JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Аннотация

Многие исследования пытаются определить и сопоставить участки мозга, связанные с конкретными физиологическими нормами. Протоонкоген с-ФОС, немедленно раннего гена, выражается в нейронах в ответ на различные стимулы. Белковый продукт можно легко обнаружить с иммуногистохимических методов, приводящих к использованию обнаружения C-FOS к карте группы нейронов, которые отображают изменения в их активности. В этой статье мы сосредоточились на выявлении популяций нейронов ствола головного мозга, участвующих в респираторной адаптации к гипоксии или гиперкапнии. Два подхода были описаны для идентификации вовлеченных популяции нейронов в естественных условиях у животных и ех в естественных условиях деафферентированной препаратов ствола головного мозга. В естественных условиях, животных подвергали гиперкапнических или гипоксических газовых смесей. Ex естественных условиях, деафферентированной препараты были орошали гипоксических или гиперкапнической искусственной спинномозговой жидкости. В обоих случаях, либо контроль в естественных условиях животных или ех естественных условиях препараты содержали в нормоксических и normocapnic условиях. Сравнение этих двух подходов позволяет определить происхождение нейронов , т.е. активации, периферической и / или центральной. В естественных условиях и бывших естественных условиях, brainstems были собраны, фиксированные, и нарезанные на отрезки. После того, как участки были подготовлены, иммуногистохимическое определение белка C-FOS было сделано для того, чтобы идентифицировать стволе мозга группы клеток, активированных гипоксических или гиперкапнических раздражений. Меченые клетки подсчитывали в стволовых дыхательных структур. По сравнению с контрольной группы, гипоксии или гиперкапнии увеличилось количество с-FOS меченых клеток в нескольких конкретных участков ствола головного мозга, которые, таким образом, конститутивный нейрональных путей, участвующих в процессе адаптации центрального дыхательного привода.

Введение

C- ФОС ген был идентифицирован впервые в начале 1980 - 1,2 и его продукт был охарактеризован в 1984 году как ядерный белок , имеющий ген-активатор свойства 3,4. Она участвует в долгосрочных механизмов, связанных с нейрон стимуляции. Действительно, изменения в активности нейронов приводит к вторичным мессенджером сигнальных каскадов , которые индуцируют экспрессию непосредственных ранних генов с-FOS, который индуцирует выработку фактора транскрипции с-FOS. Последнее инициирует экспрессию поздних генов и , таким образом , участвует в адаптивных реакций нервной системы ко многим различным типам раздражителей 4. Таким образом, с конца 1980 г. 5,6, обнаружение белка с-ФОС был часто используется для изучения влияния экзогенных факторов на транскрипции генов в общем 4 и на деятельности центральной нервной системы (ЦНС) для картирования из нейронных путей участвует в различных физиологическихAl условия.

Базальный C-FOS выражение было изучено у различных видов , включая мышей, крыс, кошки, обезьяны и человека 4. Таким образом, кинетика его экспрессии относительно хорошо известны. Активация транскрипции происходит быстро ( от 5 до 20 мин) 7,8, а накопление мРНК достигает максимума от 30 до 45 мин после начала стимуляции 9 и уменьшается с коротким периодом полураспада 12 мин. Синтез белка с-ФОС следующим образом накопление мРНК и может быть обнаружен с помощью иммуногистохимии при 20 до 90 мин после стимуляции 6.

Анализ с-FOS выражение классически используется в исследованиях в естественных условиях для определения центральной дыхательной сети , участвующих в вентиляторной реакции на гипоксии или гиперкапнии 10-14. Совсем недавно, этот инструмент был также использован в естественных условиях ех препаратов для изучения стволовых центральных органов дыхания сети адаптации к гипоксии или чypercapnia 15-18. В самом деле, эти препараты генерировать ритмическую активность классически приравнено к центральной респираторной привода 19. Таким образом, этот тип препарата имеет преимущество , так как полностью деафферентированной, и , следовательно, результаты в отношении с-FOS выражение лишь отражают последствия центральной стимуляции без какого - либо вмешательства периферических структур.

Обнаружение с-ФОС могут быть сделаны иммуногистохимических или immunohistofluorescence подходов. Косвенное иммунологического делает необходимым использование первичного антитела против с-FOS и вторичным антителом, направленным против этого вида, в котором производилось первичное антитело. Для иммуногистохимического метода, вторичное антитело , конъюгированное с ферментом (пероксидазой, например) , который действует на подложке (H 2 O 2 для пероксидазы). Продукт ферментативной реакции разработан хромоген (3,3-диаминобензидина tetrahydrochloridд), которая окрашивает его и можно наблюдать при световой микроскопии. Реакция может быть усилена с помощью сульфата никеля аммония. Эти методы позволяют обнаруживать активных веществ нейронов при различных физиологических проблем, и, следовательно, идентификации и / или отображение периферических и центральных путей, участвующих в последовательных физиологических реакций.

протокол

Примечание: обнаружение C-FOS представляет собой стандартизированную процедуру с участием нескольких этапов (рисунок 1). Все эксперименты проводились на крысах или мышах. Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по этике в животных Эксперимент Чарльза Дарвина (CE5 / 2011/05), осуществляется в соответствии с директивой Европейского сообщества Совета от 22 сентября 2010 года (2010/63 / ЕС) для ухода за животными, и проводится в соответствии с французским законодательством для ухода за животными.

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте 0,2 М натрий фосфатный буфер: добавить 6,24 г NaH 2 PO 4 * 2H 2 O и 22,56 г Na 2 HPO 4 * H 2 O до 1 л дистиллированной воды при перемешивании.
  2. Готовят 4% параформальдегида (PFA): добавить 20 г PFA 150 мл дистиллированной воды. Раствор нагревают до 80 ° С при перемешивании. Для очистки раствора, уменьшить огонь и добавить 1 или 2 капли 1 N NaOH, чтобы помочь параформальдегид растворения. Полный до 250 млдистиллированной воды и добавляют 250 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7,4). Хранить при температуре 4 ° С. Возьмите необходимую осторожность при использовании этих реагентов. Ручка с перчатки, лабораторный халат и защитные очки под химическим капотом.
    Примечание: Подготовить 4% PFA в день до перфузии. Определить объем 4% PFA в зависимости от возраста, количества и видов животных.
  3. Готовят раствор криозащитный: в 250 мл 0,2 М фосфатно-солевом буферном растворе, смешивают 5 г поливинилпирролидона, 150 г сахарозы и 2,5 г хлорида натрия. После полного растворения, добавляют 150 мл этиленгликоля и регулировать до 500 мл дистиллированной водой. Хранить криозащитный раствор при температуре 4 ° С.
  4. Готовят 0,1 М фосфатно-солевого буфера (PBS): добавить 18 г NaCl в 1 л дистиллированной воды при перемешивании. После полного растворения, добавляют 1 л 0,2 М буферного раствора фосфата натри.
  5. Готовят фосфатно-солевом буферном, дополненной 0,3% Тритон Х100 (PBST): Добавить 3 мл Тритона Х10От 0 до 997 мл PBS.
  6. Приготовьте 0,05 М Трис-буфера (рН 7,6): добавить 3,03 г трис-гидрохлорида и 0,70 г Трис-основание до 500 мл дистиллированной воды при перемешивании.
  7. Приготовьте 2% сыворотки козьего в PBST: для одной пластины, готовят 30 мл раствора. Добавьте 600 мкл козьего сыворотки до 30 мл PBST и хорошо перемешать. Добавить 2,5 мл на лунку.
    Примечание: сыворотка используется должна исходить из видов, используемых для производства вторичного антитела
  8. Подготовьте кроличьи поликлональные антитела против белка C-FOS (1: 4000, SC-52) в PBST с бычьим сывороточным альбумином (0,25%). Для одной пластины, приготовить 30 мл раствора. Добавить 75 мг бычьего сывороточного альбумина в 30 мл PBST и хорошо перемешать. Затем добавляют 7,5 мкл кроличьих поликлональных антител против белка С-FOS.
  9. Подготовка биотинилированным козьим антителом против кроличьего антитела (1: 500) в PBST с сывороточным бычьего альбумина (0,25%). Для одной пластины, приготовить 30 мл раствора. Добавить 75 мг бычьего сывороточного альбумина в 30 мл PBST и хорошо перемешать. Затем добавьте60 мкл биотинилированного козьего антитела против кролика.
  10. Готовят авидинбиотиновом-пероксидаза комплекс (1: 250) в PBST (раствор ABC). Для одной пластины, приготовить 30 мл раствора. Добавьте 120 мкл реагента А и 120 мкл реагента В до 30 мл PBST и хорошо перемешать.
    Примечание: ABC раствор должен быть подготовлен по меньшей мере за 30 мин до использования.
  11. Приготовьте раствор субстрата. Непосредственно перед использованием готовят раствор следующим образом (на одной пластине): добавить 20 мг сульфата аммония никеля и 10 мг 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорид до 50 мл Трис-буфера. Фильтр и защиты от света. Добавить 2,0 мл на лунку. В оставшемся растворе (25 мл) добавляют 17 мкл H 2 O 2 (H 2 O 2 раствор 30% H 2 O). Добавить 2,0 мл на лунку.
    Примечание: Соответствующий следует соблюдать осторожность при использовании этих реагентов. Ручка с перчатками и халатах.

2. C-FOS Induфикция и обработка ткани In Vivo

Примечание: Опыты проводились на крысах (Sprague Dawley) или мышей (C57BL / 6).

  1. Поместите животных в герметичном ящике вентилируемого с гипоксическим (O 2 8% сбалансированный N 2) или гиперкапнический (CO 2 4%, O 2 21% сбалансированный N 2) газовой смеси в течение 2 ч (рис 2А).
  2. Анестезировать животное с внутрибрюшинного введения фенобарбитала (100 мг / кг). Заливать животное транскардиальную с 4% PFA 20. Обращаться с осторожностью и используйте перчатки под химическим капотом.
  3. После перфузии, рассекать мозг 20 и погружать его в 7 мл 4% PFA в 15 мл пробирку в течение 48 ч при температуре 4 ° С. Затем удалите мозг из PFA и погрузить его полностью в криозащитной растворе. Хранить при температуре -18 ° С (рисунок 3). Избавьтесь от остальной части тела животного с помощью соответствующего мусороперерабатывающий раthway.
    Примечание: криозащиты является шагом между PFA фиксации и замораживания. Это уменьшает образование кристаллов льда в клетках раствором которого замораживание будет в аморфной форме. Фиксированные образцы должны быть пропитаны в криозащитной растворе (полученного на стадии 1.3) в течение не менее 24 ч при температуре 4 ° С. Обращаться с осторожностью и перчатки под химическим капотом.

3. C-FOS индукция и обработка ткани Ex Vivo

Примечание: Эксперименты проводились у новорожденных крыс или мышей только.

  1. Изолировать ЦНС , как описано Suzue 19. Поместите его в записи камеры и переливать его непрерывно с искусственной спинномозговой жидкости со скоростью 7,5 мл / мин при 26 ° C 21 (ACSF: в мм: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl 2, 1,0 MgCl 2, 26.0 NaHCO 3 30,0 D-глюкоза; насыщается O 2 и рН доводили до 7,4 путем газовыделения с 95% O 2 и 5% СО 2) (Фигура 2В).
  2. Заменить ACSF с обескислороженному ACSF ( тот же состав продувают 95% N 2 и 5% СО 2, рН 7,4) для гипоксии , или подкисленным ACSF (стандарт ACSF с NaHCO 3 снижается до 10,0 мМ, продувают 95% O 2 и 5% CO 2) для гиперкапнии. Применить стимуляцию в течение 30 мин (рис 2В).
  3. Ex естественных условиях, после индукционного периода передачи ЦНС новорожденных мышей или крыс в 2,5 мл 4% PFA в 2,5 мл пробирку в течение 48 ч и хранить при температуре -18 ° С в растворе криозащитной для последующего использования (рисунок 3).
    Примечание: Ex естественных условиях, нет необходимости заливать животных. Предыдущее исследование предполагает , что мелкие особи размером менее 10 мм в диаметре может быть исправлена ​​путем простой диффузии 22. Кавычках скорость проходки (расстояние в мм, для закрепляющего диффузии в ткани) альдегида составляет 2 или 3 мм / ч.

4. Секционирование ствола мозга

Примечание: От этого шага до конца, протокол строго одинакова для в естественных условиях и бывших естественных индукций.

  1. Перед нарезка, поместите один человек хорошо вставить в 12-луночного планшета и добавляют 2,5 мл PBS в каждую лунку.
  2. Сделать серийные Коронарные срезы (40 мкм) с ствола мозга криостата и собирать их в 12-луночный планшет. Для всего взрослого мозга, составляют около 70 срезов (рисунок 3).
    Примечание: Можно срез ткани от нескольких животных параллельно в одной пластине.

5. иммуногистохимического процедуры (таблица 1)

Примечание: На протяжении всей процедуры, секции остаются в колодце вставок.

  1. День 1 - Эндогенное разрушение активность пероксидазы, неспецифического связывания блокады сайта, и инкубацию с первичными антителами (рис 4)
    1. мытьсрезы в течение 10 мин 0,1 М PBS при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 3 раза.
    2. Подавить эндогенной активности пероксидазы путем инкубирования Коронарные срезы в течение 30 мин при комнатной температуре с помощью перекиси водорода H 2 O 2, 3% в 0,1 М PBS (2,5 мл на лунку).
    3. Промыть секции в течение 10 мин с 0,1 М PBS при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 3 раза.
    4. Блокировать неспецифическую сайт связывания путем инкубирования Коронарные срезы в течение 1 ч при комнатной температуре с козьей сывороткой (2%) в PBST.
    5. Инкубируйте Коронарные срезы в течение 48 ч при 4 ° С с кроликом поликлональных антител против белка С-FOS (1: 4000, SC-52,) в PBST с бычьим сывороточным альбумином (0,25%) (2,5 мл на лунку).
  2. День 3 - инкубация с вторичным антителом и развитием цветной реакции (рис 4)
    1. Вымойте секций в течение 10 мин с PBS 0,1 М при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 3 раза.
    2. ВыдержитеКоронарные срезы в течение 1 ч при комнатной температуре с биотинилированным козьим анти-кроличьим антителом (1: 500) в PBST с бычьим сывороточным альбумином (0,25%) (2,5 мл на лунку).
      Примечание: Исследователь может также использовать вторичное антитело, соединенный с флуоресцентной пробы на данном этапе. В этом случае остановите протокол на данном этапе и исследовать непосредственно с помощью флуоресцентного микроскопа.
    3. Промыть секции в течение 10 мин с помощью PBST при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 3 раза.
    4. Инкубируйте Коронарные срезы в течение 1 ч с авидин-биотин-пероксидаза комплекс (1: 250) в PBST (2,5 мл на лунку).
    5. Промыть секции в течение 10 мин с помощью PBST при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 2 раза.
    6. Промыть секции в течение 10 мин с 0,05 М Трис-буфере при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторите 2 раза.
    7. Инкубируйте Коронарные срезы с 0,02% 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорид, 0,04% сульфата никеля аммония и 0,01% перекиси водорода в 0,05 М Трис-буфера (рН 7,6) ат RT (2,0 мл на лунку). В оставшемся растворе (25 мл) добавляют 17 мкл H 2 O 2 (H 2 O 2 раствор 30% H 2 O) (2,0 мл на лунку).
      Примечание: Исследователь должен определить время разработки под световым микроскопом. Тем не менее, от 5 до 10 мин обеспечивает хорошую интенсивность окрашивания.
    8. При интенсивности окрашивания является оптимальным (контролируется под световым микроскопом, рисунок 5 и рисунок 6), остановить реакцию путем промывки секций в течение 10 мин с 0,1 М PBS при комнатной температуре (2,5 мл на лунку). Повторить 4 раза. Затем промойте разделы дистиллированной водой.
  3. Отбор проб монтажа (обращаться с осторожностью и перчатки под химическим капотом)
    1. секции для монтажа серийно на слайдах и воздушно-сухой. Для этого, осторожно раскрывайте секции в ростро-каудальном порядке с кисточками на слайдах. Очевидно маркировать слайды в соответствии с образцами.
    2. Дегидрировать с абсолютной Альcohol: погрузить слайды в течение 30 секунд при комнатной температуре в бане абсолютного спирта. Повторите дважды.
    3. Ясно ксилолом: погружают слайды в ксилоле бане в течение 3 мин при комнатной температуре. Повторите дважды.
    4. Покровное слайды с монтажной средой. Для этого нанесите 5 капель монтажа среды на слайде, а затем применить покровного стекла прогнанием пузырьки воздуха. Сушка воздухом в течение 48 часов.

6. Данные и статистический анализ

  1. Изучите разделы под световым микроскопом. Визуально рассчитывать FLI нейронов при большом увеличении (200x) , используя стандартные ориентиры 23,24. Точечное окрашивание с-Fos локализован в ядрах нейронов.
  2. Для каждой анализируемой области, подсчитать количество с-ФОС-позитивных клеток в группе и сравнить среднее число между контрольными и стимулированных условиях. В зависимости от нормальности данных, используйте т тест непарный студента или тест Манна-Уитни. Различия считались значимыми, если Р0; 0,05. Участок распределение FLI нейронов на чертежом (увеличение 100х) с помощью рисунка трубкой , прикрепленной к микроскопу и фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата (рисунок 5).

Результаты

Обнаружение с-ФОС является полезным инструментом , который позволяет идентифицировать группы активированных клеток при определенных условиях , таких как гипоксия и гиперкапния в естественных условиях (рис 2А) или в ситуациях , которые имитируют эти усло...

Обсуждение

C-FOS является непосредственным раннего гена, и обнаружение его продукта, белок C-FOS, классически используется для идентификации популяции нейронов , участвующих в конкретных дыхательных реакций в естественных условиях 11,13,25,28 и исключая виво 16-18, 27,32,33. ...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the "Association Française pour le Syndrome d'Ondine". FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program "Investissement d'avenir" of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture plate 12-wellCosta35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membraneCorning3477The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)Santa Cruz Biotechnologysc-52
Vectastain Elite ABC KIT Vector laboratoriesPK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2OSigma71505
Na2HPO4SigmaS7907
ParaformaldehydeSigmaP6148
NaOH 0.1NSigma43617
Polyvinyl-PyrrolidoneSigmaPVP-360
SucroseSigmaS7903
NaClSigmaS7653
Ethylene-glycolSigma33068
Triton X100SigmaT8787
Trisma HClSigmaT5941
Trisma BaseSigmaT1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride RocklandDAB50
Nickel ammonium sulphateAlfa Aesar12519
H2O2SigmaH1009
XyleneSigma33817
Entellan NeoMerck Millipore107961
Slide Thermo-scientific1014356190Superfrost ultraplus
Cover glassThermo-scientificQ10143263NR124 x 60mm
BSASigmaA2153

Ссылки

  1. Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
  2. Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
  3. Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
  4. Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
  5. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
  6. Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
  7. Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
  8. Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
  9. Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
  10. Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
  11. Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
  12. Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
  13. Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
  14. Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
  15. Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
  16. Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
  17. Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
  18. Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
  19. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
  21. Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
  22. Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
  23. Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
  24. Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
  25. Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
  26. Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
  27. Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
  28. Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
  29. Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
  30. Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
  31. Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
  32. Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
  33. Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
  34. Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
  35. Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
  36. Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
  37. Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

110Immunohistochemistry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены