ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

要約

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

要約

脳細胞の異なるタイプ、例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体およびミクログリアにおける遺伝子発現の検出は、免疫染色のために特異的な一次または二次抗体の不足によって妨げられることができます。ここでは、第三の遺伝子によってコードされるタンパク質に対する高い特異性の抗体を用いて免疫染色に続いて2遺伝子特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーション二重蛍光を使用して、同じ脳切片における三つの異なる遺伝子の発現を検出するためのプロトコルを説明します。 Aspartoacyclase（ASPA）遺伝子の突然変異は稀な人間白質疾患につながることができます-カナバン病は-オリゴデンドロサイトとミクログリアではなく、星状細胞およびニューロンにおいて発現されると考えられています。しかし、脳内ASPAの正確な発現パターンは、まだ確立されていません。このプロトコルは、ASPAは、成熟オリゴデンドロサイトaのサブセットに発現していることを決定することができましたNDは、一般に、遺伝子発現パターンの研究に広く適用することができます。

概要

中枢神経系（CNS）において最も豊富な細胞であるグリア細胞は、希突起膠細胞（CNSのミエリン形成細胞）、オリゴデンドロサイト前駆体（以下、「NG2細胞」としても知られているオプス）、アストロサイト及びミクログリアを含みます。グリア細胞と神経疾患¹におけるそれらの潜在的な役割の機能への関心の高まりがあります。例えば、カナバン病（CD）は、年齢^2,3の10年前に、通常は死に至る、海綿状白質ジストロフィーとニューロンの進行性の喪失と乳児期早期での出発遺伝性神経変性疾患です。大幅CDにASPAアクティビティ^4を減少につながるAspartoacyclase（ASPA）遺伝子の変異が同定されています。 ASPAは、酢酸およびアスパラギン酸^5-7を生成^し 、N-アセチルアスパラギン酸（NAA）の脱アセチル化を触媒する酵素で、非常に脳に集中する分子です。多くのCD患者起因ASPA ACの欠如にNAAのより高いレベルを示しますtivity。いくつかの研究は、NAA由来の酢酸は、開発やCD ^3,5,6を破壊するNAAの故障による開発中に減少ミエリン合成に起因する時の脳内の脂肪酸/脂質の主要な供給源であり得ることが推測しています。

ASPAは、主に脳の腎臓、肝臓および白質で発見され、そしてCDで南極特別保護地区の重要な役割を与えられた、脳におけるこの酵素の細胞発現は、いくつかの研究室によって研究されてきました。脳内ASPA酵素活性を調べることによって、以前の研究では、脳の発達の間ASPA活性の増加は、髄鞘形成^8-10の時間経過に匹敵することを見出しました。細胞レベルでは、酵素活性のためだけでなく、in situハイブリダイゼーション（ISH）および免疫組織化学（IHC） でのアッセイは、ASPAは、主に脳内のオリゴデンドロサイトではなく、ニューロンやアストロサイト^11月16日に発現していることを示唆している分析します。 ASPAはまたかもしれないことがわかった少数の研究CNS ^12,14にミクログリアで発現させること。 OPでASPA発現に対するこれまでのデータは限られています。ニューロン、アストロサイト、OPは、新たに形成されたオリゴデンドロサイト、ミエリンオリゴデンドロサイト、ミクログリア、内皮細胞、および周皮細胞などのマウス大脳皮質における異なる種類の細胞のトランスクリプトームは、RNAの塩基配列決定¹⁷で分析した最近の研究によると、 南極特別保護地区はもっぱらオリゴデンドロサイトに発現しています、特にオリゴデンドロサイトのミエリン中（http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html）。脳内のASPA発現パターンに、これらの研究にもかかわらず、不確定要素の数が残っています。

別の技術は、遺伝子発現パターンを研究するために使用することができます。 IHCは、組織切片における遺伝子発現の機能的産物（ すなわち、タンパク質）を検出するために一般的に使用される方法です。そのアプリケーションおよび特異性は、対象トンであるため、その大きな有用性にもかかわらず、この手法には限界があります必要な抗体の利用可能性と特異O。比較により、ISHは、mRNAレベルでの任意の遺伝子の発現を明らかにすることができるという利点を有します。しかしながら、特定の細胞型への遺伝子の発現を局在化するために、同時に複数のプローブを使用することは技術的に困難であることができます。この記事では、我々は、タンパク質の蛍光免疫標識とin situハイブリダイゼーション二重蛍光RNAを合成するプロトコルを記述します。我々は、マウス脳におけるアスパの発現パターンを調べるために、技術のこのセットを使用しています。この方法は、共焦点顕微鏡を用いた遺伝子発現の正確な研究を可能にします。

