電気活性ポリマーナノ粒子出展光熱プロパティ

要約

A protocol is presented for the synthesis and preparation of nanoparticles consisting of electroactive polymers.

要約

A method for the synthesis of electroactive polymers is demonstrated, starting with the synthesis of extended conjugation monomers using a three-step process that finishes with Negishi coupling. Negishi coupling is a cross-coupling process in which a chemical precursor is first lithiated, followed by transmetallation with ZnCl₂. The resultant organozinc compound can be coupled to a dibrominated aromatic precursor to give the conjugated monomer. Polymer films can be prepared via electropolymerization of the monomer and characterized using cyclic voltammetry and ultraviolet-visible-near infrared (UV-Vis-NIR) spectroscopy. Nanoparticles (NPs) are prepared via emulsion polymerization of the monomer using a two-surfactant system to yield an aqueous dispersion of the polymer NPs. The NPs are characterized using dynamic light scattering, electron microscopy, and UV-Vis-NIR-spectroscopy. Cytocompatibility of NPs is investigated using the cell viability assay. Finally, the NP suspensions are irradiated with a NIR laser to determine their effectiveness as potential materials for photothermal therapy (PTT).

概要

電気活性ポリマーは、電場の存在下で、それらの特性（色、導電性、反応性、量など ）を変更します。迅速なスイッチング時間、同調性、耐久性、電気活性ポリマーの軽量特性は代替エネルギー、センサー、エレクトロクロミック、および生物医学的装置を含む多くの提案の用途、につながっています。電気活性ポリマーは、柔軟、軽量電池、キャパシタ電極として有用である可能性がある。エレクトロクロミック素子における電気活性ポリマーの¹アプリケーションは、建物や自動車、サングラス、保護メガネ、光記憶装置、スマート繊維用グレア低減システムを含む^。2-5スマートウィンドウは、オンデマンド特定の波長の光を遮断し、家庭や自動車の内装を保護することによって、エネルギー必要量を減らすことができます。スマートテキスタイルは、UV放射線から保護するために衣服に使用することができます^。6電気活性ポリマーは、ALSを持っていますO医療機器で使用され始めて。生物医学装置に使用される電気活性ポリマーの中でも、ポリピロール（のPPy）、ポリアニリン（PANI）、およびポリ（3,4-エチレンジオキシチオフェン）（PEDOT）は、最も一般的なの一つです。例えば、ポリマーのこれらの種類は、一般的に、バイオセンサデバイス内のトランスデューサとして使用されている治 ​​療的送達⁷応用も有望であることが示されています。研究では、電気活性ポリマーから調製されたデバイスからの薬物および治療 ​​用タンパク質の放出を実証した^。8-12最近では、電気活性ポリマーは、光熱治療における治療薬として使用されている^。13-15を光熱治療において、光熱剤は、近くの光を吸収しなければなりませんまた、光は、典型的には、1センチメートルまで、組織に浸透の最大の深さを持っている治 ​​療の窓、として知られている、（NIR）領域（〜700〜900 nm）を-infrared。この範囲では^16,17、ヘモグロビンのような生物学的な発色団は、 、酸化ヘモグロビン、脂質、および水が持っている少しツーなし簡単に浸透する光を可能に吸光度、。光熱剤は、この治療域の光を吸収するとき、光エネルギーは、光熱エネルギーに変換されます。

根岸カップリングを用いて合成したビス- EDOTベンゼンモノマー、置換アルコキシ、アービンおよび共同研究者は、以前に報告されている^。18根岸カップリングは、炭素-炭素結合形成のための好ましい方法です。このプロセスは、低毒性であり、他の有機金属を用いるよりも高い反応性を有する傾向がある有機亜鉛中間体の使用を含む多くの利点を有している^。19,20有機亜鉛化合物は、有機ハロゲン化物に官能基の幅広い互換性がある^。20では根岸カップリング反応は、有機ハロゲン化物及び有機金属は、パラジウム（0）触媒の使用を介して連結されている²⁰本明細書に提示研究では、このクロスカップリング法は、（1,4-ジアルコキシ-2,5-ビスの合成に利用されています3,4- ethylenedioxythienyl）benze_{NE（BEDOT-B（OR）2）}モノマー。これらのモノマーは、簡単に生物医学的用途における使用のための有望な候補であるポリマーを得るために、電気化学的または化学的に重合することができます。

生物医学的用途のための水性溶液中のコロイド状ポリマー懸濁液を調製するための従来の方法は、典型的には、ナノ析出またはエマルジ ​​ョン溶媒蒸発法に続いて、バルクポリマーの溶解を伴う^。21,22のポリNPを_{（BEDOT-B（OR）2）を}製造するためにNPは、 その場で乳化重合中により合成される場合には、ボトムアップアプローチがここで示されています。乳化重合は、容易にスケーラブルであり、NPの製造のための比較的高速な方法であるプロセスである。他の電気活性ポリマーのNPを製造するために乳化重合を用いて^、22の研究は、のPPy及びPEDOTのために報告されている^。15,23,24 PEDOTのNP、例えばスプレーエマルションpを使用して調製されています^{olymerization。24、}この方法は、再現するのが困難であり、通常はより大きなミクロンサイズの粒子が得られます。この資料に記載されているプロトコルは、再現性100-nmのポリマーのNPを製造するためのドロップ、超音波処理法の使用を探ります。

このプロトコルでは、以前に報告されたポリ同様のNIR領域の光を吸収するように調整電気活性ポリマー（BEDOT-B（OR）は_、2） 合成されたエレクトロクロミックデバイスおよびPTT剤としての可能性を実証することを特徴とします。まず、根岸カップリングを介して、単量体の合成のための手順が記載されています。モノマーは、NMR及び紫外可視近赤外分光法を用いて特徴付けられます。水性媒体中で酸化乳化重合を介してNPのコロイド懸濁液の調製も記載されています。手順は、以前にHanらによって記載された2段階乳化重合プロセスに基づいている。別の単量体に適用されます。二界面活性剤系でありますNPの単分散性を制御するために使用されます。細胞生存率アッセイは、NPの細胞適合性を評価するために使用されます。最後に、PTTトランスデューサとして作用するこれらのNPの電位は、NIRレーザを照射することによって実証されます。

プロトコル

注意：使用する前に、関連するすべての安全データシート（SDS）を参照してください。これらの合成に使用される試薬のいくつかは、潜在的に危険です。個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、長ズボン、およびクローズドつま先の靴）を含むすべての適切な安全対策を使用し、ヒュームフード内で合成を行ってください。リチウム化は、特に危険であり、唯一の監督との適切な訓練を受けた人が行ってください。

1.モノマー合成

注： 図1は、合成セクション1.2に記載されている前駆体およびモノマーの製造のための化学的経路を示す- 1.5。

1. 材料
   1. 前述のようにEDOTを精製する^。25
   2. 24時間真空下でテトラブチルアンモニウム、酢酸エチルから過塩素酸（TBAP）、乾燥を再結晶化。 n-ブチルリチウムHoye らにより記載されたように（ヘキサン中のnBuLi、2.5 M）を滴定します。 ^{26内の48時間前、実際の濃度を決定するために使用します。}
   3. 使用前に24時間、100℃で乾燥し、硫酸マグネシウム、炭酸カリウム。受信したこのプロトコルで使用されるすべての他の化学物質を使用してください。
2. 1,4- Dialkoxybenzenesの合成
   注： 図1（a）は、1-ブロモヘキサンを使用して、1,4- dihexyloxybenzeneの調製を示します。
   1. 隔壁、アルゴンインレットアダプター、およびバブラーに接続されたガス出口アダプターを装着コンデンサ付きのオーブン乾燥した三口丸底フラスコを装備。密封前に、フラスコに攪拌棒を追加します。
   2. ポリを使用してシュレンクラインに入口アダプタ（塩化ビニル）（PVC）チューブを接続し、アルゴンで丸底フラスコをパージします。
   3. 丸底フラスコにヒドロキノンの12.5グラム（113.5ミリモル）を添加し、撹拌しながら、無水テトラヒドロフラン（THF）20ml中に溶解します。
   4. これとは別に、単一首のエタノール30ml中のKOHの14グラム（250ミリモル）を溶​​解丸底フラスコに、溶解するまで撹拌します。
   5. 一度溶解し、ゆっくりとシリンジを用いて三首丸底フラスコにKOH溶液を加えます。混合物を1時間撹拌します。
   6. 1時間後、反応混合物に1-ブロモアルカンの250ミリモルを加えます。
   7. アルゴン下で攪拌しながら24時間還流下で反応混合物を加熱します。
   8. 24時間後、反応混合物をRTに冷却し、15 mLの脱イオン水及び10mlのジクロロメタンを添加することを可能にします。
   9. 分液漏斗に混合物を転送します。有機層を分離し、脱イオン水10mlでそれを3回洗浄します。
   10. 15分間のMgSO _4、15gの上に有機層を乾燥させます。
   11. 濾紙を通して真空濾過により_硫酸マグネシウム_{を除去します。}
   12. 粗生成物を白色固体として1,4-ジアルコキシベンゼンを得、50℃と21キロパスカルでロータリーエバポレーターを用いて濾過した溶液から溶媒を除去します。
   13. にちょうど十分な熱エタノールを追加することにより、粗生成物を再結晶化生成物を溶解します。溶解した後、結晶化を誘導するために、氷浴中で配置します。
   14. 濾紙を通して真空濾過により結晶を集め、冷エタノールで洗浄します。
   15. 室温で24時間、真空下で結晶を乾燥し、さらに使用するまでアルゴン下で保管してください。この手順は、1,4- dihexyloxybenzeneを生成します。
   16. 融点及び¹ H及び¹³ C NMR分光法を用いて生成物を特徴付ける^。27
3. エステル部分を含む1,4- Dialkoxybenzenesの合成
   注： 図1Bは、エチル-4-ブロモブタンを使用して、1,4-ジアルコキシベンゼンの調製のための化学的経路を示します。
   1. 隔壁、アルゴンインレットアダプター、およびバブラーに接続されたガラス出口アダプターを装着コンデンサ付きのオーブン乾燥した三口丸底フラスコを装備。密封前に、フラスコに攪拌棒を追加します。
   2. PVCチューブを使用してシュレンクラインに入口アダプタを接続し、アルゴンでパージします。
   3. KIの1.88グラム（93.5ミリモル）およびK ₂ CO ₃の15.69グラム（93.3ミリモル）を計量し、丸底フラスコに加えます。
   4. 無水N、N-ジメチルホルムアミド （DMF）25mlのを追加し、塩が溶解するまで撹拌します。
   5. 溶解した後、反応混合物にハイドロキノン2.5gの（18.7ミリモル）を加え、溶解するまで反応を撹拌することができます。
   6. 全ての固体が溶解されるとき、アルキルbromoalkanoateの46.8ミリモルを加えます。連続的に撹拌しながらアルゴン下で24時間還流下で反応混合物を加熱します。
   7. 熱からの反応混合物を取り出して、それを室温まで冷却します。
   8. 分液漏斗に反応混合物を移し、有機層を抽出し、水（20ml）および酢酸エチル（20 ml）を加えます。有機層を分離し、それを水で3回（20ミリリットル部分を）洗います。
   9. 15分間のMgSO _4、15gの上に有機層を乾燥させます。乾燥したら、フィルでの真空濾過によって混合物から_硫酸マグネシウム_を除去ター紙。
   10. 100℃、21キロパスカルでロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。 RT O / Nで真空下で粗生成物を乾燥させます。
   11. 全ての固体を溶解するだけで十分な熱エタノールを追加することで、製品を再結晶化。溶解した後、氷中にフラスコを冷却し、結晶を形成することができます。真空濾過によって生成物を回収し、冷エタノールで洗浄します。
   12. 24時間室温で真空下で結晶を乾燥し、さらに使用するまでアルゴン下で保管してください。この手順は、1,4-ビス（エチルブタノイル）ベンゼンを生成します。
   13. 融点及び¹ H及び¹³ C NMR分光法を用いて生成物を特徴付ける^。28
4. 1,4-ジアルコキシ-2,5-ジブロモベンゼンの合成
   注：1,4-ジアルコキシ-2,5-ジブロモベンゼンの調製のための化学的経路は、図1Aおよび 1Bに示されています。
   1. アルゴン導入口を有する乾燥した三つ口丸底フラスコに、でキャップ定圧滴下漏斗に適合ガラス栓またはセプタム、および1M NaOH溶液の上に吊り下げ反転ガラス漏斗を取り付けたプラスチックチューブに接続された出口。
   2. この丸底フラスコ中で、ジクロロメタン中の1,4-ジアルコキシベンゼンの218ミリモル（15ml）に溶解します。
   3. 別途、250mlのフラスコに_Br 2を12mlの（598ミリモル）を添加し、ジクロロメタン（12 ml）で希釈します。
   4. 定圧滴下漏斗へ_の Br 2 /ジクロロメタン溶液を移します。 2時間のスパンで、アルゴン下で攪拌しながら三首丸底フラスコにBrの_2溶液の滴下を追加します。
   5. 添加完了後、反応は、連続アルゴン流れ下でO / Nを攪拌することを可能にします。
   6. DI水（20 ml）を添加することにより反応をクエンチし、分液漏斗に混合物を注ぎます。
   7. 有機層を分離し、脱イオン水（20mL部分）で3回洗浄します。 15分間のMgSO _4、15gの上に有機層を乾燥させます。
   8. により_硫酸マグネシウム_を削除真空濾紙を通して濾過し、75℃、21キロパスカルでロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。
   9. 全ての固体を溶解するだけで十分な熱エタノールを加えることで、粗1,4-ジアルコキシ-2,5-ジブロモベンゼンを精製します。溶解した後、氷中にフラスコを冷却し、結晶を形成することができます。真空濾過によって生成物を回収し、冷エタノールで洗浄します。
   10. RT O / Nで真空下で精製された生成物を乾燥。アルゴン下で保管してください。
   11. 融点及び¹ H及び¹³ C NMR分光法を用いて生成物を特徴付ける^。27,28
5. 3,4-エチレンジオキシチオフェン（EDOT）と1,4-ジアルコキシ-2,5-ジブロモベンゼンの根岸カップリング
   注： 図1Cは、モノマーM1とM2を形成するためのEDOT 1,4-ジアルコキシ-2,5-ジブロモベンゼンの根岸カップリングを示しています。
   1. セプタム、アルゴンに接続された入口流制御アダプタを装着コンデンサー、およびガス出口流CONできれいに三首丸底フラスコに合わせバブラーに接続トロールアダプタ。
   2. 肉厚のPVCチューブを使用してシュレンクラインに入口アダプターを接続します。数分間反応フラスコにアルゴンを流し始めます。
   3. ブンゼンバーナーを使用して、真空下で装置を火炎 - 乾燥およびエアレス環境を確保するために、アルゴンで3回パージします。
   4. 精製されたEDOTの1.07グラム（10ミリモル）を計量し、セプタムを通して挿入された注射器を用いて反応フラスコに追加します。無水THF（20ml）でEDOTを希釈し、アルゴン下で攪拌します。
   5. -78℃で15分間ドライアイス/アセトン浴を使用してEDOT溶液を含有するフラスコを冷却。
   6. -78℃に温度を維持しながら、15分後、ヘキサンをゆっくりと溶液に滴下中に11ミリモルのnBuLiを加えます。 1時間-78℃で反応を撹拌しました。
      注：のnBuLiの正確な濃度は、第1.1項に従って使用前に滴定によって決定されるべきです。
   7. 攪拌1時間後、ドライアイス/アセトンBAを削除番目。
   8. すぐにお風呂を除去した後、1.0 MのZnCl _2溶液を滴下の14.13ミリリットルを追加します。室温で攪拌しながら反応を1時間進行させます。
   9. 撹拌の1時間後、反応混合物に1,4-ジアルコキシ-2,5-ジブロモベンゼン、テトラキス0.08ミリモル（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）の4ミリモルを加えます。
   10. 油浴中で還流（70℃）で、反応混合物を加熱します。
   11. 薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて反応の進行を追跡する：毎日の注射器を用いて反応混合物の少量（0.2 ml）のアリコートを取り、2 mlの1 M HCl中に沈殿させます。 2ミリリットル_の CHCl 3で抽出し、EDOTの溶液とappropriate1,4ジアルコキシ-2,5-ジブロモベンゼンのスポットと一緒にシリカTLCプレート上のエキスを発見。 60:40酢酸エチルで溶出：ヘキサン。
   12. 反応が完了したら、反応混合物を室温に冷却します。 1 MのHClを10mlを加えて反応をクエンチし、ジクロロメタン（20 ml）を添加しました。
   13. Trの分液漏斗にansfer、有機層を分離します。
   14. 洗浄水がもはや酸性になるまでDI水で有機層を洗浄していません。 pH試験紙で洗浄水の酸性度をテストします。
   15. _MgSO 4を、フィルタの15グラム以上の有機層を乾燥し、黄橙色固体として粗拡張共役モノマー（M1またはM2）を得、50℃と21キロパスカルでロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。
   16. 1エタノール：ベンゼン、M1のための溶液または7：2ヘキサン：M2のためのベンゼン3の高温の溶液を使用して粗生成物を再結晶化。固体を溶解するためにちょうど十分な熱溶媒の混合物を追加します。溶解した後、氷中にフラスコを冷却し、結晶を形成することができます。真空濾過によって生成物を回収し、冷エタノールで洗浄します。
   17. 室温で24時間、真空下で生成物を乾燥させます。アルゴン下、暗所に保管してください。
   18. 融点及び¹ H及び¹³ C NMR分光法を用いて生成物を特徴付ける^。18

2。電気化学

1. 電解
   1. 50mlのメスフラスコに無水アセトニトリル（CH ₃ CN）中の100mM過塩素酸テトラブチルアンモニウム（TBAP）電解液を準備します。
   2. 10 mlの容量フラスコ中で希釈液として100 mMのTBAP / _CH 3 CN溶液を用いて10mMのモノマー（M1またはM2）の溶液を調製します。
   3. オーブン乾燥した電気化学セルに銀線（擬似参照電極）、白金フラッグ（対向電極）を加えます。
   4. 作用電極として使用するための新たに磨かれた白金ボタン（2 ^mm 2の直径）を挿入します。プラチナボタン電極の下部には、電気化学セルの底部に触れていないことを確認してください。
   5. すべての3つの電極の先端を溶液中に浸漬されることを保証するのに十分なモノマーの電解液を電気化学セルを埋めます。
   6. そっと目に浸漬針を通してアルゴンをバブリングすることにより、5分間この溶液を脱気Eソリューション。
   7. 2ミリメートルソリューションの上に針を上げて、ソリューションの上にアルゴンブランケットを維持するために、実験を通してアルゴンの流れを継続します。
   8. ポテンショスタットに電極を接続し、100 mVの/秒の掃引速度と-1.5 Vと1.0 Vの間の潜在的な範囲で適用可能性を5回循環させることにより重合を開始
   9. サイクリックボルタモグラムを生成するには、このプロセスの間に電流出力を記録します。
2. ポリマー電気化学
   1. ポリマーフィルムは、白金ボタン作用電極上に堆積した後、モノマーの電解質溶液から全ての電極を除去し、穏やかにモノマーを含まない電解質溶液（3ml）でリンス。
   2. クリーンな電気化学セルに電極を追加し、すべての3つの電極の先端を溶液中に浸漬されることを保証するのに十分な単量体を含まない電解質溶液を加えます。
   3. ポテンショスタットに電極を接続します。印加された電位TWサイクル50 MV /秒、-1.5 Vと1.0 Vの間の電位範囲の掃引速度でO回
   4. 100での実験では、200、300、400 mVの/秒を繰り返します。サイクリックボルタモグラムを生成するために、各実験中の電流出力を記録します。
3. 紫外可視近赤外分光法と、光熱研究電解膜の作製
   1. インジウムスズ酸化物（ITO）作用電極として被覆スライドガラスを使用して、上記のセクション2.1に今回記載したように、ポリマーフィルムを調製。 100 mVの/秒の走査速度で5サイクル以上の高分子膜を成長させます。
   2. ポリマー堆積した後、モノマー溶液から電極を除去し、アセトニトリル（5ml）で洗浄します。
   3. 分光研究に先立ちアセトニトリルにポリマーフィルムを保管してください。

3. NP準備

図2は、乳化重合によってNPを調製するために使用されるプロセスの概略図を示します。

1. PR水中2％のepare 1 mlの溶液（w / v）のポリ（4-スチレンスルホン酸 - コ - マレイン酸）（PSS - コ - MA）をガラスバイアル中。バイアルに小さな磁気撹拌棒を追加します。これは、水相です。
2. マイクロチューブにクロロホルム中16 mg / mlのモノマー溶液の100μlのを準備します。
3. 100μlのモノマー溶液中にドデシルベンゼンスルホン酸（DBSA）の0.03グラムを溶解した有機溶液を調製します。溶液の均質性を確保するために30〜60分間自動ボルテックスミキサーを使用して、有機溶液を混合します。
4. 有機溶液の完全なボリュームが使用されるまで、磁気撹拌棒で撹拌しながら10μlの部分に水相に滴下し、有機相を追加します。添加の間に60秒間攪拌を許可します。
5. 混合物を希釈するために水2mlを追加します。バイアルから撹拌棒を削除します。
6. 浸漬しながら、30％の振幅で10秒間隔で20秒の合計のためのプローブ超音波処理器を使用してエマルジョンを超音波処理氷浴中でバイアル。
7. 氷浴からサンプルバイアルを取り外し、撹拌棒を交換し、エマルジョンを攪拌し続けます。
8. モノマーエマルションに水の中のFeCl ₃の100mg / ml溶液の3.8μLを追加します。継続的に攪拌しながら重合を1時間に発生することを許可します。ポリマーのこのプロトコル利回りのNPは、PSS-CO-MAで安定化。
9. 撹拌プレートからのNPサスペンションを外し、7ミリリットル遠心チューブに移します。 3分間75,600×gでサスペンションを遠心。上清を回収し、ペレットを廃棄します。
10. 100kDaの分子量カットオフ（MWCO）透析チューブを用いて24時間上清を透析。

4.ポリマーフィルム及びNPキャラクタリゼーション

注：紫外可視近赤外分光法を介してポリマーフィルムとのNPを特徴付ける、および動的光散乱、ゼータ電位の分析、および電子顕微鏡を用いたNP。

1. 紫外 - 可視-N中のポリマー吸収の決意IRスペクトル²⁹
   1. NP懸濁液：石英キュベットにサスペンションを移し、300からスペクトルを取得 - 5nmのスキャン間隔で1000nmで。
   2. 酸化ポリマーフィルム：石英キュベットにポリマー被覆ITOガラススライドを移し、無水アセトニトリルでキュベットを埋めます。アセトニトリルの_CHCl 3中のFeCl ₃を100mg / ml溶液の2滴を加え、ポリマーフィルムが完全に酸化されるように混合します。 5nmのスキャン間隔で1000nmの - 300からスペクトルを取得します。
   3. 減少ポリマーフィルム：キュベットにポリマー被覆ITOガラススライドを移し、無水アセトニトリルでキュベットを埋めます。液体にヒドラジンの一滴を追加し、ポリマーフィルムは完全に還元されるように混ぜます。 5nmのスキャン間隔で1000nmの - 300からスペクトルを取得します。
2. 動的光散乱^{（DLS）30を使用した} NPサイズの決意
   1. DLS機器の電源をオンにし、許可しますそれを15分間ウォームアップします。
   2. 使い捨てポリスチレンキュベット中0.01 mg / mlのと場所の濃度まで水でのNPサスペンションを希釈します。
   3. 読者にキュベットを配置し、測定を開始します。
3. NPゼータ電位³¹の決意
   1. ゼータ電位測定器の電源を入れ、30分間のウォームアップすることができます。
   2. 10mMのKCl溶液の800μlのNPの懸濁液200μlを希釈してサンプルを準備します。
   3. 700μlのサンプルを有する使い捨てポリスチレンキュベットを記入してください。
   4. 気泡が電極間またはレーザ光路中に閉じ込めていないことを保証する試料中にゼータ電位電極セルを挿入します。
   5. 楽器でキュベットを挿入して測定を実行するためのソフトウェア命令に従ってください。
4. 走査型電子顕微鏡^{（SEM）32を使用して} NPサイズの決意
   1. ドロップキャストNP懸濁液を10μlのSiウェハ上にと乾燥させます。
   2. コー​​トにイリジウムの2 nmのと乾燥のNPをスパッタ。
   3. 画像5mmの作動距離でと5 kVのでのサンプル。

5. NPの細胞適合性を調査

注：すべての細胞の操作は、細菌、酵母菌、又は環境からの真菌での細胞の汚染を防止するために、及び潜在的に感染症からユーザーを保護するために安全キャビネット（層流フード）中で実施されるべきです。細胞に使用されるすべてのソリューション、用品、無菌であるべきです。適切な無菌細胞培養技術を使用してください。

1. 培養増殖培地として10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて、CO ₂インキュベーター（5％CO _2）中で37℃でのT75フラスコ中のSKOV-3卵巣癌細胞。
2. /ウェルで96ウェルプレート中に5,000個の細胞密度でシード細胞をCO ₂中37℃で24時間インキュベートインキュベーター。
3. 使用直前に、1mg / mlの濃度で完全な増殖培地中でのNP懸濁液を希釈します。
4. 無菌の0.2μmのフィルターを通過することによりNP懸濁液を濾過し、1％のペニシリン/ストレプトマイシンを補充した完全増殖培地で所望の露光濃度（2〜500 / mlの）に希釈します。
5. 静かにピペッティングすることにより、96ウェルプレート中のウェルのそれぞれから培地を除去し、種々の露光濃度でNP懸濁液の100μlで置き換え、または正と負の両方の細胞適合性のコントロールのためのNPを含まない培地100μlで。条件あたり6複製ウェルを使用しています。
6. すぐに次のステップの前に、フェノールレッドを含まないDMEM中で、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）の0.5 mg / mlの溶液を調製します。無菌0.2μmフィルターを通して滅菌フィルタMTT溶液。
7. NPは所望の時間細胞と共にインキュベートさせた後（TYpically 24または48時間）、慎重にピペットでNP懸濁液を削除します。
8. 直後の状態に応じて、以下でメディアを交換：
   1. 負の細胞適合性制御のために、6ウェルの各々に100μlのメタノールを添加し、少なくとも5分間座ってすることができます。メタノール処理後、フェノールレッドを含まないDMEMに滅菌濾過した0.5 mg / mlのMTT溶液100μlのメタノールを交換してください。
   2. 陽性コントロール及びNP処理したサンプルでは、​​フェノールレッドを含まないDMEM中に滅菌濾過した0.5 mg / mlのMTT溶液100μlの培地を交換してください。
9. インキュベーターで2〜4時間、細胞をインキュベートします。インキュベーション後、ホルマザン結晶の形成を確認するために顕微鏡下で細胞を調べます。
10. ピペットで注意深くMTT溶液を除去し、ジメチルスルホキシド100μlの（DMSO）と交換してください。
11. シェーカー上で96ウェルプレートを置き、ための溶解を促進するために、数分間混合マザン結晶。
12. 590 nmの（ホルマザン産物のピーク吸光度）および700 nmの（ベースライン）で各ウェルの吸光度を測定します。
13. 各ウェルについて590 nmのものから700ナノメートル（ベースライン）でサンプルの吸光度を減算します。
14. 陽性対照の平均で割って補正した吸光度を正規化し、100を掛けることによってパーセンテージに変換されます。
15. 各条件の平均生存率パーセントと標準偏差を決定します。

6.光熱伝達研究

注：この作業では、以前にパタニとTunellによって記述レーザーシステムを利用している³³

1. NP懸濁液の光熱伝達
   1. 目的の濃度にDI水の中でのNPを希釈します。
   2. 96ウェルプレートのウェルにNP懸濁液100μlを加えます。 25℃に保ったホットプレート上のウェルプレートを置きます。
   3. レーザーの電源をオンにして、それがトン許可O数分間温めます。この研究では、電力の1 Wまでの定格ファイバ結合808 nmのレーザーダイオードが使用されます。
   4. ルート光ファイバを介して試料ステージに向けてレーザービーム。所望のスポットサイズにレーザ光を発散する凸レンズを使用してください。
   5. 標準的な電力計を使用して電力出力を測定し、1 W / ^cm 2の電力を調整します。
   6. IRカメラ（InSbの赤外線カメラ（FLIRシステムズSC4000））をオンにして、レーザーがフォーカスされている6ミリメートルスポットの温度を読み取るために、関心領域（ROI）スポット領域を設定します。
   7. レーザー光の焦点に興味を十分に配置します。サンプルのベースライン温度を記録します。レーザーをオンにして、温度を記録しながら5分間連続して十分に照射。
   8. 5分後、レーザーをオフにして、それが戻っ開始基準温度に冷却するまで、ウェルの温度を記録し続けています。
      注：熱と各​​サスペンションを冷却三回と計算時間にわたる平均温度変化。光熱変換のための陰性対照としての代わりに、NP懸濁液を25℃の脱イオン水を使用してください。
2. ポリマーフィルムの光熱伝達
   1. 25℃に保ったホットプレートにポリマー被覆ITOガラススライドを転送します。
   2. レーザーの電源をオンにして、それが数分間温めます。この研究では、電力の1 Wまでの定格ファイバ結合808 nmのレーザーダイオードが使用されます。
   3. ルート光ファイバを介して試料ステージに向けてレーザービーム。所望のスポットサイズにレーザ光を発散する凸レンズを使用してください。
   4. 標準的な電力計を使用して電力出力を測定し、1 W / ^cm 2の電力を調整します。
   5. IRカメラ（InSbの赤外線カメラ（FLIRシステムズSC4000））をオンにして、レーザーがフォーカスされている6ミリメートルスポットの温度を読み取るために、関心領域（ROI）スポット領域を設定します。
   6. レーザー光の焦点位置にフィルムを配置します。 Bを記録サンプルのaseline温度。レーザーをオンにして、温度を記録しながら5分間連続してサンプルを照射します。
   7. 5分後、レーザーをオフにして、それが戻っ開始基準温度に冷却するまで試料の温度を記録し続けています。
      注意：熱と各フィルムを冷却三回と時間をかけて平均温度変化を計算。光熱変換のためのネガティブコントロールとして25℃での裸のITOスライドを使用してください。

結果

M1とM2を生じる反応プロトコルは、図1に示されている。モノマーは^、1 H及び¹³ C NMRスペクトル、融点、および元素分析によって特徴づけることができます。 ¹ H NMRスペクトルは、原子およびそれらの電子環境の接続性に関する情報を提供します。このように、それは日常の反応が正常に完了していることを確認するために使用され?...

ディスカッション

この作業では、電気活性ポリマーNPは、癌治療のための潜在的なPTT剤として合成されています。 NPの調製は、乳化重合に続いて、モノマーの合成から出発し、記載されています。かかるEDOT及びピロールのような電気活性ポリマーを用いたNPの調製は以前に記載されているが、この論文では、このプロセスは、より大きな、より複雑な単量体に拡張することができることを実証し、ユニークな?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm diameter platinum working electrode	CH Instruments	CH102	Polished using very fine sandpaper
3,4-ethylenedioxythiophene	Sigma-Aldrich	483028	Purified by vacuum distillation
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) 98%	Alfa Aesar	L11939
505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific™	FB505110	1/8 “ tip and rated at 500 watts
808 nm laser diode	ThorLabs	L808P1WJ	Rated at 1 W
Acetonitrile anhydrous 99%	Acros	61022-0010
Avanti J-26 XPI	Beckman Coulter	393127
Bromohexane 98%	MP Biomedicals	202323
Dialysis (100,000) MWCO	SpectrumLabs	G235071
Dimethyl sulfoxide 99% (DMSO)	BDH	BDH1115
Dimethylformamide anhydrous (DMF) 99%	Acros	326870010
Dodecyl benzenesulfonate (DBSA)	TCI	D0989
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)	Corning	10-013 CV
EMS 150 TES sputter coater	Electron Microscopy Sciences
Ethanol (EtOH) 100%	BDH	BDH1156
ethyl 4-bromobutyrate (98%)	Acros	173551000
Ethyl acetate 99%	Fisher	UN1173
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
Helios NanoLab 400	FEI
Hexane	Fisher	H306-4
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	A142-212
Hydroquinone 99.5%	Acros	120915000
Hydrozine anhydrous 98%	Sigma-Aldrich	215155
Indium tin oxide (ITO) coated galss	Delta Technologies	CG-41IN-CUV	4-8 Ω/sq
Iron chloride 97% FeCl3	Sigma-Aldrich	157740
Magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	593295	Dried at 100 oC
SKOV-3	ATCC	HTB-26
Methanol	BDH	BHD1135
n-Butlithium (2.5 M)	Sigma-Aldrich	230707	Pyrophoric
Poly(styrenesulfonate-co-malic acid) (PSS-co-MA) 20,000 MW	Sigma-Aldrich	434566
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619	Dried at 100 oC
Potassium hydroxide	Alfa Aesar	A18854
Potassium iodide	Fisher	P410-100
RO-5 stirplate	IKA-Werke
SC4000 IR camera	FLIR
Synergy H4 Hybrid Reader	Biotek
Tetrabutylammonium perchlorate (TBAP) 99%	Sigma-Aldrich	3579274	Purified by recrystallization in ethyl acetate
Tetrahydrofuran anhydrous (THF) 99%	Sigma-Aldrich	401757
tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0)	Sigma-Aldrich	216666	Moisture sensitive
Thermomixer	Eppendorf
USB potentiostat/galvanostat	WaveNow	AFTP1
Zetasizer Nano Zs	Malvern		Optical Arrangment 175o
Zinc chloride (1 M) ZnCl2	Acros	370057000