ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

要約

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

要約

個別灌流微小血管の透過性を測定するための実験は、培養内皮細胞単層全体微小血管床の機能交換特性における血管透過性を調節する分子・細胞メカニズムの調査の間のブリッジを提供します。カニューレを挿入し、ラット腸間膜の細静脈微小血管を灌流し、微小血管壁の透水係数を測定する方法が記載されています。必要な主要機器は、3つの異なるマイクロツールを配置するためにマイクロマニピュレーターをサポートし、大きな修正段階で生体顕微鏡含まれています：微小血管にカニューレを挿入し、潅流する（1）面取りガラスマイクロピペットを、 （2）ガラスマイクロオクルーダ一過かん流を遮断し、測定された静水圧で経水流の運動の測定を可能にし、（3）鈍いガラス棒は、カニュレーション部位で腸間膜組織を安定化させることにします。修正されたランディスマイクロ閉塞techniqUEは、微小血管を横切るように、これらの実験条件は変更される流れと静水圧とコロイド浸透圧の差の繰り返し測定を慎重に制御される可能も経流体運動のマーカーとして人工灌流液中に懸濁させた赤血球を使用し、。第一制御灌流液を使用して、透水係数の測定、試験灌流液と同じ微小血管の再挿管後に、これらのよく制御された条件下での微小血管応答の一対比較を可能にします。なぜなら、マウスの腸間膜に長いストレートと分岐していない微小血管の不在で厳しく制限された血管透過性を変更することが予想遺伝子改変マウスでの腸間膜に微小血管にメソッドを拡張しようとしますが、使用して、同様の遺伝子改変ラットの最近の可用性CRISPR / Cas9技術は、本明細書に記載の方法を適用することができる研究の新しい分野を開くことが期待されます。

概要

血管系における微小灌流は、通常、直径が40μm未満の血管内にマイクロピペットを介し既知の組成の人工灌流液の流れを制御する確立することを伴います。灌流容器は通常の組織環境内のままで、挿管時に動物の血液を上にして灌流されます。ビデオイメージングまたは蛍光技術の範囲と併せて使用される場合、 その場での微小灌流にこれらのフローのための駆動力が知られており、血管壁の透過性特性があることができる条件下で、微小血管の壁を横切って水と溶質の流れを測定することができます直接評価。さらに、組織（灌流液とsuperfusate）で微小血管の周囲の流体の組成を制御することにより、微小血管の透過性や為替の規制は、電子の多様にさらされる微小血管の壁を形成する内皮細胞を有効にして調べることができますxperimental条件の時間の正確に測定期間（時間秒）のために（アゴニスト、修正された灌流条件、蛍光指示薬は、細胞内の組成およびシグナル伝達を測定します）。加えて、障壁を調節する重要な細胞の分子構造の超微細または細胞化学的評価は、透過性が直接測定されるのと同じ微小血管に調べることができます。アプローチは、それによって、培養内皮細胞単層および無傷の微小血管における調査に内皮バリア機能を変更するための細胞および分子メカニズムの調査の間にブリッジを形成しています。さらなる評価^1-6については、以下のレビューを見ます。

微小灌流の制限は、それだけで、薄く透明であり、ガラスマイクロピペットでのカニューレ挿入を可能にするのに十分な構造的完全性を有している微小血管床で使用することができることです。初期の研究は、腸間膜と薄い皮膚狭心症Mにカエルの微小血管を使用している間^7,8 uscle、はるかに哺乳動物のモデルの中で最も一般的に使用される製剤は、ラットの腸間膜^9-15です。ほとんどの調査は1-4時間の期間にわたって研究し、血管透過性の急性変化に焦点を当ててきたが、より最近の研究は、初期灌流^12,16の後に個々の容器での測定に24〜72時間を拡張されています。血管透過性の調節^{17を研究するための}より多くの遺伝的に改変されたラットモデルを利用できるようにすることを約束し、最近開発されたCRISPR技術は、これらの重要な新しいラットモデルで腸間膜の細静脈微小血管に適用されるこの通信に記載されている方法を有効にする必要があります。

方法は、動物の準備と灌流容器に近い位置のマイクロツールに使用される少なくとも三つのマイクロマニピュレーターの両方を保持するために、容器に灌流マイクロピペットを整列させるために十分な大きさの特注の顕微鏡ステージを備えた倒立顕微鏡を必要としますルーメン。例えばXY顕微鏡ステージ（約90×60センチメートル）のカスタムプラットフォームは防錆コーティングで厚さ1cmの鋼板から製造することができます。ステージは、エンジニアリングインデックステーブルまたは水平面内での移動のためにテフロンピラーやボール転送に直角に取り付けられており、サポートされている2つの鳩尾スライドに取り付けられています。典型的なリグ（図2参照）は、血管平滑の単一血管の血流およびヘマトクリット、血液灌流微小血管による局所的酸素運搬、規制を測定するものなど生体内微小循環実験の範囲に使用する顕微鏡や微細位置決め装置と多くの共通点を持っています筋緊張、および全体の循環に注入された蛍光トレーサーの局所的な微小血管の蓄積^。18-26

技術の基本的な側面は、微小血管壁の定義された表面積（S）全体の体積流量（Jの_V）の測定です。達成するためにこれは、本明細書に記載の修正ランディス技術によって、単純な倒立顕微鏡で十分です。小型ビデオカメラは、追加された時間基準と、画像ポートとビデオ信号上に搭載されたビデオモニタに表示され、コンピュータ上のデジタル形態又はビデオレコーダのデジタルまたはアナログ信号のいずれかとして記録されています。微小血管がカニューレを挿入されると、カメラに見える微小血管の一部が挿管を中断することなくユニットとしてステージとマニピュレータを移動することによって変更することができます。

経フローの測定はまた、溶質透過性の測定に使用リグ、蛍光細胞質カルシウムまたは他の細胞機構の比率を監視し、共焦点イメージング^6,12,13、などの適切なフィルタを使用して洗練された蛍光顕微鏡を使用して、より詳細な調査と組み合わせてもよいです^27。すべての微小灌流アプローチの重要な利点は、同じ容器に、反復測定を行うことができることですこのような静水圧および膠質浸透圧、または炎症状態に血管応答の誘発性変化として駆動力の制御された変化の下で。最も一般的な設計は、第二のピペットで、その後、ベースラインの透過性の状態を確立するために、第一の制御灌流液と赤の細胞懸濁液を充填したマイクロピペットを介して灌流容器と同じ容器に測定透水（のL _p）の一対比較であります試験薬剤と灌流液に加えます。複数のカニューレ挿入は、制御ピペットで再灌流後に繰り返しサイクルで可能です。

現在のプロトコルでは、微小血管の壁を越えた水フラックスを記録し、血管壁のL _P、そのまま全体の水と溶質のための共通の経路の透過性の有用な指標を測定するために、ラットの腸間膜に小静脈血管のカニュレーションおよび微小灌流を実証内皮障壁。手順が変更されたランディスtechniqと呼ばれています灌流がブロックされた後、経流体の交換の目安として、赤血球の相対的な動きを使用して、元のランディス原理は²⁸に保存されているので、UEが、実験条件（例えば、微小血管壁全体の静水圧およびアルブミン膠質浸透圧の差）の範囲微小灌流後に使用可能にuncannulated血液灌流微小血管^8,29に比べてはるかに大きいです。

プロトコル

倫理の声明：すべての手順を検討し、施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

マイクロピペット、レストレーナー、およびブロッカーの1予備作製

1. 引っ張ったときにそのように調整電子プラーを使用して半分にいくつかのきれいなホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを引っ張り、チューブの延伸部分の長さは約1cmであり、2つの半体がいくらか対称的です。テーパーは、 図1の寸法と一致していることを確認してください。マイクロピペット、レストレーナーとブロッカーの両方の半分を使用してください。
   1. ベベル水で浴び0.5μmの研磨紙で空気駆動^砥石 30 ^{を用いて、}マイクロピペット。それは水平から約30度になるようにマイクロピペットホルダーの角度を設定します。
   2. 徹底的に先端を通って、シャフトまできれいなアセトンを引っ張るために吸引を使用してマイクロピペットを洗浄し、乾燥させます。 （マイクロピペットを点検ワニ口クリップのマイクロピペットホルダーと接眼レチクルを装着した4×40×目標に小さな直立顕微鏡を用いて図1A）。
   3. 約50μm、長、長さ/幅の比が3.1〜3.5と腸間膜にタフなコラーゲン繊維に浸透するのに役立ちます鋭くテーパー点であるベベルと先端開口部を持つマイクロピペットを選択します。
   4. 無塵箱に少し様々なサイズの15〜20マイクロピペットを格納します。
2. ステップ1.1で調製した引っ張っ毛細管）を使用して、レストレーナーを作ります。平滑末端（ 図1B）を形成するためにマイクロフレームの近くに簡単に引っ張らガラスキャピラリーチューブを保持します。ダストフリーボックス内のいくつかを保管してください。
3. ステップ1.1で調製した引っ張っ毛細管）を使用してmicrooccludersを行います。 （例えば、チューブアダプタを使用して、23G）マイクロフレームの下に引っ張らキャピラリーチューブを握り、ゆっくりと曲げ先端の細い（先端から約4mmに）軸に近い120度の角度を作るために（ 図1C）。作成し、いくつかの格納します。

2.動物の準備と手術

1. 皮下注射を介してペントバルビタールナトリウム（80〜100ミリグラム/キログラム、Sigma-Aldrich社、P3761）と男性（350〜450グラム）または雌性Sprague-Dawleyラット（200〜300グラム）を麻酔。腹腔内注射を使用しないことで腸間膜を保護します。
2. 外科的手法と実験プロトコルを通して、必要に応じて補助的な注射（30 mgの/ kg）で麻酔を維持します。つま先のピンチや角膜反射によって麻酔の深さを決定します。実験手順の完了後、ペントバルビタールの過剰投与または麻酔下で飽和塩化カリウムの心臓内注射を介してラットを安楽死させます。

3.フローマーカーとして使用するためのソリューションおよび赤血球を準備

1. 10 mg / mlの脂肪酸を含むsuperfusateための哺乳類リンゲル液を調製し、灌流解決を制御する（通常は哺乳類リンゲル液無料のウシ血清アルブミン、BSA）。
   1. マイクロピペットチップをブロックする可能性があります小さな粒子を除去するために0.2μmのシリンジフィルターを通して灌流液フィルタ。小さなきれいな容器にフィルタリングします。
2. 0.05ミリリットルのヘパリン（千U / ml）を含む小型の注射器に20G針に麻酔をかけたラットの尾静脈から約0.2ミリリットルの血液を描画することにより、赤血球を準備し、約14 mLの哺乳類リンゲル液溶液を含む15mlの遠心チューブに移します。
   1. 優しく（7分間最大200×gで約）赤血球をパックする遠心分離機。上清をオフに描画し、リンゲル液中の赤血球を再懸濁。
   2. 上清3回遠心分離し、除去した後、後で使用するために、チューブの底に詰め赤血球を残します。この手順が正常レベル³¹の0.1％未満に、最終的な灌流液中の血小板が減少することに注意してください。

4.動物の組織をアレンジトレイ

1. 剣状突起にへそ下から麻酔したラットの腹部を剃ります。髪はよく組織の外にsuperfusateを描画するために芯を形成しないように剃った領域（右側に配置されたラットのための）右側の周りに延びていることを確認してください。濡れたガーゼパッドまたは組織でカット毛を削除します。
   1. 鈍鋸歯状の鉗子で皮膚を持ち、頑丈なハサミを用いて皮膚を通して（2-3センチ）中心線切開を行います。ファイン（アイリス）はさみを使用すると、腸の損傷を防ぐために、鋸歯状の鉗子で腹壁を持ち上げる、白線を通して同様の切開を行います。
   2. 動物トレイにその側の動物で、優しくリンゲル液及び鈍鋸歯状の鉗子に浸した綿棒アプリケーター（木の棒）を使用して腹腔から腸を引き出します。腸間膜は腸間膜に触れないように注意しながら顕微鏡で観察するための柱に掛けられるようにウェル組織で腸を配置（potentially鉗子または綿のいずれかで）微小血管を損傷させます。
      注：動物トレイ（ 図2A）はプレキシグラスから構成され、（約3ミリメートルの深）組織ウェルを必要とすることができ、光学的に透明な柱（例えば、研磨石英約2cmの直径と高5ミリメートル。）、加温パッド動物の体温を維持するように調整しました。柱の厚さは、目的の作動距離を超えてはなりません。
2. 腸間膜が接眼レンズを通して見えるように顕微鏡ステージ上の動物トレイを置きます。
3. 連続して35〜37℃に維持哺乳類リンゲル液で腸間膜を表面かん流するために重力供給ドリップラインを配置します。 、所定の位置に腸を保持する水分を保持に役立ち、かつ表面から過剰リンゲル液を吸い上げるために、ガーゼパッドを使用してください。流れを調整し、一貫性のあるsuperfusateの厚さを維持するための廃液を吸引します。
4. あるターゲット細静脈微小血管を識別収束流れ下流分岐していないセグメント、真の毛細血管の遠位に一つまたは二つの分岐。分岐していない容器を探す（理想的には、長さが600〜1000μm）の活発な血流と血管壁に付着する白血球の自由を持ちます。
5. 顕微鏡視野の中心にテスト微小血管の位置を調整し、選択されたカニューレ挿入部位近くの位置に拘束具を移動します。

5.ホルダーにマイクロピペットとマウントを記入

1. ただ、カニューレを挿入する前に、灌流液中の赤血球を中断。きれいなホウケイ酸試験管に0.5ミリリットル灌流液にパックされた赤血球の7μLを加えます。注意：1〜3％のヘマトクリットを使用することができますが、一貫性のヘマトクリットが赤血球から放出された任意の物質の一貫性の灌流液の濃度につながります。
2. 23GチューブアダプタとPE 50チューブ（5-15センチの長さ）を1mlシリンジを取り付けます。注射器に赤/灌流液細胞混合物を描画します。ミックスし、チューブからすべての気泡を排出するために注射器を逆さにし、アダプタ。効率向上のために、実験開始前のいくつかの注射器に、フィットチューブと埃のない箱やビニール袋に保管してください。
3. それはテーパ領域に当接するまでマイクロピペットの大端部にチューブを前進させることによって、マイクロピペットを埋めます。マイクロピペットチップを埋めるために、シリンジプランジャに優しい迅速なプッシュを適用します。注：小さなストリームまたは液滴が完全な充填を証拠する先端に表示されるはずです。
4. 静かにマイクロピペットシャフトの広い部分を埋めるために、プランジャーを押しながらチューブを撤回。慎重にマイクロピペットシャフトをフリックすることにより、広いシャフトの小さな気泡を除去。注：同様の手順^32に示されています。
5. 水圧力計への連続的な流体接続を可能にするサイドポートを備えたピペットホルダーにマイクロピペットを置きます。マイクロピペットの非常に微細な進歩を制御するために使用される油圧ドライブに接続されているホルダは、わずかな角度（15〜25°）であることを確認します水平にマイクロピペットのテーパーのエッジは、腸やトレイに当たらないようにします。
6. 試験容器（ 図2）に近い位置合わせを可能にするためにx、y、zのドライブが可動マイクロマニピュレーター、上油圧ドライブをマウントします。
7. 約40 CMH ₂腸間膜上記Oに圧力計の水柱内の流体の高さを変更するために、注射器や水を充填したゴム球を用いて、マイクロピペット内の流体に適用される静水圧を調整します。
8. ピペットを充填した後、できるだけ早く微小血管にカニューレを挿入。約40分後に非常に少数の赤血球が血管内に流入するように、赤血球は、ピペットの底に沈殿。

6. Microcannulationと微小血管の圧力測定

1. 顕微鏡下で満たされたマイクロピペットを配置する前に、そっと握りに組織を十分な力を付与する微小血管の近くの組織に拘束具を押してください。ドロー拘束後、腸間膜コラーゲン繊維の応力を容器に整列されるように、わずかに微小血管に沿って組織を伸ばします。
   1. 容器をマイクロピペットの位置を合わせ、接眼レンズを通してビューにそれを下げます。選択したカニューレ挿入部位のすぐ上流の先端を置き、それが部分的に血管内の流れを阻害するが、それを閉塞しないように、組織上にそれを下げます。
2. 油圧ドライブを使用して血管内腔にゆっくりとピペットチップを駆動することにより、血管にカニューレを挿入。容器の下側を通ってプッシュしないように注意してください。
   注：マイクロピペットは、内腔に入ると、灌流液が急速に内腔の外に血管内の血液を洗浄し、自由に灌流液下流の血管中の正常な血液灌流の一部を移動させる、テスト微小血管に動物の循環遠位に流れ込みます。
3. 示されているように（血液まで、圧力計を調整することにより、灌流圧を下げます灌流セグメントに引き戻されている）動物の赤血球によります。これは、赤血球を穏やか血管腔に振動バランス圧を決定し、微小血管セグメントの遠位端に微小血管静水圧力（P _C）を測定します。このバランス圧力以上のすべての圧力で血管灌流を維持します。

7. Microocclusionとデータの収集

1. オプションの手順：先端が繰り返さマイクロ中の実験容器を保護する組織の微パッドが蓄積するように遠い任意の容器から腸間膜の未使用領域における組織にそれを押して、血管をブロックするために、マイクロ閉塞器を使用する前に閉塞。
2. 顕微鏡視野の下縁部の近くに灌流容器の上にブロックを配置します。
3. ビデオとオーディオを次のように記録します。
   1. 接眼レチクル上に見られるように口頭でブロック部位の位置と下画面の端を記録します。
   2. 先端でただ微小血管の上方に配置されたブロッカーの、容器内の流れが閉塞されるまで、そっとブロッカーを低下させるためにマイクロマニピュレータの細かいZコントロールを使用します。オーディオの圧力計の圧力（P _cを）注意してください。 3-10秒間、通常、閉塞を適用し、その後放し、自由な灌流を復元します。時間に基づいて5〜10ミクロンのステップでピペットの先端に向かって血管までブロックサイトを移動します（>サイトの最初のブロックの後5分）閉塞の、番号（3-5）、ブロックサイトで血管壁の損傷を防ぐために。

L _pのデータと測定の8解析（透水）

1. ビデオの再生時には、ステージマイクロメーターと画像上の既知の位置の画像を用いて閉塞部位にマーカー赤血球から初期距離_{（ℓ0）を決定します} 。記録画像の3-10秒の間にいくつかのフレーム内の位置からマーカーセルの初期速度（dℓ/ dt）を決定します。阻止します鉱山閉塞時に撮影した画像から血管の半径（R）（ 図3）。
2. （dℓ/ dt）は、各閉塞するためのJ _V / Sを算出×（1 _{/ℓ0）×（R} / 2）。駆動圧で割った（Jの_V / S）などの一定の圧力で、L _pを計算する（微小血管の圧力-効果的なコロイド浸透圧、ディスカッションを参照してください）。

結果

図4は、4つの灌流液で連続的にカニューレを挿入微小血管細静脈ラットにL _Pにおける変化の時間経過を測定し結果を示す^。33定圧で算出さL _pの大きさは、微小血管壁の透過性の変化の指標として使用された、第一容器を10 nMのBkのを含む第二のマイクロピペットを用いて炎症剤のブラジキニン（BK）に暴露したときに1％ウシ血清アルブミンを含有する灌流?...

ディスカッション

L _pの_計算の詳細。容器が自由に灌流されている間経流体運動が起こるが、それは通常、血管灌流速度の0.01％未満であるため、そのような交換は無料灌流の間に測定することがあまりにも小さいです。しかし灌流は一過性微小血管を閉塞することにより停止したときのように、マーカー赤血球や閉塞部位との間の流体の列が短くなるように、経フロー（ すなわち...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon