   4. 毎日の初めにその部屋の照明が（オフまたは淡色表示）適切に設定されているか確認してください。
   5. それが「テスト」または「コンディショニング」の日であるかどうかに応じて、以下に進みます。
      1. 試用日数1及び6（ すなわち 、前後のテスト）で、開いた位置（ 図2B）にインター室のドアを配置します。
      2. 該当する場合は、「テスト」コンピュータプログラムをロードし、動物のID（ 図1A）を入力し 、その後、（ 図1B）startコマンドを発行します。
      3. ゆっくりと後ろの壁に直面し、その割り当てられた装置の中間室に各マウスを低下させ、そっとふたを閉めます。全てのチャンバがロードされると、試験室を出て、ノイズを最小限に抑えます。
      4. すべてのマウスのための試験が閉じるまで、各装置内のマウスを残す/（ 図1C）終了しました。エクスポート試験データ。
   <李>は直前または試験前に続いて、動物の重量を量ります。コンディショニング中に線量計算のためにこれらの重みを使用してください。
   6. （ すなわち 、「黒マイナス白"＆"白マイナス黒」他からこれらのそれぞれに費やされた時間を減算することにより、黒と白のチャンバのための各マウスの試験前「好み」を算出、コンディショニング試験のために準備するために、参照してください。 図3、列9＆10）。
   7. 強い初期の好みにマウスが均衡を困難にするので、嗜好度の許容限度（ 例えば、<総試行時間の33％）を確立し、計算から、それを超えたマウスを除外します。スレがそうであるときにテストが完了した後に（これはオフターゲットの外科的操作に、 例えば）を含めることを最大化するためにリベラル限界（<総試行時間の66％）を使用します。
      注：限界を超えるマウスがまだ平衡それらの試験前の好みを維持しようとすると、試験することができます。その後、トン必要に応じてHESEマウスは、試験前のスコアのバランスをとるために、分析から除外することができます。極端なプレテストバイアス（ すなわち 、> 800秒）が不釣り合いに一つのグループに影響を与える場合は、コンディショニング環境を変更すること、および/ ​​または他のアッセイを使用することを検討してください。
   8. 一方念頭に置いて、次の優先順位で各グループ内で対応する試験前の嗜好スコアを合計し、各マウスのための薬物ペアリング室として黒または白の室を​​選択します。
      注：各コホート内だけでなく、以前のコホート全体でグループ間の得点のバランスをとるように注意してください。
      1. 可能な限り同等のものとして、すべてのグループの合計を作成します。
      2. できるだけゼロ（ すなわち 、いくつかのマウスおよび他のための非優先側のための好ましい側を選択）に近い金額を確認します。ほぼゼロの和は、任意のグループのために不可能である場合には、密接にわずかに負のグループはオーバー合計好む、制限するグループのための最良の入手スコアを一致させるために他のすべてを再調整正。
      3. 限り実現可能な、白とさえ、各グループ内の薬剤のペアのための非優先室対好ま対黒の割り当てを維持します。
      4. それは、上記の目標を達成することは必ずしも可能ではないように、それ以降のコホートに対向バランスの考慮をすることによって、任意のずれを補正します。しかし、乱暴に異なる平均試験前の環境でコホートを生成しないようにしてください。
   9. コンディショニング日2-5で、閉鎖位置（ 図2C）にインター室のドアを配置します。
   10. ステップ1.1.5で説明し、試験前に測定した体重に基づいとして、コカイン（日間2＆4）または生理食塩水（日3＆5）溶液を用いて、個々の注射器を準備します。
       注：投与量は実験的な期待、冒頭で述べた検討事項、および潜在的な床と天井効果に関連して選択されるべきです。これは、少なくとも2つの異なる用量を使用して独立した実験を実施するのが最も効果的です。
   11. ロード "C該当する場合onditioning「コンピュータプログラムおよび動物のID（ 図1A）を入力し 、その後、（ 図1B）startコマンドを発行します。
   12. 首筋とすぐにそっと蓋を閉じ、背面壁に直面して、割り当てられた装置の適切な黒または白室にそれらを下げ、各マウス（IP）を注入します。全てのチャンバがロードされると、試験室を出て、ノイズを最小限に抑えます。
   13. 実現可能な正確に30分近くに彼らのチャンバーからマウスを取り外します（最初のマウス、 すなわち、他のマウスはまだコンディショニングされながら、チャンバから除去されます）。ノイズを導入することなく、できるだけ静か動物を削除します。
3. 統計分析：
   1. 分析の方法を選択します。いずれかの時点から事後テスト中に生理食塩水一対のサイドに費やさ減算時間は、ポストテスト（コカイン - 生理食塩水、秒）の間にコカイン一対のサイドに費やさまたはポストテスト薬剤対になっ室で過ごした時間を使用マイナスプレテスト時間は、薬物対になった室に費やしました。
      注：最初の方法を使用している場合は、平均時間のもプロット線グラフは、各グループの事前・事後テスト中にミドル、生理食塩水および薬物対になっ室で過ごしました。試験前と比較して、事後テストは、薬剤一対のサイドで時間の増加を示し、生理食塩水、一対のサイド（説明のための図6、底面、および考察を参照）に費やされる時間を減少させなければなりません。
   2. 比較されている基の性質と数に応じて、上記に提示された減算スコアのいずれかを分析するために、可能性の事後分析と、必要に応じて、t検定、1または2ウェイANOVAを使用しています。
      注：コカインの嗜好度は可変である傾向があり、さらに、陰性であることができ（ すなわち 、薬物一対のサイドに嫌悪感を示しています）。この結果はGR間の差異を決定する通常の、おそらく重要であるため嫌悪感を示したマウスは、（彼らは統計的な外れ値である場合を除き）は削除すべきではありませんoups。治療の効果の大きさに応じて、グループごとに12〜30匹の動物のサンプルサイズを必要とすることを期待しています。

2.歩行感

1. 機器やルームセットアップ
   1. ×8 4（X X Y）フォトビーム・アレイ（外形寸法11.5 "×20"）を取得します。配列（ 図4A）を収容するために黒色プレキシグラス製のオープン突破室（内寸22 1/6 "×13¾"×9 3/8 "）を構築します。
   2. 赤色光（ceiling-または壁掛け式）が試験中に使用することができるように試験室を準備します。
   3. 毎日の習慣性および射出試験のための独立したプログラムセッションを準備します。
      1. 60-120分（ 図5B）の間になるように30〜60分間、注入試験の間になるように馴化トライアルを設定します。それぞれについて、推奨される長さは60分です。同じ実験内の複数のコホート全体で一貫性のある裁判長にしてください。
      2. RECOを開始するために試験を設定スタート信号が（ 図5B）が開始された後に発生する第1のビームブレイク時にrding。可能であればボックスは、（ない一斉に）個別に起動することができるように、注射の裁判については、スタート信号を設定します。
      3. ユーザー定義の「ビン」は、好ましくは5分毎（ 図5B）に記録されるように設定ビームブレーク。
   4. 手元の実験に必要なコカイン液のフルボリュームを準備します。 0.1ミリリットル/ 10g体重の注射容量で最終濃度を基づか、0.9％のNaCl（食塩水）でコカインのHClを溶解し（5ミリグラム/ kgの用量のために、 例えば 、溶液濃度は、0.5 mg / mlです）。 RTで30-45秒、滅菌フィルター（0.2μmのシリンジフィルター）とストアの渦混合物。
2. 検査
   注：テストの初期段階は、10-11日間連続して実行されます。馴化（注射フリー）と注射：マウスは、2毎日の試験を受けます。 a〜fの最初の3のために生理食塩水を投与し同じ用量（ 例えば 、15ミリグラム/ kg /日）を使用して、次の7のための私達の日（生理食塩水馴化の重要性についての議論を参照）、およびコカイン。
   1. 毎日、1時間に30分間の行動控室に彼らのホームケージでマウスを順応させます。
   2. 、新鮮な寝具（ 例えば 、松チップ）の非常に薄い層できれいに標準のマウスサイズの透明なアクリル住宅ケージを準備していない無名のphotobeamsするように、該当する場合（ 図4C＆D）。
   3. 5ビームがその長さに沿って等間隔に配置されるように、一方の端部の近くにフォトビームアレイのY軸に対するプレイスケージ、。 X軸ビームは、この試験（ 図4CおよびD）で使用されていません。
   4. ランダムな順序、首筋に、彼らのホームケージからマウスを取り出し、それらの重量を量ります。 （サポート付き）、それらの尾の基部によって計量ボートから各マウスを削除し、その割り当てられた運動ケージに直接配置します。標準フィルタトップふた付き各ケージをカバーしています。
   5. ワット個々の注射器を準備します当日の体重に基づいて、ステップ2.1.7に記載したように、i番目の生理食塩水またはコカイン溶液。 15または20ミリグラム/ kgの用量で始まり、より高いまたはより低い用量を使用して第二の実験を考える（関連要因のための議論を参照してください）​​。
   6. 馴化試験はすべてのケージのために終了したら、注入プログラムをロードします。
   7. 一度に一つ、彼らのテストケージ、首筋からマウスを削除し、その注射（IP）を与えます。そのテストケージにマウスを返す前に、すぐにそのケージ（ 図5C、下）の開始信号を開始します。
   8. すべての注入試験が終了した後、ホームケージとその住宅の部屋にマウスを返します。
   9. オリジナル、半用量と同じ用量、ダブル用量、その後、生理食塩水、7日に同じ用量のチャレンジの前と3 7に可能：希望する場合は、マウスは次のような、離脱期間および薬物一連の課題を経験することができます追加の各課題の前に日。課題の選択、maintaiどのような実験内コホート全体でnは同様の離脱期間。
      注：元の線量が高い（ 例えば 、30ミリグラム/キログラム以上）であれば、二重投与量は低用量でスキップするか、交換する必要があります。生理食塩水の課題は、単独でコカインペアの環境によって任意のコンディショニング運動の活性化を明らかにし、その過程で、コカイン依存で感作された運動の量は、（説明を参照）。
3. 統計分析
   1. 分析のために使用される各試行の部分（複数可）を選択します。げっ歯類におけるほとんどのコカイン誘発運動は薬物注射後の最初の〜15-30分以内に起こります。関係する変数に応じて、複数の時間ウィンドウの累積歩行を分析検討する（ 例えば 、最初の15、30、60および/ ​​または120分）や裁判の独立したセグメントに焦点を当てています。
   2. 選択した時間枠を使用して、別々に慣れ、注入試験のために日によって各動物のビーム休憩を合計した後、各グループの合計verage。プロットを意味し、すべて日間の線グラフの平均（SEM）の標準誤差。治療はマウスは、初期および/または後期毎日の裁判における薬物への対応方法を変更することができるようにも毎日の裁判の過程で5分間のビンによって平均グループビーム休憩をプロットします。
      注：馴化および射出試験のために毎日の活動の平均値をプロットする（ 例えば 、最初の15分）、それが人為的にその運動が生理食塩水の注入によって減衰されるに見えますが、その活動は（ほとんどの場合）を持っている覚えは毎日慣れ年末までにこのレベルまで減少しました。
   3. 別途、必要に応じて、繰り返し測定（RM）ANOVAを日/時間の被験者内因子を有し、デザイン内の任意の被験者間要因を含むを使用して、連続した生理食塩水及び薬物治療日数分析します。コカイン（急性曝露）の1日目のグループの違い、と課題のための多変量分散分析を調査するために、t検定または一方向ANOVAを使用してください。適切な場合、significancに従ってください事後テストや単変量ANOVAを持つ電子。

結果

CPPアッセイの代表的な結果は、約生後9週間の野生型C57BL / 6Nマウスを使用して、 図6に示されています。研究デザインは、試験（前後）の被験者内変数と治療（生理食塩水とコカイン5および10mg / kg）を被​​験者間変数で、2×3混合要因でした。 RM ANOVAはた（p <0.01、F _1,20 = 9.86）試験の両方について観察された有意な主効果の代わりに解釈されたテストと治療（F <...

ディスカッション

このプロトコルは、薬物誘発行動可塑性の側面を評価するために、平均ラボで使用できるこれらの各々は条件付け場所嗜好及び運動増感するための方法を実証します。ほとんどの行動試験と同様に、基本的なプロトコル以外の追加値する考慮事項があります。まず、これらの技術の各々は、2つのフェーズ、誘導および発現を有すると考えられます。 「誘導」は、行動のためのCPPの開発をカ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cocaine Hydrochloride USP	Mallinckrodt Pharmaceuticals	0406-1520	Purchase and use (Schedule II controlled substance) for research purposes requires compliance and licensure according to state and federal law.
Conditioned Place Preference,  Three Compartment Apparatus with Manual Doors and Lights for Mouse	Med-Associates Inc.	MED-CPP-MS & MED-CPP-3013	Our laboratory has used these boxes; however, many alternative boxes are available & acceptable.
PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays	San Diego Instruments	2325-0223 & 7500-0221	Our lab houses these arrays inside of custom built chambers, as described in the text.  There are alternatives available.
Disposable Sani-Cloth disenfecting wipes	PDI	13872