プロトコル

倫理の声明：
マウスの飼育と取り扱いは、動物（科学的手順）イギリスとその改正規則2012年の法1986に準拠し、英国内務省の規制やUCL倫理委員会のガイドラインに従っています。

注：すべての溶液をジエチルピロカーボネート（DEPC）で作られるべきである - あらゆる残留のRNaseを破壊するために処理された水。 DEPC処理のため、すべてのDEPC球はDEPCを分解するために、オートクレーブ後、消失するまでDEPC（リットル当たり1ミリリットル）を追加し、勢いよく振ります。

1. RNAプローブ合成

1. 注意：ホルムアミドを取り扱う際は、個人用保護具（P​​PE）を着用し、安全キャビネットを使用します。 50％（v / v）の脱イオン化ホルムアミド、200mMのNaClをDEPC処理した脱イオン水、5mMのEDTA、10mMのトリス塩酸pH7.5で、5mMののNaH ₂ PO _4、5mMの_の Na ₂ HPO _4、：ハイブリダイゼーション緩衝液を調製します0.01 mg / mlで酵母tRNA、1×デンハルトsoluti上、およびデキストラン硫酸w / vの10％。
2. RNAポリメラーゼプロモーターを有するプラスミド中の目的の遺伝子のcDNA配列を含むDNAクローンを選択します。この例では、 アスパためのT7およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーター（ 補足図1）と、のpCMV-SPORT6クローン、IRAVp968C0654D（ジェンaccessionBC024934）を使用します。
3. テンプレートとして線状化プラスミドDNAを準備します。
   1. T7およびSP6のユニバーサルプライマーを用い、製造業者のプロトコルおよびシーケンスに従って小規模プラスミド精製キットでプラスミドを抽出し、DNAクローンを成長させます。
   2. cDNAのセンス鎖の5 '末端で切断する制限酵素で1020μgのプラスミドDNAを消化。この例では、のpCMV-SPORT6- アスパプラスミドを消化するために100単位のSal Iを使用します。 37 ^O℃で1.5時間インキュベートします
   3. プラスミドが完全に直線化されていることを確認するためにアガロースゲル上で少量を実行します。
4. 浄化しますフェノール - クロロホルムを用いて線状化プラスミド。
   1. 3 M酢酸ナトリウム1/10容量の、10mMのトリスHCl（pH8.0）での1ボリュームを追加 - 平衡化フェノールおよびクロロホルム/イソアミルアルコール（IAA）の1ボリューム（24：1）。
   2. 室温で1分間、16,000×gで遠心分離（20から25°C、RT）と、上部の水相を抽出します。
   3. 1分間16,000×gでクロロホルム/ IAA、遠心分離機の1ボリュームを追加し、上部の水相を抽出します。
   4. 手順を繰り返し1.4.3。
   5. 2容量のエタノールを加え、1時間またはO / N -20 ^{O C}で残します。
   6. 10分間、4℃、16,000×gで遠心分離します。上清を捨てます。
   7. 70％冷エタノールでペレットを洗浄し、TE中2.51μl当たり近似的1μgのcDNAを（10mMのトリス-HCl、1mM EDTA pH7.5）をで再懸濁します。
5. 二つのプローブ、ジゴキシゲニン（DIG）で標識した1およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で他を合成します。
   1. 抗SEを作るために適切なRNAポリメラーゼを選択しますNSEプローブ（標的mRNAに相補的な）。この例では、 アスパプローブを作製するためにT7 RNAポリメラーゼを使用します。
   2. in vitro転写反応を準備します。1線形化μgのDNA、4.0μlの5×転写バッファー、100mMのDTTの6.0μlを、10倍DIGまたはFITC RNA標識ミックス含むdNTPの2.0μlを、1μlのRNase阻害剤、および20追加- 40 RNAポリメラーゼのユニット。 DEPC処理水で20μlの最終容量を構成しています。
   3. 1.5時間^{、37°C ​​の}でインキュベートします。
6. 1.0％アガロースゲル上で転写反応のRUN1μlを、反応が働いていることを確認します。ゲルは、直鎖状鋳型とプローブの明るいバンドを示すべきです。
7. ハイブリダイゼーション緩衝液で100μlにボリュームを構成し、-80℃で10μlのアリコートを保存します。

2.潅流、固定および組織のコレクション

1. 注意：固体と両方、パラホルムアルデヒド（PFA）を取り扱います水性、PPEを着用し、安全キャビネットを使用します。熱（55℃）を用いて、PFA 1Xにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（w / v）の4％を溶解して、ホルムアルデヒド溶液を調製します。ろ紙とのホルムアルデヒド溶液をフィルタリングします。
2. 蒸留水中のスクロース（w / v）の20％を溶解させてスクロース溶液を調製し、0.1％（v / v）のDEPC溶液を加えます。緩い蓋をした後、オートクレーブを室温でO / Nのままにしておきます。
3. 末端ペントバルビタールの腹腔内注射（50mg / kgの）によって、マウスをanaesthetize。つま先のピンチによって麻酔の深さを評価し、引っ込め反射の不在は深い麻酔を示しています。
4. マウスは深い麻酔下になると、胸郭の下に切開を行い、心臓を露出するためにそれを持ち上げ、両側の肋骨を切断。
5. 心臓の左心室に25-G針を挿入します。心臓の右心房内の小さな切開を行います。
6. 20 mlのPBSと40mLをホルムアルデヒド溶液で動物を灌流。 P30および古いのためのマウスは12 ml /分の灌流速度を使用するが、若い動物は、より低いレートの使用のために（7 - 10ml /分）を。
7. 脳を解剖。
   1. 耳から切断された後部を行うことで、手術用ハサミでマウスの頭部を切断。皮膚中の尾側正中切開を行い、頭蓋骨から皮膚を削除する吻方働きます。
   2. 尾の部分から出発し、正中線に沿って頭蓋骨の上部を通って、アイリスハサミで目の間で切断。骨板の片面毎に傾けるとピンセットでそれをスナップすることにより頭頂および前頭骨プレートを取り外します。
   3. 静かにピンセットで前眼部から上方に脳を傾け、視神経およびその他の脳神経を切りました。静かに頭蓋骨から脳を持ち上げます。
8. マウス冠状脳マトリックス中に脳を置きます。フェザーカミソリで3約4mm片に脳をスライス。
9. 4％PFA溶液にスライスを移し、4℃でO / Nインキュベートします。
10. 転送脳スライスDEPC処理した20％スクロース溶液に4℃でO / Nインキュベート
11. ドライcryomouldに各脳スライスを置き、最適な切削温度（OCT）培地で囲み、ドライアイス上で凍結。 -80℃で保管してください。

3.凍結切片

1. クライオスタットで凍結組織の15μmのセクションをカットし、顕微鏡スライド上にセクションを集めます。必要な場合は、DEPC処理PBSでセクションを濡らし、微細な絵筆でそれらを平らに。
2. 組織がスライドに付着することを確実にするために約1時間乾燥させるためにスライドを残します。

4.ハイブリダイゼーション

1. 150mMのNaCl、15mMののNa ₃ C ₃ H _{5 O（COO）3（=} 1×食塩水クエン酸ナトリウム）、50％（v / v）のホルムアミド、0.1％（v / v）のTween- 65℃の洗浄緩衝液を調製します20。
2. 100 mMのマレイン酸、150mMのNaCl、0.1％（v / v）のトゥイーン20、pHが7.5：MABTバッファを準備します。
3. 二つのプローブ（DIG標識およびFITC-ラブレを希釈ハイブリダイゼーション緩衝液中のd）1 /千65℃にあらかじめ温め、よく混ぜます。
4. 、各スライド上にハイブリダイゼーション混合物の約300μLを適用coverslipwithオーブン焼き^（200°Cの ）カバースリップし、加湿チャンバー内で65℃でO / Nインキュベートします。
5. 予熱した洗浄緩衝液を含むコプリンジャーにスライドを転送します。洗浄緩衝液で65℃で二回30分間スライドを洗浄します。
6. RTで10分間MABTで3回スライドを洗浄します。

FITCプローブの5可視化

1. ISHは、ブロッキング緩衝液の準備：2％ブロッキング試薬及び10％熱不活性化ヒツジ血清とMABTを。
2. オプション：必要な抗体溶液の量を減らすために、スライド上の組織切片の周りに円を描くように疎水性のペンを使用します。
3. ISHは、加湿チャンバー内でブロッキング緩衝液で室温で1時間のためのスライドをインキュベートします。
4. 西洋ワサビペルオキシダーゼ（POD）で4℃でスライドO / Nインキュベート - コンジュゲートD抗FITC抗体を1/500（v / v）のISHでブロッキング緩衝液に希釈しました。
5. 0.1％（v / v）のTween-20を（PBST）を含むPBSを含むコプリンジャーにスライドを配置します。 PBSTで10分間3回洗浄し、新鮮なPBSTで毎回交換してください。
6. 使用直前に、増幅希釈剤に100倍に希釈して蛍光チラミドを準備します。この例では、FITC-チラミドを使用します。
7. スライドにこれを追加し、室温で10分間放置します。
8. コプリンジャーにスライドを置き、10分間PBSTで3回洗浄します。

DIGプローブの6.可視化

1. 0.1 Mトリス塩酸pHが8.2を準備します。
2. ISHを室温で1時間ブロッキング緩衝液でスライドをインキュベートします。
3. アルカリホスファターゼ（AP）と4℃でスライドO / Nインキュベート1 / 1,500希釈した抗DIG抗体が（v / v）のISHでブロッキング緩衝液抱合。
4. 10分間MABTで3回洗浄します。
5. RTで5分間、0.1Mトリス-HCl pHは8.2で二回洗浄します。
6. 使用直前に、0.1 MトリスpHを8.2に錠剤を溶解することによりファストレッド溶液を調製。 0.22μMのフィルターを通してソリューションをフィルタリングします。
7. 加湿チャンバー内のファストレッド溶液を用いて37℃でスライドをインキュベートします。最適な開発のための時間が変化すると、沈殿物の形成を監視するために、蛍光顕微鏡を用いて定期的にスライドを確認してください。 3時間 - この例では、2の後に反応を停止。
8. 10分間PBSTで3回洗浄します。

7.免疫組織化学

1. IHCブロッキング緩衝液を準備します：10％PBSTで（一次抗体のホストに異なる種の）（v / v）の血清を。
2. IHCは、加湿チャンバー内で室温で1時間ブロッキング緩衝液でスライドをインキュベートします。
3. 一次抗体を準備します（一次抗体のホストに異なる種の）5％血清をPBST中の適切な希釈で一次抗体を希釈します。この例では、1/400（v / v）の希釈でウサギ抗OLIG2抗体を使用しています。
4. 4°CO / Nで一次抗体溶液中でインキュベートします。
5. 10分間PBSTで3回洗浄します。
6. 二次抗体を調製する：この例では、0.1％（v / v）のヘキスト33258（異なる一次抗体の宿主への種の）5％PBST中の適切な希釈で（v / v）の血清フルオロフォア結合二次抗体を希釈、1 /千（v / v）の希釈で二次抗体Alexa647ロバ抗ウサギを使用します。
7. 室温で1時間、二次抗体溶液中でインキュベートします。
8. 10分間PBSTで3回洗浄します。

8.取り付け

1. 部分的に室温でスライドを乾燥させ、そして蛍光マウンティング培地でマウントします。ファストレッドための570nmで、FITC用の488nm、OLIG2の免疫標識のための647 nmおよびヘキスト用の350nmで：10X下の共焦点顕微鏡では、その後、20X、次の励起波長で4つの異なるチャネルを使用して63X目標を画像を乾燥し、するスライドを残します。

結果

この記事では、マウス脳切片における免疫標識に続いて二重蛍光ISHのための方法を説明します。このプロトコルの簡単な説明は、最初のステップは、 アスパおよびMBP（ミエリン塩基性タンパク質 ）に特異的なプローブを合成することで、図1に示されています。プローブが合成されたことを確認するには、各反応の小アリコートをアガロー?...

ディスカッション

このプロトコルは、免疫染色に続いてin situハイブリダイゼーション二重RNAのためのステップバイステップの手順を提供します。我々は、 アスパは、いくつかの脳の領域で成熟したオリゴデンドロサイトに発現していることを確認するために、このプロトコルを使用しています。

この多段階の手順は、感度に影響を与えることができ、避けるべきである多く...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Miniprep	Qiagen	27104
Deionized formamide	Sigma	F9037	for ISH blocking buffer
Sodium chloride	Sigma	S3014
Trizma Base	Sigma	T1503
Hydrochloric acid	VWR International	20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt's solution	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Aspa cDNA clone	Source Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
Sodium acetate	Sigma	S2889
Equilibrated phenol	Sigma	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Isoamyl alcohol	Aldrich	496200
Ethanol	VWR International	20821.321
T7 RNA polymerase	Promega	P4074
Transcription buffer	Promega	P118B
100 mM DTT	Promega	P117B
UTP-DIG NTP mix	Roche	11277073910
Rnasin	Promega	N251B
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Filter paper	Fisher scientific	005479470
Sucrose	Sigma	59378
Diethyl pyrocarbonate	Sigma	D5758
Pentobarbitone	Animalcare Ltd	BN43054
Dissecting scissors	World Precision Instruments	15922
25 gauge needle	Terumo	300600
Peristaltic pump	Cole-Parmer Instrument Co. Ltd	WZ-07522-30
Iris scissors	Weiss	103227
No.2 tweezers	World Precision Instruments	500230
Coronal Brain Matrix	World Precision Instruments	RBMS-200C
Razor blade	Personna Medical	PERS60-0138
OCT medium	Tissue tek	4583
Cryostat/microtome	Bright
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	for 65 °C wash buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Heat-inactivated sheep serum	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
.22 µM filter	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody	Life technologies	A-31573	1:1,000
bisBenzimide H 33258	sigma	B2883
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica