C-FOSタンパク質免疫組織学的検出：特定の生理反応に関与する中央経路のマーカーとして有用ツール<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt; ex vivoで</em

要約

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

要約

多くの研究は、特定の生理的な規制に関与する脳領域を特定し、マップしようとしています。癌原遺伝子C-FOS、前初期遺伝子は、種々の刺激に応答してニューロンで発現されます。タンパク質生成物は、容易にそれらの活性の変化を表示するニューロンのグループをマップするC-FOSの検出の使用につながる、免疫組織化学的技術を用いて検出することができます。この記事では、低酸素症または高炭酸ガスに換気の適応に関与脳幹ニューロン集団の同定に焦点を当てました。 2つのアプローチが、動物の生体内で関与する神経細胞集団を同定することが記載され、ex vivoでの求心路遮断脳幹準備インチインビボ 、動物は。高炭酸ガスまたは低酸素ガス混合物にさらされたex vivoで 、求心路遮断準備が低酸素や高炭酸ガス人工脳脊髄液で灌流しました。両方の場合において、いずれかの制御インビボ動物またはE でX vivoでの製剤は、正常酸素とnormocapnic条件下で維持しました。これら二つのアプローチの比較は、インビボにおいて 、末梢および/ ​​または中枢ニューロンの活性化、すなわちの起源の決意を可能にし、 エクスビボ 、brainstemsを集め、固定し、切片にスライスしました。切片を調製した後、C-FOSタンパク質の免疫組織化学的検出は、低酸素または高炭酸ガス刺激によって活性化された細胞の脳幹のグループを識別するためになされました。標識された細胞は、脳幹の呼吸器の構造で計数しました。対照条件と比較して、低酸素症または高炭酸ガス血症は、c-FOSの数を増加させ、したがって、中央呼吸ドライブの適応に関与するニューロン経路の構成されているいくつかの特定の脳幹部位で細胞を標識しました。

概要

C-fosの遺伝子は、1980 ^1,2の初めに初めて同定し、その産物は、遺伝子活性化剤の特性^3,4を有する核タンパク質として1984年に特徴づけられました。これは、ニューロンの刺激に関連した長期的なメカニズムに参加しています。実際に、ニューロンの活性の変化は、転写因子のc-FOSの産生を誘導する前初期遺伝子c-FOSの発現を誘導する二次メッセンジャーシグナル伝達カスケードにつながります。後者は、後期遺伝子の発現を開始し、したがって、刺激⁴多くの異なる種類の神経系の適応応答に関与しています。したがって、1980 ^5,6の端部から、C-FOSタンパク質の検出は、しばしば、ニューロン経路をマッピングするための一般的な⁴および中枢神経系（CNS）の活性に遺伝子転写の外因性因子の効果を研究するために使用されています異なる生理学的に関与アル条件。

基底のc-fosの発現は、マウス、ラット、ネコ、サル、およびヒトの⁴を含む様々な種において研究されています。これにより、その発現の動態は比較的よく知られています。転写活性化は、（5〜20分^）7,8迅速であり、かつmRNA蓄積を刺激⁹の発症後30〜45分の間で最大に達し、12分の短い半減期で低下します。 C-FOSタンパク質合成は、mRNAの蓄積に続く、20〜90分後に刺激⁶で免疫組織化学によって検出することができました。

c-fosの発現の分析は、古典的低酸素症または高炭酸ガス^10-14への換気応答に関与する中心的な呼吸ネットワークを識別するために、in vivo試験で使用されています。最近では、このツールはまた、低酸素症またはhに中央呼吸ネットワーク適応を探索するためにex vivoで脳幹の製剤で使用されましたypercapnia ^15-18。確かに、これらの製剤は、古典的に中央呼吸ドライブ¹⁹に同化リズミカルな活動を生成します。従って、製剤のこのタイプは、完全に求心路遮断であるという利点を有し、従って、C-fosの発現についての結果は、周辺構造の介入なしに、中央の刺激の結果を反映します。

C-FOSの検出は、免疫組織化学的または免疫組織蛍光アプローチによって行うことができます。間接的な免疫は、c-FOSに対する一次抗体と一次抗体が産生された種に対して指向二次抗体の使用を必要とします。免疫組織化学法のために、二次抗体は、基質（ペルオキシダーゼH ₂ O _2）に作用する酵素（例えばペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされています。酵素反応の生成物は、色原体（3.3ジアミノベンジジンtetrahydrochloridによって開発されていますE）、それを染色し、光学顕微鏡下で観察することができます。反応は、ニッケル硫酸アンモニウムを用いて強化することができます。これらの方法は、異なる生理学的な課題中の活性物質の神経細胞の検出、したがって、同定および/または連続した生理的応答に関与末梢および中枢経路のマッピングを可能にします。

プロトコル

注：C-FOSの検出は、いくつかのステップ（ 図1）を含む標準化された手順です。全ての実験は、ラットまたはマウスで行いました。実験プロトコルは、動物実験チャールズ・ダーウィン（CE5 / 2011/05）に倫理委員会によって承認された動物のケアのために9月22日の欧州共同体理事会、2010（63分の2010 / EU）に基づいて行われ、に従って行いました動物のケアのためのフランスの法律に。

ソリューションの調製

1. 0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液を準備します。攪拌しながら、6.24グラムののNaH ₂ PO _{4・2H 2} Oおよび22.56グラムのNa ₂ HPO ₄ *のH ₂ Oを1リットルの蒸留水を追加します。
2. 4％パラホルムアルデヒド（PFA）を準備します。蒸留水150ミリリットルにPFAの20グラムを追加します。攪拌しながら80℃に溶液を加熱します。解決策をクリアするには、熱を削減し、パラホルムアルデヒドが溶解を助けるために1 NのNaOHの1または2滴を追加します。 250ミリリットルへの完全な蒸留水で0.2 Mリン酸バッファー（pH 7.4）250 mlで加えます。 4℃で保存。これらの試薬を使用する際に適切な注意を払ってください。化学ボンネットの下に手袋、白衣、および安全ゴーグルで取り扱ってください。
   注：灌流前日に4％PFAを準備します。年齢、数や動物の種の関数として、4％PFAの体積を決定します。
3. 凍結保護溶液を調製する：0.2 Mリン酸緩衝生理食塩水250ml中で、ポリビニルピロリドンを5g、スクロース150gの塩化ナトリウム2.5gを混合します。完全に溶解した後、エチレングリコールの150ミリリットルを追加し、蒸留水で500ミリリットルに調整します。 4℃で凍結保護ソリューションを保存してください。
4. 0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。攪拌しながら1 Lの蒸留水にNaClを18グラムを追加します。完全に溶解した後、リン酸ナトリウム緩衝液1Lの0.2 Mを加えます。
5. 0.3％トリトンX100を補ったリン酸緩衝生理食塩水（PBST）を準備：トリトンX10の3ミリリットルを追加します。PBSの997ミリリットルに0。
6. 0.05 Mトリス緩衝液（pH 7.6）を準備します。攪拌しながら蒸留水500ミリリットルにトリス - 塩酸塩の3.03グラムおよび0.70グラムトリスベースを追加します。
7. 一方のプレートのために、溶液30mlを準備しますPBST中の2％ヤギ血清を準備します。 30ミリリットルPBSTにヤギ血清の600μLを加え、よく混ぜます。ウェル当たり2.5ミリリットルを追加します。
   注意：使用する血清を二次抗体産生のために使用される種から来なければなりません
8. ウシ血清アルブミン（0.25％）とのPBST中：（4000、SC-52 1）のc-FOSタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体を準備します。一方のプレートのために、溶液30mlを準備します。 30ミリリットルPBSTにウシ血清アルブミン75mgのを加え、よく混ぜます。そして、C-FOSタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体の7.5μlを添加します。
9. 血清アルブミン、ウシ（0.25％）でPBST中：ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（1：500）を準備します。一方のプレートのために、溶液30mlを準備します。 30ミリリットルPBSTにウシ血清アルブミン75mgのを加え、よく混ぜます。その後、追加ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体60μlの。
10. 準備アビジン - ビオチン - ペルオキシダーゼ（1：250）複雑なPBST（ABC溶液）インチ一方のプレートのために、溶液30mlを準備します。 30ミリリットルPBSTに試薬A120μlの試薬Bの120μLを加え、よく混ぜます。
    注：ABC溶液は、使用前に少なくとも30分を準備する必要があります。
11. 基質溶液を準備します。使用直前に、（1プレート用）、次のように溶液を調製：硫酸ニッケルアンモニウム20mgの、50mlのトリス緩衝液に3.3ジアミノベンジジン四塩酸塩10mgを追加します。フィルタ、光から保護します。ウェル当たり2.0ミリリットルを追加します。残りの溶液（26 mL）中のHの17μlの₂ O _{2（H 2} O ₂溶液をH ₂ O中30％）を加えます。ウェル当たり2.0ミリリットルを追加します。
    注：これらの試薬を使用する際は、適切な注意が必要です。手袋と白衣で取り扱ってください。

2. のc-fosの寄り付きインビボでの ctionと組織処理

注意：実験は、ラット（スプラーグドーリー）またはマウス（C57BL / 6）で行いました。

1. 低酸素（O ₂ 8％のバランスのとれたN _2）または2時間（ 図2A）のための高炭酸ガス（CO ₂ 4％、O ₂ 21％バランスのとれたN _2）ガスの混合物で換気気密ボックスに動物を配置します。
2. ペントバルビタール（100mg / kg）の腹腔内注射で動物をAnaesthetize。 4％PFA ²⁰で経動物を灌流。注意して処理し、化学フードの下で手袋を使用しています。
3. 灌流後、脳^20を解剖し、4℃で48時間、15ミリリットルチューブに4％PFAの7ミリリットルでそれを浸します。その後、PFAから脳を除去し、凍結保護溶液中に完全に浸します。 -18℃（ 図3）で保存。適切な廃棄物処理PAによって、動物の体の残りの部分を処分thway。
   注：凍結保護は、PFA固定と凍結の間の段差です。これは、凍結アモルファス形態であろう溶液と細胞内の氷の結晶の形成を減少させます。固定したサンプルは、4℃で少なくとも24時間（ステップ1.3で調製した）凍結保護溶液に含浸されている必要があります。化学フードの下ケアと手袋をして取り扱ってください。

3. C-fosの誘導および組織処理エクスビボ

注：実験のみ新生ラットまたはマウスで行いました。

1. 鈴江¹⁹で説明したようにCNSを分離します。記録チャンバーにそれを置き、26℃で^21（aCSFので7.5ミリリットル/分の速度で人工脳脊髄液で連続的にそれを表面かん流する：mMの中で：130.0のNaCl、5.4のKCl、0.8のCaCl _2、1.0のMgCl _2、26.0 NaHCO _3、30.0 D-グルコース、O ₂で飽和させ、95％O ₂と5とのガス発生によりpH7.4に調整％CO _2）（ 図2B）。
2. 95％のO ₂とを通気低酸素症または10.0 mmまで減少NaHCO ₃で酸性化にaCSF（標準aCSFのことで脱酸素化にaCSF（95％N ₂及び5％CO _2、pH7.4で泡立て同じ組成）、とaCSFのを交換してください高炭酸ガス血症、5％CO _2）。 30分（ 図2B）のための刺激を適用します。
3. ex vivoでは 、誘導期間の後に、後で使用する（ 図3）のための凍結保護溶液に-18℃で48時間、店舗、2.5 mlチューブに2.5ミリリットルの4％PFAで新生児マウスまたはラットのCNS ​​を移します。
   注：ex vivoで 、動物を灌流する必要はありません。以前の研究は、直径10mm未満の測定小さな試料を単純拡散²²によって固定され得ることを示唆しています。アルデヒドのための浸透の引用された率（組織への固定液拡散のためのミリメートルでの距離は、）2または3ミリメートル/ hrです。

4.脳​​幹セクショニング

注：このステップから最後まで、プロトコルは、厳密にin vivoでおよびex vivoで誘導についても同様です。

1. スライスする前に、一人の個人が、12ウェルプレートに挿入し、各ウェルにPBSの2.5ミリリットルを追加配置します。
2. クライオスタットと脳幹の連続冠状切片（40μm）を作成し、12ウェルプレート中でそれらを収集。全体の成人脳幹の場合、約70スライス（ 図3）を作ります。
   注：それは一枚の板に並行していくつかの動物からセクション組織化することが可能です。

5.免疫組織学的手順（表1）

注：手順では、セクションでは、ウェルインサートに残っています。

1. 1日目-内因性ペルオキシダーゼ活性の破壊、非特異的結合部位を遮断し、一次抗体とのインキュベーション（図4）
   1. ウォッシュRTで0.1 M PBSで10分間、切片（ウェル当たり2.5 ml）で。 3回繰り返します。
   2. 、過酸化水素H ₂ O ₂で室温にて30分間の冠状切片をインキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制し、0.1M PBS（ウェル当たり2.5 mL）中の3％。
   3. RTで0.1 M PBS（ウェル当たり2.5 ml）で10分間のセクションを洗ってください。 3回繰り返します。
   4. PBST中のヤギ血清（2％）を用いて室温で1時間の冠状切片をインキュベートすることによって非特異的結合部位をブロックします。
   5. ウシ血清アルブミン（0.25％）（ウェル当たり2.5 ml）をPBSTで（4000、SC-52、1）C-FOSタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体と共に4℃で48時間の冠状切片をインキュベートします。
2. 3日目-二次抗体と呈色反応の開発とのインキュベーション（図4）
   1. 室温でPBS 0.1 M（ウェル当たり2.5ミリリットル）で10分間のセクションを洗ってください。 3回繰り返します。
   2. インキュベートウシ血清アルブミン（0.25％）（ウェル当たり2.5 ml）でPBST中：ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（1：500）とともに室温で1時間冠状断面。
      注：研究者はまた、この段階で蛍光プローブに結合された二次抗体を使用することができます。この場合には、この段階でプロトコルを停止し、蛍光顕微鏡を用いて直接調べます。
   3. RT（ウェル当たり2.5ミリリットル）でPBSTで10分間のセクションを洗ってください。 3回繰り返します。
   4. で1時間の冠状切片をインキュベートし、アビジン - ビオチン - ペルオキシダーゼ（1：250）錯体（ウェル当たり2.5ミリリットル）PBSTインチ
   5. RT（ウェル当たり2.5ミリリットル）でPBSTで10分間のセクションを洗ってください。 2回繰り返します。
   6. RTで0.05 Mトリスバッファー（ウェル当たり2.5ミリリットル）で10分間のセクションを洗ってください。 2回繰り返します。
   7. 0.05 Mトリス緩衝液中の0.02％3.3ジアミノベンジジン四塩酸塩、0.04％ニッケル硫酸アンモニウムおよび0.01％の過酸化水素で冠状切片をインキュベートし（pHは7.6）AトンRT（ウェル当たり2.0ミリリットル）。残りの溶液（25mL）に加える17μlのH ₂ O _{2（H 2} O ₂溶液をH ₂ O中30％）（ウェル当たり2.0ml）を加えました。
      注：研究者は、光学顕微鏡下で開発時間を決定する必要があります。しかし、5〜10分が良い染色強度を提供します。
   8. 染色強度（光学顕微鏡の下で制御され、 図5及び図6を参照）が最適であるときに、室温で0.1MのPBS（ウェル当たり2.5 ml）で10分間、切片を洗浄することにより反応を停止させます。 4回繰り返します。その後、蒸留水で切片を洗浄します。
3. サンプリング取付（化学フードの下ケアと手袋とハンドル）
   1. シリアルにスライドし、空気乾燥した上でマウントセクション。このために、慎重にスライド上のブラシで吻側 - 尾側の順序でセクションを広げました。明らかに、サンプルに応じてスライドにラベルを付けます。
   2. 絶対アルで脱水cohol：無水アルコール浴中に室温で30秒間スライドを浸します。二回繰り返します。
   3. キシレンでクリア：RTで3分間、キシレン浴にスライドを浸します。二回繰り返します。
   4. マウンティング媒体とスライドをカバースリップ。このため、スライド上に封入剤の5滴を適用し、気泡を駆動することにより、カバーガラスを適用します。空気乾燥48時間。

6.データと統計解析

1. 光学顕微鏡下でセクションを調べます。視覚的に標準的なランドマーク^23,24を用いて^、高倍率（200倍）でFLIニューロンを数えます。 c-Fosの点状の染色は、神経細胞の核内に局在しています。
2. 各分析領域について、セクションごとのc-FOS陽性細胞の数をカウントし、コントロールと条件を刺激間の平均数を比較。データの正規性に応じて、 対応のないスチューデントt検定またはマンホイットニー検定を使用します。差はPであれば有意とみなしました0; 0.05。描画チューブ顕微鏡に取り付けられ、デジタルカメラで撮影した（ 図5）を使用して描画する（倍率100倍）へFLIニューロンの分布をプロットします。

結果

c-FOSの検出は、 生体内 （ 図2A） における低酸素および高炭酸ガス血症として、またはこれらの条件のex vivo（ 図2B）を模倣する状況では、特定の条件下で活性化された細胞の識別グループを可能にする便利なツールです。 インビボ 、新生児、若いです、または成人の齧歯類は、ガス環境が継続的に正確に30〜180分<...

ディスカッション

C-FOSの前初期遺伝子であり、その生成物の検出は、C-FOSタンパク質は、古典的なインビボ ^11,13,25,28 内の特定の呼吸応答に関与する神経細胞集団を同定するために使用され、 エクスビボで ^{16-18、 27,32,33。}

議定書の中で重要なステップ

灌流工程​​の間には注意してください。 4％PF...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture plate 12-well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153