Die c-fos-Protein Immunohistologische Nachweis: Ein nützliches Werkzeug als Marker der Mittelwegen beteiligt sind in spezifischen physiologischen Antworten<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; Ex Vivo</em

Zusammenfassung

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Zusammenfassung

Viele Studien versuchen, die Hirnregionen in spezifischen physiologischen Vorschriften beteiligt zu identifizieren und abzubilden. Die Proto-Onkogens c-fos, eine immediate early - Gen wird in Neuronen in Reaktion auf verschiedene Stimuli exprimiert. Das Proteinprodukt kann leicht mit immunhistochemischen Techniken nachgewiesen werden, um die Verwendung von c-fos Detektions führenden Gruppen von Neuronen zu kartieren, die Änderungen in ihrer Aktivität. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Identifizierung von brainstem neuronalen in der ventilatory Anpassung an Hypoxie oder Hyperkapnie beteiligt Populationen. Zwei Ansätze wurden beschrieben beteiligt neuronale Populationen in vivo bei Tieren zu identifizieren und ex vivo in deafferentierten brainstem Zubereitungen. In vivo wurden die Tiere ausgesetzt hyperkapnischen oder hypoxischen Gasgemischen. Ex vivo wurden deafferentierten Präparate superfused mit hypoxischen oder hyperkapnischen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit. In beiden Fällen entweder in vivo Kontrolle Tieren oder ex - vivo - Präparate wurden unter normoxischen und normocapnic Bedingungen gehalten. Der Vergleich dieser beiden Ansätze ermöglicht die Bestimmung des Ursprungs des neuronalen Aktivierungs dh peripheren und / oder zentralen. In vivo und ex vivo, brainstems wurden gesammelt, fixiert und in Abschnitte geschnitten. Sobald Abschnitte hergestellt, immunhistochemischen Nachweis des c-fos-Protein wurde gemacht, um die brainstem Gruppen von Zellen durch Hypoxie oder hyperkapnischen Stimulationen aktiviert zu identifizieren. Markierten Zellen wurden in brainstem Atmungsstrukturen gezählt. Im Vergleich zu der Kontrollgruppe, Hypoxie oder Hyperkapnie erhöhte die Anzahl der c-Fos markierten Zellen in mehreren spezifischen brainstem Websites, die damit konstitutiv für den neuronalen Bahnen bei der Anpassung des zentralen Atemantrieb beteiligt sind.

Einleitung

Das c - fos - Gen wurde zum ersten Mal am Anfang des Jahres 1980 ^1,2 und ihr Produkt wurde im Jahr 1984 als ein Kernprotein mit Gen-Aktivator Eigenschaften ^3,4 charakterisiert identifiziert. Er beteiligt sich an Mechanismen langfristigen Zusammenhang mit Neuron Stimulation. Tatsächlich Veränderungen in der neuronalen Aktivität führen zu second messenger Signalkaskaden, die die Expression der immediate early - Gens c-fos induziert, die die Produktion des Transkriptionsfaktors c-fos induziert. Der letztere veranlasst die Expression der späten Gene und nimmt somit in adaptive Reaktionen des Nervensystems auf viele verschiedene Arten von Stimuli ^4. Da somit Ende 1980 ^5,6, c-Fos Protein - Nachweis häufig verwendet wurde , in der Regel ⁴ und auf die Aktivität des zentralen Nervensystems (ZNS) zum Abbilden aus neuronalen Bahnen die Wirkungen von exogenen Faktoren auf die Gentranskription zu studieren in verschiedenen physiologischen beteiligtal Bedingungen.

Basal c-fos - Expression wurde ⁴ in verschiedenen Arten , darunter Mäuse, Ratten, Katze, Affe und Mensch untersucht. Dadurch wird die Kinetik seiner Expression relativ gut bekannt. Die Transkriptionsaktivierung ist schnell (5 bis 20 min) ^7,8, und die mRNA Akkumulation erreicht ein Maximum zwischen 30 und 45 min nach dem Beginn der Stimulation ⁹ und nimmt mit einer kurzen Halbwertszeit von 12 min. Die c-fos - Protein - Synthese folgt Akkumulation mRNA und konnte durch Immunhistochemie bei 20 bis 90 Minuten nach der Stimulation ⁶ nachgewiesen werden.

Analyse der c-fos - Expression wird in in vivo Studien klassisch verwendet , um die zentrale respiratorische Netzwerk in den ventilatory Reaktionen auf Hypoxie oder Hyperkapnie ^10-14 beteiligt zu identifizieren. Vor kurzem wurde dieses Tool auch in ex vivo brainstem Zubereitungen verwendet zentralen Atem Netzwerk Anpassungen an Hypoxie oder h zu erkundenypercapnia ^15-18. Tatsächlich erzeugen diese Präparate eine rhythmische Aktivität klassisch ¹⁹ an den zentralen Atemantrieb assimiliert. Somit hat diese Art der Herstellung den Vorteil, dass vollständig deafferentierten und daher Ergebnisse hinsichtlich c-fos - Expression nur die Folgen einer zentralen Stimulation ohne Eingreifen von peripheren Strukturen reflektieren.

Die c-fos-Nachweis konnte durch immunhistochemische oder immunohistofluorescence Ansätze gemacht werden. Indirekte Immunnachweis erfordert die Verwendung eines primären Antikörpers gegen c-fos und einem sekundären Antikörper, der gegen die Spezies gerichtet ist, in welcher der primäre Antikörper produziert wurde. Für die immunhistochemische Verfahren wird der sekundäre Antikörper mit einem Enzym konjugiert (Peroxidase, zum Beispiel) , die auf einem Substrat (H ₂ O ₂ für die Peroxidase) wirkt. Das Produkt der Enzymreaktion wird durch ein Chromogen (3,3-Diaminobenzidin entwickelt tetrahydrochloride), die Flecken es und kann unter Lichtmikroskopie beobachtet werden. Die Reaktion konnte verstärkt werden Nickelammoniumsulfat. Diese Verfahren erlauben den Nachweis von aktiven Neuronen in verschiedenen physiologischen Herausforderungen und daher die Identifizierung und / oder die Zuordnung der peripheren und zentralen Leitungsbahnen in den aufeinanderfolgenden physiologischen Reaktionen beteiligt.

Protokoll

Hinweis: c-fos - Erkennung ein standardisiertes Verfahren mit mehreren Schritten ist (Abbildung 1). Alle Versuche wurden an Ratten oder Mäusen durchgeführt. Experimentelle Protokolle wurden von der Ethikkommission in Tierexperiment Charles Darwin (Ce5 / 2011/05) genehmigt, erfolgt in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 22. September 2010 (2010/63 / EU) für die Tierpflege und nach durchgeführt mit Französisch Gesetze zur Tierpflege.

1. Herstellung der Lösungen

1. Bereiten 0,2 M Natriumphosphat - Puffer: add 6,24 g NaH ₂ PO ₄ · 2H ₂ O und 22,56 g Na ₂ HPO ₄ * H ₂ O auf 1 l destilliertes Wasser unter Rühren.
2. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA): in 20 g PFA zu 150 ml destilliertem Wasser. Die Lösung wird auf 80 ° C unter Rühren. Um die Lösung zu löschen, die Hitze reduzieren und fügen Sie 1 oder 2 Tropfen 1 N NaOH die Paraformaldehyd lösen zu helfen. Komplett auf 250 mlmit destilliertem Wasser und 250 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,4). Lagerung bei 4 ° C. Nehmen Sie entsprechende Sorgfalt, wenn diese Reagenzien verwenden. Mit Handschuhen, Kittel und Schutzbrille unter einer chemischen Abzugshaube.
   Hinweis: Bereiten Sie 4% PFA am Tag vor den Infusionen. Bestimmen das Volumen von 4% PFA in Abhängigkeit von Alter, Anzahl und Arten von Tieren.
3. Bereiten kryoprotektive Lösung: In 250 ml 0,2 M phosphatgepufferter Salzlösung, Mischung von 5 g Polyvinyl-pyrrolidon, 150 g Saccharose und 2,5 g Natriumchlorid. Nach vollständiger Auflösung in den 500 ml mit destilliertem Wasser 150 ml Ethylenglykol und einzustellen. Bewahren Sie die Gefrierschutzlösung bei 4 ° C.
4. Bereiten 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS): in 18 g NaCl zu 1 L destilliertem Wasser unter Rühren. Nach vollständiger Auflösung 1 L 0,2 M Natriumphosphatpuffer.
5. Prepare Phosphate Buffered Saline, ergänzt mit 0,3% Triton X100 (PBST): 3 ml Triton X100-997 ml PBS.
6. Bereiten 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,6): add 3,03 g Tris-Hydrochlorid und 0,70 g Tris-Base auf 500 ml destilliertem Wasser unter Rühren.
7. Bereiten Sie 2% Ziegenserum in PBST: für eine Platte, Herstellung von 30 ml Lösung. In 600 ul Ziegenserum zu 30 ml PBST und gut mischen. In 2,5 ml pro Vertiefung.
   Hinweis: Serum verwendet wird, muss kommen aus Spezies für Sekundärantikörperproduktion verwendet
8. Bereiten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen das c-fos-Protein (1: 4000, sc-52) in PBST mit Rinderserumalbumin (0,25%). Für eine Platte, 30 ml Lösung herzustellen. In 75 mg Rinderserumalbumin zu 30 ml PBST und gut mischen. Dann fügen 7,5 ul von polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen den c-fos-Protein.
9. Bereiten biotinyliertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 500) in PBST mit Rinderserumalbumin (0,25%). Für eine Platte, 30 ml Lösung herzustellen. In 75 mg Rinderserumalbumin zu 30 ml PBST und gut mischen. Dann füge hinzu60 ul biotinyliertes Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper.
10. Bereiten Sie Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (1: 250) in PBST (ABC-Lösung). Für eine Platte, 30 ml Lösung herzustellen. In 120 ul Reagens A und 120 ul Reagens B zu 30 ml PBST und gut mischen.
    Hinweis: ABC-Lösung muß mindestens 30 min vor der Verwendung hergestellt werden.
11. Bereiten Substratlösung. Unmittelbar vor der Anwendung vorzubereiten, die Lösung als (für eine Platte) folgt: 20 mg Nickelammoniumsulfat hinzu und 10 mg 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid zu 50 ml Tris-Puffer. Filter und vor Licht schützen. In 2,0 ml pro Vertiefung. In der verbleibenden Lösung (25 ml) in 17 & mgr; l H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ Lösung in 30% H ₂ O). In 2,0 ml pro Vertiefung.
    Hinweis: Eine entsprechende Sorgfalt getroffen werden sollten, wenn diese Reagenzien verwenden. Mit Handschuhen und Laborkittel.

2. c-fos Induction und Gewebeverarbeitung In Vivo

Anmerkung: Die Versuche wurden an Ratten (Sprague Dawley), oder Mäusen (C57BL / 6) durchgeführt.

1. Platzieren Sie die Tiere in einem luftdichten Kasten belüftet mit einem hypoxischen (O ₂ 8% ausgeglichen N ₂₎ oder hyperkapnischen (CO ₂ 4%, O ₂ 21% ausgeglichen N ₂₎ Gasgemisch für 2 h (2A).
2. Betäuben des Tieres mit intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (100 mg / kg). Perfuse das Tier transcardial mit 4% ²⁰ PFA. Behandeln Sie mit Sorgfalt und Handschuhe unter einer chemischen Abzugshaube.
3. Nach Perfusion sezieren das Gehirn ²⁰ und es in 7 ml 4% PFA in einem 15 - ml - Röhrchen tauchen für 48 Stunden bei 4 ° C. das Gehirn aus PFA Dann entfernen und vollständig in der Gefrierschutzlösung einzutauchen. Aufbewahren bei -18 ° C (Abbildung 3). Entsorgen Sie den Rest des Körpers des Tieres durch den entsprechenden Abfallverarbeitung pathway.
   Hinweis: Eiskristallbildung beim Tief ist ein Schritt zwischen PFA Fixierung und Einfrieren. Es reduziert die Bildung von Eiskristallen in Zellen mit einer Lösung, deren Gefrieren in amorpher Form ist. Die fixierten Proben sind in der Kryoschutz-Lösung imprägniert werden (hergestellt in Schritt 1.3) für mindestens 24 h bei 4 ° C. Behandeln Sie mit Sorgfalt und Handschuhe unter chemischen Haube.

3. c-fos - Induktion und Gewebeverarbeitung Ex Vivo

Hinweis: Die Versuche wurden nur bei neugeborenen Ratten oder Mäusen durchgeführt.

1. Isolieren Sie das ZNS , wie durch Suzue ¹⁹ beschrieben. Legen Sie sie in einem Aufnahmeraum und superfuse es kontinuierlich mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit mit einer Rate von 7,5 ml / min bei 26 ° C ²¹ (aCSF: in mM: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl _2, 1,0 MgCl _2, 26,0 NaHCO _3, 30,0 D-glucose, gesättigt mit O ₂ und auf pH 7,4 eingestellt , indem sie mit 95% O ₂ und 5 Begasung% CO ₂₎ (2B).
2. Ersetzen Sie die aCSF mit einem deoxygenated aCSF (gleiche Zusammensetzung mit 95% N ₂ und 5% CO _2, pH 7,4) für Hypoxie oder von einem angesäuerten aCSF (Standard aCSF mit NaHCO ₃ reduziert auf 10,0 mM, mit 95% O ₂ und 5% CO ₂₎ für Hyperkapnie. Tragen Sie die Stimulation für 30 min (2B).
3. Ex vivo nach der Induktionsperiode übertragen das ZNS von neugeborenen Mäusen oder Ratten in 2,5 ml 4% PFA in einem 2,5 - ml - Röhrchen für 48 Stunden und lagern bei -18 ° C in einer Gefrierschutzlösung für die spätere Verwendung (Abbildung 3).
   Anmerkung: Ex vivo ist es nicht notwendig , Tiere zu perfundieren. Eine frühere Studie legt nahe , dass kleine Proben weniger als 10 mm Durchmesser kann durch einfache Diffusion ²² fixiert werden. Eine zitierte Penetrationsrate (Abstand, in mm, für die Fixierungs Diffusion in das Gewebe) für Aldehyd 2 oder 3 mm / h.

4. Brainstem Sectioning

Anmerkung: Von diesem Schritt an dem Ende, das Protokoll für in vivo und ex vivo Induktionen streng gleich ist.

1. Vor dem Schneiden, legen Sie eine Person in einer 12-Well-Platte einlegen gut und fügen Sie 2,5 ml PBS in jede Vertiefung geben.
2. Eine serielle Koronalschnitte (40 & mgr; m) des Hirnstamms mit einem Kryostaten und sammeln sie in der 12-Well-Platte. Für die gesamte erwachsene brainstem, machen etwa 70 Scheiben (Abbildung 3).
   Hinweis: Es ist möglich, Gewebeschnitt aus mehreren Tieren parallel in einer Platte.

5. Immunhistologische Verfahren (Tabelle 1)

Hinweis: Während des gesamten Verfahrens bleiben die Abschnitte in den gut Einsätzen.

1. Tag 1 - Endogene Peroxidaseaktivität Zerstörung, nicht-spezifische Bindungsstelle blockieren und die Inkubation mit dem primären Antikörper (Figur 4)
   1. Waschendie Schnitte für 10 min mit 0,1 M PBS bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). 3-mal wiederholen.
   2. Unterdrücken die endogene Peroxidase - Aktivität durch die Kranzschnitte für 30 min bei RT inkubiert mit Wasserstoffperoxid H ₂ O _2, 3% in 0,1 M PBS (2,5 ml pro Vertiefung).
   3. Waschen Sie die Abschnitte für 10 min mit 0,1 M PBS bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). 3-mal wiederholen.
   4. Blockieren die nicht-spezifische Bindungsstelle von der koronalen Abschnitte für 1 h bei RT inkubiert mit Ziegenserum (2%) in PBST.
   5. Inkubieren der Kranzschnitte für 48 Stunden bei 4 ° C mit einem Kaninchen-polyklonalen Antikörpers gegen das c-fos-Protein (1: 4000, sc-52) in PBST mit Rinderserumalbumin (0,25%) (2,5 ml pro Vertiefung).
2. Tag 3 - Inkubation mit sekundärem Antikörper und die Entwicklung einer Farbreaktion (Figur 4)
   1. Waschen Sie die Abschnitte für 10 min mit PBS 0,1 M bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). 3-mal wiederholen.
   2. inkubieren derKoronalschnitte für 1 Stunde bei RT mit biotinyliertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 500) in PBST mit Rinderserumalbumin (0,25%) (2,5 ml pro Vertiefung).
      Hinweis: Die Ermittler auch einen sekundären Antikörper gekoppelt an eine fluoreszierende Sonde in diesem Stadium können. In diesem Fall beenden Sie das Protokoll in diesem Stadium und untersuchen direkt ein Fluoreszenzmikroskop.
   3. Waschen Sie die Sektionen für 10 min mit PBST bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). 3-mal wiederholen.
   4. Inkubieren der Koronalschnitte für 1 h mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (1: 250) in PBST (2,5 ml pro Vertiefung).
   5. Waschen Sie die Sektionen für 10 min mit PBST bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). Wiederholen 2 mal.
   6. Waschen Sie die Abschnitte für 10 min mit 0,05 M Tris-Puffer bei RT (2,5 ml pro Vertiefung). Wiederholen 2 mal.
   7. Inkubieren der koronale Schnitte mit 0,02% 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid, 0,04% Nickelammoniumsulfat und 0,01% Wasserstoffperoxid in 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,6) at RT (2,0 ml pro Vertiefung). In der verbleibenden Lösung (25 ml) in 17 & mgr; l H ₂ O ₂ (H ₂ O ₂ Lösung in 30% H ₂ O) (2,0 ml pro Vertiefung).
      Hinweis: Der Prüfer sollte die Entwicklungszeiten unter dem Lichtmikroskop bestimmen. Jedoch 5 bis 10 min sorgt für eine gute Färbungsintensität.
   8. Wenn Intensität der Färbung optimal ist (unter dem Lichtmikroskop kontrolliert, siehe Abbildung 5 und 6), um die Reaktion zu stoppen , indem sie die Abschnitte 10 min mit 0,1 M PBS bei RT (2,5 ml pro Well) waschen. Wiederholen 4 mal. Dann waschen Sie die Abschnitte mit destilliertem Wasser.
3. Probenahme Montage (mit Vorsicht handhaben und Handschuhe unter chemischen Haube)
   1. Berg Abschnitte seriell auf Dias und der Luft trocknen. Dazu verteilen Sie bitte die Abschnitte in rostro-Schwanz-, um mit dem Pinsel auf den Folien. Offensichtlich beschriften Sie die Folien nach den Proben.
   2. Entwässern mit absolutem alkohol: die Folien für 30 Sekunden bei RT in absolutem Alkohol Bad einzutauchen. Zweimal wiederholen.
   3. Klar mit Xylol: die Folien in Xylolbad 3 min bei RT tauchen. Zweimal wiederholen.
   4. Deckglas die Folien mit Eindeckmediums. Dabei gelten 5 Tropfen auf dem Schlitten Eindeckmediums und wenden dann das Deckglas durch die Luftblasen auszutreiben. Luft trocknen für 48 Stunden.

6. Daten und statistische Analyse

1. Untersuchen Abschnitte unter einem Lichtmikroskop. Zählen Optisch FLI Neuronen bei hoher Vergrößerung (200x) unter Verwendung von Standard - Sehenswürdigkeiten ^23,24. Die c-Fos punkt- Färbung wird in den Kernen von Neuronen lokalisiert.
2. Für jeden analysierten Bereich, zählen die Anzahl der c-Fos-positiven Zellen pro Abschnitt und vergleichen Sie die mittlere Zahl zwischen Kontrolle und stimulierten Bedingungen. In Abhängigkeit von der Normalität der Daten verwenden t - Test ungepaarten Student oder Mann-Whitney - Test. Die Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn P0; 0,05. Plotten die Verteilung von FLI Neuronen auf eine Zeichnung (Vergrößerung 100x) mit einem Zugrohr zum Mikroskop befestigt ist und mit einer Digitalkamera (5) fotografiert.

Ergebnisse

Die c-fos - Erkennung ist ein nützliches Werkzeug , das Gruppen von aktivierten Zellen unter bestimmten Bedingungen, wie Hypoxie und Hyperkapnie in vivo (2A) oder in Situationen , ermöglicht die Identifizierung , die diese Bedingungen ex vivo (2B) zu imitieren. In vivo, neugeboren, junge oder Erwachsenen Nagetieren wurden in einem luftdichten Kasten , in dem die gasförmige Umgebung ständig erneuert durch ein Gasgemisch mit ...

Diskussion

C-fos ist ein immediate early - Gen, und die Detektion ihres Produkts, die c-fos - Protein, verwendet wird klassisch neuronaler Populationen in spezifischen Atemwegsantworten in vivo und ex vivo ^{11,13,25,28 16-18} beteiligt zu ^{identifizieren, 27,32,33.}

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls

Seien Sie während des Perfusionsschritt vorsichtig. Die 4% PFA-Lö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture plate 12-well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
Primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153