Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Riepilogo

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Abstract

Gli esperimenti per misurare le proprietà di permeabilità dei microvasi irrorati individualmente forniscono un ponte tra studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano la permeabilità vascolare in coltura monostrato di cellule endoteliali e le proprietà di scambio funzionali di interi letti microvascolari. Un metodo per cannulare e perfusione microvasi venulari di ratto mesentere e misurare la conduttività idraulica della parete dei microvasi è descritta. Le principali attrezzature necessarie include un microscopio intravitale con un grande palco modificato che supporta micromanipolatori di posizionare tre differenti microtools: (1) una micropipetta di vetro smussato a cannulare e perfusione microrecipiente; (2) un vetro micro-occlusore per bloccare transitoriamente perfusione e consentire la misurazione di transvascular movimento flusso d'acqua ad una pressione idrostatica misurata, e (3) una bacchetta di vetro smussato per stabilizzare il tessuto mesenterico nel sito di incannulamento. Il Landis micro-occlusione techniq modificatoue utilizza globuli rossi sospese nel perfusato artificiale come marcatori di fluido movimento transvascular, e consente inoltre misurazioni ripetute di questi flussi condizioni sperimentali sono cambiati e differenza idrostatica e colloide pressione osmotica attraverso i microvasi sono attentamente controllati. Le misurazioni della conducibilità idraulica prima con un perfusato controllo, quindi dopo la ri-incannulamento della stessa microvasi con i perfusates prova consentono confronti della risposta dei microvasi in queste condizioni ben controllate associati. I tentativi di estendere il metodo per microvasi nel mesentere di topi con modificazioni genetiche che si prevede di modificare la permeabilità vascolare erano fortemente limitata a causa dell'assenza di lunghi microvasi dritti e ramificati nel mesentere del mouse, ma la recente disponibilità dei ratti con modificazioni genetiche simili utilizzando la tecnologia / Cas9 CRISPR è prevista l'apertura di nuove aree di indagine in cui possono essere applicati i metodi qui descritti.

Introduzione

Microperfusione nella vascolatura comporta istituisce controllato flusso di perfusato artificiale di composizione nota mediante una micropipetta in un vaso sanguigno di solito meno di 40 micron di diametro. Il vaso perfuso rimane nel suo ambiente tessuto normale e viene perfuso con dell'animale sangue fino al momento della cannulazione. Quando utilizzato in combinazione con una serie di video di immagini o di tecniche fluorimetrica, in situ microperfusione consente la misurazione dei flussi idrici e dei soluti attraverso le pareti dei microvasi in condizioni quali siano note le forze trainanti di questi flussi e le proprietà di permeabilità della parete vascolare può essere direttamente valutati. Inoltre, controllando la composizione del fluido circostante microrecipiente nel tessuto (perfusato e superfusate), la regolazione della permeabilità microvascolare e di scambio può essere indagata attivando le cellule endoteliali formano la parete microrecipiente essere esposti a una varietà di econdizioni Xperimental (agonisti, le condizioni di perfusione modificate, indicatori fluorescenti per misurare la composizione intracellulare e di segnalazione) per periodi misurati con precisione di tempo (sec a hr). Inoltre, le valutazioni ultrastrutturali o citochimici di chiave strutture molecolari cellulari che regolano la barriera possono essere studiate nelle stesse microrecipienti in cui la permeabilità viene misurata direttamente. L'approccio costituisce così un ponte tra studio dei meccanismi cellulari e molecolari di modificare la funzione di barriera endoteliale in coltura monostrato di cellule endoteliali e indagine microvasi intatti. Vedere le seguenti recensioni per un'ulteriore valutazione ^1-6.

Una limitazione di microperfusione è che può essere utilizzato solo in letti microvascolari che sono sottili, trasparenti e con integrità strutturale sufficiente a consentire incannulazione con una micropipetta di vetro. Mentre i primi accertamenti utilizzati microvasi rana in mesenterio e sottile cutanea pectoris muscle ^7,8, di gran lunga la preparazione più comunemente usato nei modelli di mammiferi è il topo mesentere ^9-15. La maggior parte delle indagini si sono concentrate sui cambiamenti acuti in permeabilità vascolare studiato per periodi di 1-4 ore, ma le indagini più recenti sono state estese a misurazioni su singoli pescherecci 24-72 ore dopo un iniziale perfusione ^12,16. La tecnologia CRISPR recentemente sviluppato, che promette di rendere più modelli di ratto geneticamente modificati per lo studio vascolare regolazione della permeabilità ¹⁷ dovrebbe consentire i metodi descritti nella presente comunicazione da applicare in microvasi venulari del mesentere di questi nuovi importanti modelli di ratto.

Il metodo richiede un microscopio rovesciato dotato di un palco microscopio su misura sufficientemente grande per contenere sia la preparazione degli animali e almeno tre micromanipolatori utilizzato per posizionare microtools vicino alla nave perfuso e per allineare una micropipetta perfusione con la navelumen. Ad esempio una piattaforma personalizzata per un palco microscopio xy (circa 90 × 60 cm) può essere fabbricata da una piastra di acciaio dello spessore di 1 cm con un rivestimento antiruggine. Lo stadio è collegato a una tabella indice ingegneria o due slitte a coda di rondine montate ad angolo retto e supportati su pilastri teflon o trasferimenti a sfere per il movimento nel piano orizzontale. Un impianto tipico (vedi figura 2) ha molto in comune con il microscopio e microposizionamento attrezzature utilizzate per una serie di esperimenti microcircolazione intravitale come quelli per misurare il flusso unico dei vasi sanguigni e dell'ematocrito, il trasporto di ossigeno locale sangue perfusione microvasi, regolazione di vascolare liscio il tono muscolare, e l'accumulo microvascolare locale dei traccianti fluorescenti iniettate nel suo complesso circolazione. ^18-26

L'aspetto fondamentale della tecnica è la misura della portata (J _v) attraverso una superficie definita (S) della parete microvascolare. Realizzarequesto tramite la tecnica Landis modificato qui descritta una semplice microscopio invertito è adeguata. Una piccola videocamera è montata sulla porta immagine e il segnale video, con una base tempo aggiunto, viene visualizzato su un monitor video e registrate in forma digitale su un computer o un segnale digitale o analogico su un videoregistratore. Una volta microrecipiente si incannula la porzione di microvasi visibile alla telecamera può essere modificato spostando la fase e manipolatori come unità senza interrompere la cannulazione.

Misurazione dei flussi transvascular può anche essere combinato con indagini più dettagliate utilizzando un sofisticato microscopio a fluorescenza con filtri appropriati, quali impianti utilizzati per la misurazione di soluto permeabilità, controllo rapporto fluorescente di calcio citoplasmatico o di altri meccanismi cellulari, e confocale ^{6,12,13, 27.} Un vantaggio fondamentale di tutti gli approcci microperfusione è la capacità di fare misure ripetute, sulla nave, Sotto cambiamento controllato di forza motrice, come pressioni idrostatiche e oncotica, o cambiamento indotto nella risposta dei vasi alle condizioni infiammatorie. Il tipo più comune è un confronto accoppiato di conduttività idraulica misurata (L _p) sulla nave con il vaso prima perfuso con una micropipetta riempito con un perfusato controllo e sospensione di eritrociti per stabilire uno stato basale permeabilità, quindi con una seconda pipetta con l'agente di test aggiunto perfusato. Molteplici cannulazioni sono possibili con il ciclo ripetuto dopo riperfusione con la pipetta di controllo.

Il presente protocollo dimostra la cannulazione e microperfusione di un vaso venulare nel ratto mesentere registrare flussi di acqua attraverso la parete microvessel e misurare la L _p della parete del vaso, un indice utile della permeabilità del percorso comune per l'acqua e soluti attraverso intatto barriera endoteliale. La procedura si chiama techniq Landis modificatoue perché il principio originale Landis di utilizzare il movimento relativo dei globuli rossi come misura di scambio fluido transvascular dopo perfusione è bloccato è conservato ^28, ma la gamma di condizioni sperimentali (ad esempio, le differenze di pressione oncotica idrostatica e albumina attraverso la parete microrecipiente) disponibile dopo microperfusione è di gran lunga maggiore rispetto al sangue perfuso uncannulated microvasi ^8,29.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso degli animali istituzionale.

1. Fabbricazione preliminare di Micropipette, la limitazione dei movimenti, e bloccanti

1. Estrarre diversi tubi capillari di vetro borosilicato pulite in metà con un estrattore elettronico regolato in modo che, quando viene tirato, la porzione allungata del tubo è di circa 1 cm di lunghezza e le due metà sono piuttosto simmetriche. Assicurarsi che il cono è coerente con le dimensioni in figura 1. Utilizzare le due metà per micropipette, la limitazione dei movimenti e bloccanti.
   1. Bevel le micropipette con un'aria azionato mola ^{30 con} 0,5 micron carta abrasiva bagnata con acqua. Impostare l'angolo del supporto micropipetta in modo che sia di circa 30 gradi rispetto all'orizzontale.
   2. Lavare accuratamente e asciugare le micropipette utilizzando aspirazione a tirare acetone pulita attraverso la punta e il pozzo. Ispezionare le micropipette (Figura 1A) con un piccolo microscopio verticale con 4 × 40 × e gli obiettivi dotati di un supporto micropipetta coccodrillo e un reticolo oculare.
   3. Selezionare le micropipette con apertura punta di circa 50 micron di lunghezza con uno smusso il cui rapporto lunghezza / larghezza è compresa tra 3.1 e 3.5 e con un punto di profonda rastrematura che aiuta a penetrare le fibre di collagene dure nel mesentere.
   4. Conservare 15-20 micropipette di leggermente diverse dimensioni in una scatola senza polvere.
2. Fai la limitazione dei movimenti che utilizzano tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare di vetro tirato brevemente vicino a un microfiamma per formare una punta smussata (Figura 1B). Conservare diversi in una scatola senza polvere.
3. Fai microoccluders utilizzando tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare tirato sotto un microfiamma e delicatamente piegare (tramite un adattatore tubi, ad es., 23G) la punta fine (circa 4 mm dalla punta) a formare un angolo di quasi 120 gradi all'albero ( Figura 1C). Marca e memorizzare diversi.

Preparazione degli animali 2. e Chirurgia

1. Anestetizzare maschile (350-450 g) o ratti femmina Sprague-Dawley (200-300 g) con sodio pentobarbital (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) per via sottocutanea; proteggere il mesentere non usando iniezione intraperitoneale.
2. Nel corso procedure chirurgiche e protocolli sperimentali, mantenere l'anestesia con iniezioni supplementari (30 mg / kg) in base alle esigenze. Determinare profondità dell'anestesia per pizzico piedi o riflesso corneale. Dopo il completamento della procedura sperimentale, eutanasia ratto con pentobarbital sovradosaggio o iniezione intra-cardiaca di cloruro di potassio saturo sotto anestesia.

3. Preparare Soluzioni e eritrociti da utilizzare come flusso Marcatori

1. Preparare la soluzione dei mammiferi di Ringer per superfusate e soluzione di controllo perfusato (mammiferi soluzione di Ringer contenente 10 mg / ml di acido grasso in generegratis albumina sierica bovina, BSA).
   1. Filtro perfusato attraverso 0,2 micron filtri siringa per rimuovere le particelle molto piccole che potrebbero bloccare la punta micropipetta; filtrare nel piccolo contenitore pulito.
2. Preparare eritrociti disegnando circa 0,2 ml di sangue dalla vena della coda del topo anestetizzato in un ago 20G in una piccola siringa contenente 0,05 ml di eparina (1.000 U / ml) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente circa 14 ml di mammifero soluzione Ringer .
   1. Centrifuga per imballare delicatamente le cellule rosse (circa max 200 × g per 7 minuti). Aspirare il surnatante e risospendere i globuli rossi in soluzione di Ringer.
   2. Dopo centrifugazione e la rimozione del supernatante tre volte lasciano i globuli rossi concentrati nella parte inferiore del tubo per un uso successivo. Si noti che questa procedura riduce piastrine nei perfusates finali a meno dello 0,1% dei livelli normali ^31.

4. Disporre il tessuto sul AnimalVassoio

1. Radere l'addome del topo anestetizzato da sotto l'ombelico al processo xifoideo. Assicurarsi che l'area rasata estende intorno al lato destro (per ratto posto sul lato destro) in modo che i capelli non forma uno stoppino per disegnare il superfusate fuori del tessuto ben. Rimuovere i peli tagliati con una garza bagnata o tessuto.
   1. Tenere la pelle con un ottuso pinza dentata e fare un'incisione linea centrale (lunga 2-3 cm) attraverso la pelle utilizzando un paio di forbici robuste. Utilizzando una multa (iris) forbici fanno un'incisione simile attraverso la linea alba, sollevando la parete addominale con una pinza dentata per evitare di danneggiare l'intestino.
   2. Con l'animale su un fianco sul vassoio animale, estrarre delicatamente l'intestino dalla cavità addominale utilizzando applicatori con punta in cotone (bastone di legno) imbevute di soluzione di Ringer e pinze dentellate smussato. Disporre l'intestino nel tessuto bene in modo che il mesentere è drappeggiato su colonna per la visualizzazione al microscopio facendo attenzione a non toccare il mesentere (potentially danneggiando microvasi) sia con pinze o cotone.
      Nota: Il vassoio animale (Figura 2A) può essere costruito da plexiglas e richiede un tessuto ben (circa 3 mm di profondità), una colonna otticamente trasparente (ad esempio, quarzo lucidato circa 2 cm di diametro e 5 mm di altezza.), E un tampone riscaldamento regolato per mantenere la temperatura dell'animale. Lo spessore del pilastro non deve superare la distanza di lavoro dell'obiettivo.
2. Posizionare il vassoio animale sul palco microscopio in modo che il mesentere è visibile attraverso gli oculari.
3. Posizionare una linea di gocciolamento per gravità a superfuse continuamente mesentere con la soluzione dei mammiferi di Ringer mantenuta a 35-37 ° C. Utilizzare garze per tenere l'intestino in luogo, contribuire a mantenere l'umidità e favorire la soluzione in eccesso di Ringer fuori dalla superficie. Regolare il flusso e aspirare l'effluente di mantenere uno spessore superfusate coerente.
4. Identificare bersaglio microvasi venulari, che sonosegmenti non ramificate a valle del flusso convergente, uno o due rami distali ai veri capillari. Trovare un vaso non ramificato (idealmente, da 600 a 1.000 micron di lunghezza) che hanno attivo il flusso di sangue e privo di globuli bianchi che spuntano sulle pareti del serbatoio.
5. Posizionare microrecipiente prova nel centro del campo ottico e spostare il dispositivo di immobilizzazione nella posizione vicino al sito cannulazione prescelto.

5. Riempire Micropipetta e il Monte di Holder

1. Poco prima cannulating, sospendere i globuli rossi del perfusato. Aggiungere 7 ml di globuli rossi concentrati a 0,5 ml perfusato in una provetta pulita borosilicato. Nota: ematocrito del 1-3% può essere utilizzato, ma ematocrito coerente porterà a concentrazioni perfusato coerenti di eventuali sostanze rilasciate dai globuli rossi.
2. Montare una siringa da 1 ml con un adattatore tubi 23G e PE 50 tubi (5-15 cm di lunghezza). Disegna la / miscela di cellule rosso perfusato nella siringa. Capovolgere la siringa per mescolare ed espellere tutte le bolle dal tubo eadattatore. Per una maggiore efficienza, la tubazione adatta a diverse siringhe prima dell'inizio dell'esperimento e tenerli in una scatola senza polvere o sacchetto di plastica.
3. Riempire il micropipetta avanzando il tubo nel grande fine della micropipetta fino a che non confina con la regione rastremata. Applicare una spinta rapida delicato sulla stantuffo della siringa per riempire la punta micropipetta. Nota: Un piccolo ruscello o di goccioline devono essere visibili sulla punta di evidenziare riempimento completo.
4. Ritirare il tubo mentre spingendo delicatamente lo stantuffo per riempire la parte più larga dell'albero micropipetta. Rimuovere piccole bolle nel vasto pozzo muovendo con cautela l'albero micropipetta. Nota: Una procedura simile è stata illustrata ^32.
5. Posizionare la micropipetta in un supporto pipetta con una porta laterale che consente un collegamento di fluido continuo ad un manometro ad acqua. Assicurarsi che il titolare, che è attaccato ad un azionamento idraulico utilizzato per controllare l'avanzamento molto fine della micropipetta, è con una leggera angolazione (15-25 °)all'orizzontale in modo che il bordo del cono micropipetta non colpisce l'intestino o il vassoio.
6. Montare l'azionamento idraulico su un micromanipolatore mobile, che ha x, y, z e unità per consentire stretto allineamento al recipiente di prova (figura 2).
7. Regolare la pressione idrostatica applicata al fluido nella micropipetta con una siringa o bulbo di gomma pieno d'acqua per modificare l'altezza del liquido nella colonna d'acqua del manometro a circa 40 cm H ₂ O sopra mesentere.
8. Incannulare microrecipiente appena possibile dopo il riempimento della pipetta; globuli rossi si depositano sul fondo della pipetta, in modo che dopo circa 40 min pochissimi globuli rossi fluirà nel recipiente.

6. Microcannulation e microvascolari pressione misura

1. Prima di posizionare la micropipetta pieno sotto il microscopio, premere delicatamente il restrainer sul tessuto pressi microrecipiente applicare una forza sufficiente per afferrare il tessuto. Disegnare larestrainer indietro, leggermente l'allungamento dei tessuti in linea con microrecipiente modo che le sollecitazioni nelle fibre di collagene mesenterici sono allineate con il vaso.
   1. Allineare la micropipetta con la nave e abbassarlo in vista attraverso gli oculari. Posizionare la punta appena a monte del sito di incannulamento scelto e abbassarlo sul tessuto in modo che ostruisce parzialmente il flusso all'interno del recipiente, ma non occlude esso.
2. Incannulare la nave guidando la punta della pipetta lentamente nel lume del vaso con l'azionamento idraulico. Fare attenzione a non spingere attraverso il lato inferiore del recipiente.
   Nota: Poiché la micropipetta entra nel lumen, il perfusato lava rapidamente il sangue nel vaso di lume e perfusato liberamente sfocia circolazione distale degli animali alla microrecipiente prova, spostando parte del normale perfusione sanguigna nei vasi a valle.
3. Abbassare la pressione di perfusione regolando manometro finché il sangue (come indicatoda globuli rossi dell'animale) viene tirato indietro nel segmento perfusione; questo determina la pressione equilibrio in cui i globuli rossi oscillano dolcemente nel lume del vaso e misura la pressione idrostatica microvasi (P _c) all'estremità distale del segmento microvasi. Mantenere nave perfusione a tutte le pressioni di cui sopra questa pressione equilibrio.

7. Microocclusion e raccolta dei dati

1. Passaggio facoltativo: Prima di utilizzare il micro-occlusore per bloccare la nave, premere in tessuto, in una zona non utilizzata di mesentere lontano da ogni nave in modo che la punta si accumula un bel blocco di tessuto che protegge la nave sperimentale durante micro ripetuto occlusioni.
2. Posizionare il blocco di sopra del recipiente perfuso vicino al bordo inferiore del campo del microscopio.
3. Registrare il seguente con il video e l'audio.
   1. Verbalmente registrare la posizione del sito di blocco e il bordo schermo inferiore come visto sul reticolo oculare.
   2. Con la puntadel bloccante posta proprio sopra il microvasi, utilizzare il controllo z multa di micromanipolatore per abbassare delicatamente il blocco fino a quando il flusso nel serbatoio è occluso. Nota la pressione manometro (P _c) audio. Applicare l'occlusione di solito per 3-10 secondi, quindi rilasciare, ripristinando la perfusione gratuito. Spostare il sito blocco la nave verso la punta della pipetta in 5-10 micron passi in base al tempo (> 5 min dopo il blocco iniziale in un sito), il numero di occlusioni (3-5), per evitare di danneggiare parete del vaso presso il sito del blocco .

8. Analisi dei dati e valutazione di _L p (acqua permeabilità)

1. Durante la riproduzione video, determinare la distanza iniziale (ℓ ₀₎ da una cella rossa marcatore per il sito dell'occlusione dall'uso di un'immagine di un micrometro e le posizioni note sulle immagini. Determinare la velocità iniziale (dℓ / dt) della cella marcatore dalla sua posizione in diversi frame durante la 3-10 sec di immagini registrate. Dissuadereminiera il raggio del serbatoio (r) dalle immagini scattate durante l'occlusione (Figura 3).
2. Calcola J _v / S per ogni occlusione (dℓ / dt) × (1 / ℓ ₀₎ x (r / 2). Calcolare L _p ad una pressione costante (J _v / S) diviso per la pressione di pilotaggio (pressione microvasi - efficace pressione osmotica colloide; vedi Discussione).

Risultati

La Figura 4 mostra i risultati di misurazione del decorso temporale delle variazioni di L _p in un ratto venulare microvasi cannulato successivamente con quattro perfusates. ³³ L'entità di L _p calcolata a pressione costante è stato usato come una misura delle variazioni di microvasi permeabilità della parete, prima nello stato di controllo con un perfusato contenente 1% di albumina sierica bovina poi, quando la nave è stata esposta per la bradichinina agente infia...

Discussione

Dettagli dei calcoli _p L. Anche se il movimento fluido transvascular si verifica mentre la nave è liberamente perfuso, tale scambio è troppo piccolo per essere misurato durante la perfusione libero perché è in genere inferiore allo 0,01% del tasso di perfusione nave. Tuttavia, in condizioni di perfusione viene transitoriamente fermato occludendo microrecipiente, flusso transvascular (cioè, filtrazione) è misurata dal movimento dei globuli rossi marcatori nel lume della colonna di fluid...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon