Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Özet

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Özet

Bireysel perfüze mikrodamarlar geçirgenlik özelliklerini ölçmek için deneyler kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve tüm mikrovasküler yatak fonksiyonel değişim özelliklerinde damar geçirgenliğini düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaların araştırılması arasında bir köprü oluştururlar. Kanül ve sıçan mezenter venüler mikrodamarlar serpmek mikrodamar duvarının hidrolik iletkenliği ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Gerekli temel ekipmanları üç farklı microtools konumlandırmak için mikromanipülatörler destekleyen büyük bir modifiye sahne ile bir intravital mikroskop içerir: (1) bir eğimli cam mikropipet cannulate ve mikrodamar serpmek için; (2) bir cam mikro-tıkayıcı geçici perfüzyon blok ve ölçülü bir hidrostatik basınçta transvasküler su akış hareketinin ölçülmesine olanak tanıyan, ve (3) kör bir cam çubuk kanül yerinde mezenterik doku dengelenmesi için. Modifiye Landis mikro oklüzyon technique mikrodamarlar karşısında bu kadar deneysel koşullar değiştiğinde akımları ve hidrostatik ve kolloid osmotik basınç farkı tekrarlanan ölçümler titizlikle kontrol edilir kılar da transvasküler sıvı hareketinin belirteçleri olarak yapay perfüzat içinde asılı kırmızı hücreleri kullanır ve. Sonra ilk deneme Perfüzatlar aynı mikro damarın yeniden kanülasyondan sonra, bir kontrol perfüzyon kullanarak hidrolik iletkenlik ölçümleri bu iyi kontrollü koşullar altında mikrovasküler yanıt karşılaştırmalar eşleştirilmiş etkinleştirin. Vasküler geçirgenliği değiştirmek için beklenen genetik değişiklikler ile farelerin mezenterinde mikrodamarlar yöntemi genişletmek için girişimleri nedeniyle fare mezenterinde uzun düz ve dalsız mikrodamarlar yokluğu ciddi sınırlı, ama benzer genetik değişikliklerle sıçanların son durumu kullanarak CRISPR / Cas9 teknolojisi burada tarif edilen yöntemler uygulanabilir soruşturmanın yeni alanlar açılması bekleniyor.

Giriş

Damar sisteminde sayılı Şekilde, mikro çapı genellikle 40 um den az bir kan damarının bir mikropipet vasıtasıyla bilinen bir bileşimin, yapay bir perfüzat akışını kontrol kuran gerektirir. Perfüze gemi normal doku ortamında kalır ve Kanülasyonu zaman hayvanın kanı yukarı ile perfüze. In situ sayılı Şekilde, mikro video görüntüleme veya florometrik bir dizi teknik ile bağlantılı olarak kullanıldığında bu akışları için itici güçler bilinmektedir ve vasküler duvarın geçirgenlik özellikleri olabilir koşullar altında mikro damarların duvarları arasında, su ve çözünmüş madde akımlarının ölçümü sağlar doğrudan değerlendirildi. Bundan başka, doku mikrodamar (perfüze ve superfusate), çevreleyen sıvı bileşimlerini kontrol ederek, mikrovasküler geçirgenliğin ve değişim düzenlenmesi e maruz bırakılmış olan mikrodamar duvarı oluşturan endotelial hücreler sağlayarak araştırılabilirXperimental koşullar zaman tam ölçülen süreler (saat sn) için (agonistler, modifiye perfüzyon koşulları, floresan göstergeler içi kompozisyon ve sinyalizasyon ölçmek için). Buna ek olarak, bariyer düzenleyen önemli hücresel molekül yapılarının ultrastrüktürel ya sitokimyasal değerlendirmeler geçirgenliği ile doğrudan ölçüldüğü aynı Mikro damarların içinde araştırılabilir. Yaklaşım ve böylece kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve bozulmamış mikrodamarlar soruşturma endotel bariyer fonksiyonunu değiştirmek için hücresel ve moleküler mekanizmalar soruşturma arasında bir köprü oluşturmaktadır. Daha fazla değerlendirme ^1-6 aşağıdaki bakın.

Şekilde, mikro bir sınırlaması, sadece ince, saydam ve bir cam mikropipet ile kanülasyon mümkün kılmak için yeterli yapısal bütünlüğe sahip mikrovasküler yatak kullanılabilir olmasıdır. Erken araştırmalar mezenter ve ince deri pektoris m kurbağa mikrodamarlar kullanılır iken^7,8 uscle, bugüne kadar memeli modellerinde en sık kullanılan hazırlama sıçan mezenter ^9-15 olduğunu. Çoğu araştırmalar 1-4 saatlik sürelerde çalışılan damar geçirgenliği akut değişiklikler üzerinde duruldu, ama daha yeni araştırmalar bir başlangıç ​​perfüzyon ^12,16 sonra bireysel damarlarda ölçümler 24-72 saat genişletilmiştir. Bu iletişimde açıklanan yöntemleri etkinleştirmeniz gerekir vasküler geçirgenlik yönetmelik ¹⁷ eğitim için daha genetiği değiştirilmiş fare modelleri kullanılabilir hale getirmek için söz yeni geliştirilen CRISPR teknolojisi, bu yeni ve önemli sıçan modellerinde mezenterin venüler mikrodamarlar uygulanacak.

Yöntem perfüze gemiye yakın ve geminin bir perfüzyon mikropipet hizalamak için pozisyon microtools için kullanılan hayvan hazırlama ve en az üç mikromanipülatörler hem alacak kadar büyük bir özel inşa mikroskop aşaması ile donatılmış bir inverted mikroskop gerektirirlümen. Örneğin, bir xy mikroskop sahnede (yaklaşık 90 × 60 cm) için özel bir platform pas geçirmez kaplama ile 1 cm kalınlığında çelik levha imal edilebilir. Sahne, bir mühendislik dizin tablosunun veya yatay düzlemde hareket için Teflon sütunlar ya da Bilya üzerinde dik açılarda monte edilir ve desteklenen iki kırlangıç ​​kuyruğu slaytlar takılır. Tipik bir teçhizat (Şekil 2), vasküler düz tek damar kan akışını ve hematokrit, kan perfüze mikrodamarlar yerel oksijen teslimat, yönetmelik ölçmek için böyle olanlar gibi intravital mikrodolaşım deneyler bir dizi için kullanılan mikroskop ve micropositioning ekipmanları ile ortak çok şey var kas tonu, ve bütün dolaşıma enjekte floresan izleyiciler yerel mikrovasküler birikimi. ^18-26

Tekniğin temel yönü mikrodamar duvarının belirlenmiş bir yüzey alanı (S) boyunca hacimsel akış (J _v) ölçülmesidir. BaşarmakBu, burada açıklanan modifiye Landis tekniği ile basit bir ters mikroskop yeterlidir. Küçük bir video kamera ilave bir zaman baz ile, bir video monitöründe gösterildi ve bir bilgisayara bir dijital formda veya bir video kayıt cihazı üzerinde dijital veya analog bir sinyal olarak kaydedilebilirler, görüntü portu ve video sinyali üzerine monte edilir. Mikrodamar kanüle sonra kamera görülebilir mikro damarın kısmı kanülasyonu bozmadan bir birim olarak sahne ve manipülatörler taşıyarak değiştirilebilir.

Transvasküler akımlarının ölçümü ^aynı zamanda, çözünmüş madde geçirgenliği, sitoplazmik kalsiyum ya da diğer hücresel mekanizmaları ve konfokal görüntüleme ^6,12,13 floresan oranı izleme ölçümleri için kullanılan donanımları olarak uygun filtreler ile gelişmiş bir floresans mikroskobu kullanılarak daha ayrıntılı inceleme ile birleştirilebilir ^27. Tüm Şekilde, mikro yaklaşımların önemli bir avantajı, aynı gemide tekrarlanan tedbirleri yapabilme yeteneği olduğunuGibi hidrostatik ve onkotik basınçları, ya da iltihabi durumların damar yanıtlarında kaynaklı değişim olarak itici güç kontrollü değişim altında. En yaygın tasarım, ikinci bir pipet ile, daha sonra bir taban çizgisi geçirgenliği durumunu tesis eden ilk bir kontrol perfüzat ve eritrosit süspansiyonu ile doldurulmuş bir mikropipet ile perfüze gemi ile aynı kap üzerinde ölçülen hidrolik iletkenliği (L _p), bir çift karşılaştırmasıdır Test maddesi ile perfüzat ilave edildi. Birden kanülasyonlar kontrol pipet ile reperfüzyon sonra tekrar çevrimi ile mümkündür.

Bu protokol, mikrodamar duvarı boyunca su akıları kayıt ve damar duvarının L _p, sağlam boyunca su ve çözünen maddelerin ortak yolunun geçirgenliği yararlı bir kırılma indeksinin ölçülmesi için sıçan mezenter bir venüler kabın kanül ve Şekilde, mikro göstermektedir endotel bariyer. Prosedür modifiye Landis techniq adlandırılırue, çünkü ²⁸ korunur bloke perfüzyona başlanmasından transvasküler sıvı alışverişi bir ölçüsü olarak, kırmızı hücrelerin göreceli hareketlerini kullanarak orijinal Landis prensibi ancak deneysel koşullar aralığı (örneğin, mikro-damar duvarı boyunca hidrostatik albumin onkotik basınç farkları) Şekilde, mikro sonra kullanılabilir uncannulated kan perfüze mikrodamarlar ^8,29 oranla çok daha fazladır.

Protokol

Etik Beyanı: Tüm prosedürler gözden geçirilecek ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Mikropipetler, kısıtlayıcılara ve Bloke 1. Ön Fabrikasyon

1. Çekildiğinde, tüpün uzatılmış kısmı yaklaşık 1 cm uzunluğunda ve iki yarısı biraz simetrik olmasıdır, böylece düzeltilmiş bir elektronik çektirmenin kullanarak yarısında birkaç temiz borosilikat cam kapiller tüpler çekin. . Konik Şekil 1'de boyutları ile uyumlu olduğundan emin olun mikropipetler, kısıtlayıcılara ve blokerler için iki yarısı kullanın.
   1. Konik suyla yıkanıyor 0,5 mikron zımpara kağıdı ile hava tahrikli taşlama ³⁰ ile mikropipetler. Yatay yaklaşık 30 derece olacak şekilde mikropipet tutucu açısını ayarlayın.
   2. İyice yıkayın ve bahşiş yoluyla ve şaft temizlemek aseton çekmek için emme kullanarak mikropipetler kurutun. (Mikropipetler inceleyinBir timsah klip mikropipet tutucu ve bir mercek dürbün ağı ile donatılmış 4 × 40 × hedefleri ile küçük bir dik mikroskop kullanılarak Şekil 1A).
   3. Kimin uzunluk / genişlik oranı 3.1 ila 3.5 ve mezenterinde sert kollajen lifleri nüfuz yardımcı olan bir keskin konik noktası olan bir eğim ile yaklaşık 50 mikron uzunluğunda ucu açılması ile seçin mikropipetler.
   4. Tozsuz bir kutuda hafifçe farklı boyutlarda 15-20 mikropipetler saklayın.
2. Adım 1.1 hazırlanan çekti kılcal tüpler) kullanarak kısıtlayıcılara olun. Kör bir uç (Şekil 1B) oluşturulması için bir microflame yakın kısa çekilmiş bir cam kılcal tüp tutun. Tozsuz bir kutuya birkaç saklayın.
3. Adım 1.1 hazırlanan çekti kılcal tüpler) kullanarak microoccluders olun. Eğmek hafifçe microflame altında çekti kılcal tüp tutun ve (bir boru adaptörü, örneğin kullanarak., 23G) ince uçlu (ucundan yaklaşık 4 mm) miline 120 dereceye yakın bir açı yapmak ( Şekil 1C). Marka ve çeşitli saklayın.

2. Hayvan Hazırlama ve Cerrahisi

1. Pentobarbital sodyumla erkek (350-450 g) ya da dişi Sprague-Dawley sıçanları (200-300 g) anestezisi (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) deri altı enjeksiyon yoluyla; intraperitoneal kullanarak değil mezenterin korur.
2. Cerrahi prosedürler ve deney protokolleri boyunca, gerektiği gibi ilave enjeksiyonlar (30 mg / kg) ile anesteziye devam ediniz. Ayak tutam veya kornea refleksi ile anestezi derinliği belirler. Deney prosedürünün tamamlanmasından sonra, pentobarbital dozda ya da anestezi altında, doymuş potasyum klorid intrakardiyak enjeksiyonu ile sıçan euthanize.

3. Akış Markers olarak kullanılmak üzere Çözümleri ve eritrositler hazırlayın

1. Superfusate ve kontrol perfüzyon çözeltisi (tipik olarak memeli 10 mg içeren Ringer çözeltisi / ml yağ asidi için memeli Ringer çözeltisi hazırlayıniçermeyen sığır serum albumini, BSA).
   1. 0.2 mikron şırınga filtreler aracılığıyla filtre Perfüzat mikropipet ucu engelleyebilir minik parçacıkları çıkarmak için; küçük, temiz bir kap içine süzün.
2. 0,05 ml heparin (1000 U / ml) ihtiva eden küçük bir şırınga, bir 20G iğne içine anestezi uygulanmış sıçan kuyruk damarından 0.2 ml kan alınarak eritrositleri hazırlayın ve yaklaşık 14 ml, memeli Ringer çözeltisi ihtiva eden bir çözelti, 15 ml bir santrifüj tüpüne transfer .
   1. Santrifüj yavaşça (7 dakika boyunca maksimum 200 × g) hakkında kırmızı hücrelerin paketi. Süpernatant çizin ve Ringer çözeltisi içinde kırmızı hücrelerin yeniden askıya.
   2. Santrifüj ve çıkarılmasından sonra süpernatan üç kez daha sonra kullanılmak üzere, tüpün alt paketlenmiş kırmızı hücreleri bırakın. Bu işlem normal seviyelerde ³¹ daha az,% 0.1 son Perfüzatlar trombositleri azaltır unutmayın.

4. Animal üzerine Doku YerleştirTepsi

1. Kılıç şeklinde sürecine göbek altından anestezi sıçan karın Tıraş. Saç de doku dışarı superfusate çekmek için bir fitil teşkil etmeyecek şekilde traş alanı (sağ tarafına yerleştirilmiş sıçan) sağ tarafında etrafında uzanır emin olun. Bir ıslatılmış gazlı bezle veya mendille kesilmiş tüyleri temizleyin.
   1. Künt bir dişli forseps ile cildi tutun ve sağlam bir makas kullanarak deri yoluyla bir merkez-line kesi (2-3 cm uzunluğunda) yapmak. Para cezası Kullanma (iris) makas gut zarar görmesini önlemek için tırtıklı forseps ile karın duvarı kaldırarak, linea alba boyunca benzer bir kesi yapmak.
   2. Hayvan tepside yan hayvan ile hafifçe Ringer solüsyonu ve künt dişli forseps batırılmış pamuk uçlu aplikatörler (ahşap sopa) kullanarak karın boşluğundan bağırsak çekin. Mezenter mezenter dokunmamak için özen mikroskop aracılığıyla (Pote görüntülemek için ayağı üzerinde bol dökümlü böylece iyi dokuda gut düzenleyinntially forseps veya pamuk ya da birlikte) mikrodamarlar zarar.
      Not: Hayvan tepsisi (Şekil 2A) Pleksiglas inşa ve optik berrak ayağı, (yaklaşık 3 mm derinliğinde) (örneğin cilalı bir kuvars yaklaşık 2 cm'lik dia ve 5 mm yüksek.) Iyi bir ısınma pad bir doku gerektirir Hayvanın sıcaklığı muhafaza edecek şekilde ayarlanır. Ayağı kalınlığı hedefi çalışma mesafesi aşmamalıdır.
2. Mezenter göz mercekleri ile görünür böylece mikroskop sahnede hayvan tepsisini yerleştirin.
3. Sürekli 35-37 ° C de muhafaza memeli Ringer solüsyonu ile mezenter superfuse yerçekimi beslemeli damla hattı yerleştirin. Yerinde gut tutun nemi korumak yardımcı ve yüzeyden fazla Ringer çözeltisi fitil gazlı bez kullanın. Akışını ayarlamak ve tutarlı bir superfusate kalınlığı korumak için atık aspire.
4. Olan hedef venüler mikrodamarlar belirlenmesiyakınsak akışı, gerçek kılcal uzak bir ya da iki şube aşağı dallanmamış kesimleri. Dallanmamış gemiyi bul (ideal, uzunluğu 600 ila 1,000 mikron) tempolu kan akımını ve damar duvarına yapışmasını beyaz hücrelerin serbest olması.
5. Mikroskop alanının merkezinde test mikrodamar yerleştirin ve seçilen kanulasyon yakın pozisyona koruyucularını taşıyın.

5. Yuvaya Mikropipet ve Dağı Dolgu

1. Sadece kanüle önce, perfüzat kırmızı hücrelerin askıya. Temiz bir borosilikat test tüpünde 0.5 ml perfüzat için eritrosit 7 ul ekleyin. Not:% 1-3 miktarda hematokrite, kullanılabilir, fakat tutarlı hematokrit kırmızı hücrelerden salınan bir maddelerin tutarlı bir perfüzat konsantrasyonlarına neden olur.
2. Bir 23G tüp adaptörü ve PE 50 boru (5-15 cm uzunluğunda) ile 1 ml şırınga takın. Şırıngaya perfüzat / kırmızı hücre karışımı çizin. Karıştırın ve tüp tüm kabarcıklar sınırdışı şırınga ters çevirin veadaptörü. Ve deney başlamadan önce birkaç şırınga verimlilik artışı, uygun boru için tozsuz kutu veya plastik torba içinde saklayın.
3. O konik bölgeyi dayandığı kadar mikropipet büyük ucunu boru ilerleterek mikropipet doldurun. Mikropipet ucu doldurmak için şırınga pistonu hafif bir hızlı itme uygulayın. Not: Bir küçük akarsu veya damlacık tam dolum kanıtlamak için ucunda görünür olmalıdır.
4. Yavaşça pistonu iterek mikropipet milin geniş kısmını doldurmak için ise boru geri çekin. Dikkatlice mikropipet mili hafifçe vurarak geniş şaft küçük kabarcıklarını çıkarın. Not: benzer bir prosedür ³² resmedilmektedir.
5. Bir su manometre sürekli bir sıvı bağlantısı sağlayan bir yan portu ile bir pipet tutucu içine mikropipet yerleştirin. Emin olun mikropipet çok ince ilerlemesini kontrol etmek için kullanılan bir hidrolik sürücü takılı tutucu, hafif bir açıyla olduğunu (15-25 °)yatay mikropipet konik kenar gut veya tepsiyi isabet etmez ki.
6. Test kabına (Şekil 2) yakın uyum sağlamak için x, y ve z sürücüler vardır hareketli bir mikromanipülatör, hidrolik sürücü bağlama.
7. 40 cmH ₂ mezenter üzerinde O'ya manometre su sütunundaki sıvı yüksekliğini değiştirmek için bir şırınga ya da suda dolgulu kauçuk ampul kullanılarak mikropipet sıvıya uygulanan hidrostatik basıncı ayarlar.
8. Pipet doldurduktan sonra en kısa sürede mikrodamar cannulate; Bu yaklaşık 40 dakika sonra çok az kırmızı hücrelerin damar içine akacak, böylece kırmızı hücreler, pipet altına yerleşirler.

6. Microcannulation ve Mikrovasküler Basınç Ölçümü

1. Mikroskop altında doldurulmuş mikropipet yerleştirmeden önce, yumuşak kavrama doku yeterli bir kuvvet uygulamak mikro damarın yakınındaki doku üzerine koruyucularını basın. BeraberlikMezenterik kollajen liflerde gerilmeler gemi ile aynı hizaya gelecek şekilde hafifçe mikrodamarlarda doğrultusunda doku germe, geri süzgeç.
   1. Gemi ile mikropipet hizalayın ve göz mercekleri ile görünüm içine indirin. Seçilen kanulasyon sadece üst ucu yerleştirin ve kısmen geminin içindeki akışını engeller, böylece doku üzerine indirin, ama tıkamaz.
2. Hidrolik sürücüyü kullanarak damar lümenine yavaşça pipet sürerek gemiyi cannulate. Geminin alt tarafında aracılığıyla itmek için dikkatli olun.
   Not: mikropipet lümen girerken, Perfüzat hızla lümen dışında geminin kan yıkar ve perfüzat serbestçe aşağı damarlarda normal kan perfüzyon bazı displacing test mikrodamarlarda hayvanın dolaşım distalinde akar.
3. Belirtildiği gibi (kanda kadar manometre ayarlayarak perfüzyon basıncını düşürmekperfüze segmentine geri çekilir) hayvanın kırmızı hücreleri tarafından; Bu, kırmızı hücrelerin yavaşça damar lümeni salınım mikrodamar segmentinin uzak ucunda hidrostatik mikrodamar basıncı _(P c) ölçen bir denge basıncı belirler. Bu denge basıncının üzerindeki tüm basınçlarında gemi perfüzyon koruyun.

7. Microocclusion ve Veri Toplanması

1. İsteğe bağlı adım: ucu tekrarlanan mikro sırasında deneysel gemi koruyan doku ince ped birikir o ana kadar herhangi bir gemiden mezenterinde olmayan bir kullanım alanına doku bastırın, gemi engellemek için mikro-tıkayıcı kullanmadan önce tıkanıklıklar.
2. Mikroskop alanının alt kenarına yakın perfüze geminin üstünde engelleyici yerleştirin.
3. Video ve ses ile aşağıdaki kaydedilir.
   1. Sözlü blok sitenin konumu ve mercek retikül görüldüğü gibi düşük ekran kenarını kaydedin.
   2. Ucu ilesadece mikro damarın üzerine yerleştirilen bloker, geminin akım tıkalı kadar yavaşça engelleyici düşürmek için mikromanipülatör ince z denetimini kullanın. Ses üzerine manometre basıncı (P _c) unutmayın. 3-10 saniye tipik tıkanıklığı uygulayın ve daha sonra serbest perfüzyon geri, bırakın. , Zamana dayalı 5-10 mikron adımlarla (> bir yerinde ilk bloktan sonra 5 dakika), tıkanıklığı sayısı (3-5) pipet doğru geminin yukarı blok siteyi taşı blok yerinde damar duvarı hasarı önlemek için .

Veri ve L _p Ölçümü 8. Analizi (Su Geçirgenliği)

1. Video oynatımı sırasında, bir sahne mikrometre ve görüntüleri bilinen pozisyonların bir görüntünün kullanımı ile tıkanıklığı sitesine işaretleyici kırmızı hücreden ilk mesafeyi (ℓ ₀₎ belirler. Kaydedilen görüntülerin 3-10 sn boyunca çeşitli çerçevelerde konumundan işaretleyici hücrenin ilk hızı (dℓ / dt) belirleyin. CaydırmakMaden tıkanıklığı (Şekil 3) sırasında çekilen görüntülerden damar yarıçapı (r).
2. Hesapla J _v / S (dℓ / dt) × (1 / ℓ ₀₎ × (r / 2) Her tıkanıklığı için. Sürüş basıncı bölü (J _v / S) olarak sabit basınçta L _p hesaplayın (mikrovasküler basıncı - Etkili kolloid osmotik basınç, Tartışma bakın).

Sonuçlar

Şekil 4, dört Perfüzatlar art arda kanüle mikro damarın venüler bir sıçan L _p değişikliklerin zaman sürecini ölçmek sonuçlarını gösterir. ³³ sabit bir basınçta hesaplanan L _p büyüklüğü mikrodamar duvarı geçirgenliği değişikliklerin bir ölçüsü olarak kullanılmıştır, ilk olarak gemi 10 nM Bk içeren ikinci bir mikropipet kullanılarak enflamatuar ajan bradikinin (Bk) maruz kalmıştır sonra% 1 sığır serum albümini ihtiva eden bir p...

Tartışmalar

Gemi serbestçe perfüze iken transvasküler sıvı hareketi meydana rağmen L _p hesaplamaları Detayları., Böyle bir değişim damar perfüzyon oranının% 0.01'den az, genellikle, çünkü serbest perfüzyon sırasında ölçülecek kadar çok küçük. Perfüzyon geçici mikrodamar, transvasküler akışını kapatılmasıy durdurulur Ancak, (yani, filtrasyon) 'de gösterildiği kısaltır gibi işaretleyici kırmızı hücre ve tıkanma sitenin arasında sıvı sütun olarak l?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon