JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Аннотация

Обнаружение экспрессии генов в различных типах клеток головного мозга , например, нейроны, астроциты, олигодендроциты, олигодендроцитов и микроглии предшественников, может быть затруднено из - за отсутствия конкретных первичных или вторичных антител для иммунологического окрашивания. Здесь мы опишем протокол для определения экспрессии трех различных генов в той же секции головного мозга с использованием двойной флуоресценции в гибридизация с двумя геноспецифических зондов с последующим иммунным окрашиванием с антителом высокой специфичностью , направленной против белка , кодируемого геном третьего. Aspartoacyclase (ООРА) генов, мутации которых могут привести к редкой человеческой болезни белой материи - болезнь Канавана - Считается , что выражается в олигодендроцитов и микроглии , но не в астроциты и нейроны. Тем не менее, до сих пор не установлена ​​точная картина экспрессии ASPA в головном мозге. Этот протокол позволил нам определить, что ООРА выражается в субпопуляции зрелых олигодендроцитов ае он может быть как правило, применяется к широкому спектру исследований характера экспрессии генов.

Введение

Глиальные клетки, которые являются наиболее распространенными клеток в центральной нервной системе (ЦНС), включают в себя олигодендроцитов (в myelinating клетки центральной нервной системы), олигодендроциты предшественники (OPS, также известные как "NG2 клетки"), астроциты и микроглии. Существует растущий интерес к функции глиальных клеток и их потенциальной роли в неврологических заболеваний 1. Например, болезнь Канавана (CD) является наследственным нейродегенеративным заболеванием начиная с раннего детства с губчатой ​​Leukodystrophy и прогрессирующей потерей нейронов, что приводит к смерти , как правило , до 10 лет , 2,3. Мутации в гене Aspartoacyclase (ООРА) , которые приводят к значительно сниженную активность ASPA 4 в КР были идентифицированы. ООРА представляет собой фермент , катализирующий деацетилирование N-ацетиласпартата (НАА), молекула высоко концентрированным в головном мозге, генерируя ацетат и аспартат 5-7. Многие пациенты CD показывают более высокие уровни NAA из-за отсутствия ООРА переменного токательность. Некоторые исследования предполагают , что НАА полученный ацетат может быть основным источником жирных кислот / липидов в головном мозге в процессе разработки и CD могут возникнуть в результате снижения синтеза миелина в процессе развития , вызванного отказом НАА быть разбиты 3,5,6.

ООРА встречается преимущественно в почках, печени и белого вещества головного мозга, а также учитывая важную роль в ООРА CD, сотовая экспрессия этого фермента в мозге было изучено несколько лабораторий. Глядя на ферментативную активность ООРА в головном мозге, более ранние исследования показали , что увеличение активности ООРА во время развития мозга параллельно временной ход миелинизации 8-10. На клеточном уровне, анализы для ферментативной активности, а также в гибридизация (МОГ) и иммуногистохимии (IHC) , в анализ позволяет предположить , что ООРА в основном экспрессируется в олигодендроциты в головном мозге , но не в нейронах или астроцитов 11-16. Несколько исследований показали, что ООРА может такжевыражается в микроглии в центральной нервной системе 12,14. До сих пор данные по экспрессии ООРА в ФОС ограничены. Согласно данным недавнего исследования , где Транскриптом различных типов клеток в коре головного мозга мыши , включая нейроны, астроциты, ФОС, новообразованных олигодендроцитов, myelinating олигодендроцитов, микроглии, эндотелиальные клетки, и перицитами анализировали с помощью РНК секвенирования 17, экспрессируется исключительно ООРА в олигодендроциты , в частности, в myelinating олигодендроциты (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Несмотря на эти исследования по ООРА паттерна экспрессии в головном мозге, ряд неопределенностей, остаются.

Различные методы могут быть использованы для изучения паттернов экспрессии генов. IHC является широко используемый метод для определения функционального продукта (т.е. белок) генной экспрессии в срезах ткани. Несмотря на большую полезность, этот метод имеет свои ограничения, как его применение и специфичность могут быть тО наличии и специфичности антитела необходимо. Для сравнения, ISH имеет то преимущество, которое позволяет выявить экспрессию любого гена на уровне мРНК. Тем не менее, это может быть технически сложно использовать несколько зондов в то же время для того, чтобы локализовать экспрессию генов в специфических типах клеток. В этой статье мы опишем протокол сочетающую двойной РНК флуоресцентной гибридизации in - situ с флуоресцентной immunolabelling белка. Мы использовали этот набор методов для изучения характера экспрессии Aspa в мозге мыши. Этот метод позволяет точно Изучение экспрессии генов с использованием конфокальной микроскопии.

протокол

Заявление по этике:
Мышь нива и регулировать в соответствии с правилами Министерства внутренних дел Великобритании и руководств UCL комитет по этике, с соблюдением животных (научные процедуры) Закон 1986 Соединенного Королевства и ее изменение регламента 2012 года.

Примечание: Все решения должны быть сделаны с диэтилпирокарбонат (DEPC) - обрабатывают водой, чтобы уничтожить любые остаточные РНКазы. Для лечения DEPC, добавьте DEPC (1 мл на литр), энергично встряхивают, пока все DEPC глобулы не исчезли затем автоклав ухудшить DEPC.

1. РНК зонд Синтез

  1. ОСТОРОЖНО: При обращении формамид, носить средства индивидуальной защиты (СИЗ) и использовать камеру безопасности. Подготовка буфера гибридизации: ДЭФЦ обработанной деионизированной воды с 50% (об / об) деионизированная формамид, 200 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 5 мМ NaH 2 PO 4, 5 мМ Na 2 HPO 4, 0,01 мг / мл дрожжевой тРНК, 1 × Soluti Денхардтана, и 10% вес / объем сульфата декстрана.
  2. Выберите клон ДНК, который содержит последовательности кДНК представляющего интерес гена в плазмиде с РНК-полимеразы промоторов. Для этого примера, используйте клон PCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), с Т7 и SP6 РНК - полимеразы промоутеров для Aspa (Дополнительный рисунок 1).
  3. Приготовьте линеаризованной плазмиды ДНК в качестве матрицы.
    1. Grow клон ДНК, экстракт плазмиды с помощью набора для очистки плазмидной малого в соответствии с протоколом производителя и последовательность с Т7 и SP6 универсальных праймеров.
    2. Дайджест +1020 мкг плазмидной ДНК с помощью фермента рестрикции, который разрезает на 5'-конце смысловой цепи кДНК. Для этого примера, используйте 100 единиц Sal I переваривается плазмиды PCMV-SPORT6- Aspa. Инкубируют в течение 1,5 ч при 37 о С.
    3. Выполнить небольшой аликвоты на агарозном геле, чтобы проверить, что плазмиду полностью линеаризуется.
  4. очищаютлинеаризованные плазмида с использованием фенол-хлороформ.
    1. Добавьте 1/10 объема 3 М ацетата натрия, один объем 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) - уравновешенной фенол и один объем хлороформа / изоамилового спирта (IAA) (24: 1).
    2. Центрифуга при 16000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре (20 - 25 ° С, РТ) и извлекать верхнюю водную фазу.
    3. Добавьте один объем хлороформа / IAA, центрифуге при 16000 х г в течение 1 мин и извлечь верхнюю водную фазу.
    4. Повторите шаг 1.4.3.
    5. Добавляют 2 объемов этанола и оставляют при -20 ° С в течение 1 ч или O / N.
    6. Центрифуга при 16000 х г при 4 ° С в течение 10 мин. Удалите супернатант.
    7. Промывают осадок с 70% -ным холодным этанолом и вновь приостановить на аппроксимативно 1 мкг кДНК в 2,5 мкл в ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5).
  5. Синтезируют два зонда, помеченный дигоксигенином (DIG), а другой с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC).
    1. Выберите подходящую РНК-полимеразы, чтобы сделать анти-SENSE зонд (комплементарны мРНК-мишени). Для этого примера, используют Т7 РНК - полимеразы , чтобы сделать Aspa зонд.
    2. Готовят реакции в пробирке транскрипции: добавить 1 мкг линеаризованной ДНК, 4,0 мкл 5 х буфера транскрипции, 6,0 мкл 100 мМ DTT, 2,0 мкл 10х DIG или ФИТЦ РНК маркировки смеси , содержащей дНТФ, 1 ингибитор РНКазы мкл, и 20 - 40 единиц РНК-полимеразы; конечного объема до 20 мкл с помощью DEPC-обработанной воды.
    3. Инкубируют при 37 ° С в течение 1,5 ч.
  6. RUN1 мкл реакции транскрипции на агарозном геле 1,0%, чтобы проверить, что реакция сработала. Гель должен показывать линейный шаблон и яркую полосу зонда.
  7. Сделать объем до 100 мкл с помощью буфера гибридизации и хранить 10 мкл аликвоты при -80 ° С.

2. Перфузия, Фиксирование и тканей Коллекция

  1. ОСТОРОЖНО: При обращении параформальдегида (PFA), как твердых, так иводный, носить средства индивидуальной защиты и использовать камеру безопасности. Подготовка раствора формальдегида растворением 4% (вес / объем) ПФА в 1х растворе фосфатно-буферный раствор (PBS) с использованием тепла (55 ° C). Фильтрация раствора формальдегида с фильтровальной бумагой.
  2. Готовят раствор сахарозы путем растворения 20% (вес / объем) сахарозы в дистиллированной воде и добавляют 0,1% (об / об) раствор DEPC. Оставьте O / N при комнатной температуре с рыхлой крышкой, а затем автоклав.
  3. Терминально анестезию мыши внутрибрюшинно инъекции пентобарбитона (50 мг / кг). Оценка глубины анестезии с помощью пальца щепоткой и отсутствие абстинентного рефлекса указывает на глубокую анестезию.
  4. После того, как мышь находится под глубоким наркозом, сделать надрез под грудной клеткой и прорезать грудной клетки с обеих сторон, поднимите ее, чтобы обнажить сердце.
  5. Вставьте 25-G иглу в левый желудочек сердца. Сделайте небольшой надрез в правое предсердие сердца.
  6. Заливать животное с 20 мл PBS, а затем 40 мл раствора формальдегида. Для P30 и старшемыши, использовать скорость перфузии 12 мл / мин, а для более молодых животных используют более низкую скорость (7 - 10 мл / мин).
  7. Рассеките мозг.
    1. Отрежьте голову мыши с хирургическими ножницами, делая вырезать заднюю из ушей. Сделать хвостового срединный разрез в коже и работать ростральным, чтобы удалить кожу от черепа.
    2. Начиная с каудальной части, прорезают в верхней части черепа вдоль средней линии и между глазами с диафрагмой ножницами. Удалить теменной и лобной кости пластины путем наклона одной стороны костной пластины каждый раз и щелкая его с помощью пинцета.
    3. Осторожно наклоните мозг вверх от передней части с помощью пинцета и отрежьте зрительных нервов и других черепно-мозговых нервов. Аккуратно поднимите мозг из черепа.
  8. Поместите мозг в корональной мыши матрицы мозга. Нарезать мозг в 3 примерно 4 мм штук с перо лезвием бритвы.
  9. Перенесите ломтики в 4% раствора PFA и инкубировать O / N при температуре 4 ° С.
  10. Передача мозгаЛомтики к DEPC обработанных 20% раствора сахарозы и инкубировать o / n при температуре 4 ° С
  11. Поместите каждый кусочек мозга в сухую cryomould, окружит Оптимальная температура резания (ОКТ) среды и заморозить на сухом льду. Хранить при температуре -80 ° С.

3. Cryosectioning

  1. Вырезать участки замороженной ткани 15 мкм в криостате и собирать секции на предметные стекла микроскопа. При необходимости смачивать участки с DEPC обработанных PBS и придавить их с тонкой кистью.
  2. Оставьте слайды высохнуть в течение приблизительно 1 часа, чтобы гарантировать, что ткань прилипает к каретке.

4. Гибридизация

  1. Готовят 65 ° С Промывочный буфер 150 мМ NaCl, 15 мМ Na 3 C 3 H 5 O (СОО) 3 (= 1х солевой раствор цитрата натрия), 50% (об / об) формамида и 0,1% (об / об) Tween- 20.
  2. Подготовьте MABT буфер: 100 мМ малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, 0,1% (об / об) твина-20, рН 7,5.
  3. Разведите два датчика (DIG-меченых и FITC-Лабельг) 1/1000 в буфере для гибридизации предварительно нагревают до 65 ° C и хорошо перемешать.
  4. Применить около 300 мкл гибридизации смеси на каждом слайде, coverslipwith печеным (C 200 о) покровные и инкубировать O / N при 65 ° C в увлажненной камере.
  5. Передача слайдов в банку, содержащую Коплин предварительно нагретом промывочный буфер. Промыть слайдов в течение 30 мин дважды при 65 & deg; C с промывочным буфером.
  6. Вымойте слайды в течение 10 мин три раза MABT при комнатной температуре.

5. Визуализация FITC зонда

  1. Готовят ISH блокирующий буфер: MABT с 2% блокирующего реагента и 10% инактивированной нагреванием сыворотки овцы.
  2. Дополнительно: использовать гидрофобный перо для рисования кругов вокруг срезов ткани на слайд, чтобы уменьшить объем растворов антител, необходимых.
  3. Инкубируйте слайды в течение 1 ч при комнатной температуре с ISH блокирующего буфера в увлажненной камере.
  4. Выдержите в слайдах o / n при 4 ° С с пероксидазой хрена (POD) - конъюгатг анти-ФИТЦ антитело, разведенное 1/500 (об / об) в ISH блокирующем буфере.
  5. Поместите слайды в банку, содержащую Коплин PBS с 0,1% (об / об) Tween-20 (PBST). Промыть 3 раза в течение 10 мин в PBST и заменить свежим PBST каждый раз.
  6. Непосредственно перед использованием готовят флуоресцентного tyramide разбавлением 100 раз в Amplification разбавителе. Для этого примера, используйте FITC-tyramide.
  7. Добавьте это к слайдам и оставьте на 10 минут при комнатной температуре.
  8. Поместите слайды в банку Коплин и промыть 3 раза в PBST в течение 10 мин.

6. Визуализация DIG Probe

  1. Приготовьте 0,1 М Трис- HCl рН 8,2.
  2. Инкубируйте слайды с блокирующим буфером ISH в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Выдержите в слайдах o / n при 4 ° С со щелочной фосфатазы (AP) -conjugated анти-DIG антитело, разведенное 1/1500 (об / об) в ISH блокирующий буфер.
  4. Мытье с MABT в течение 10 минут три раза.
  5. Промыть дважды с помощью 0,1 М Трис-HCl, рН 8,2 в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Непосредственно перед использованием готовят быстрого красный раствор путем растворения таблеток в 0,1 М Трис, рН 8,2. Фильтруют раствор через 0,22 мкм фильтр.
  7. Инкубируйте слайды при температуре 37 ° С с раствором Fast Red в увлажненной камере. По мере того как время для оптимального развития изменяется, проверить слайды регулярно с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы контролировать образование осадка. Для этого примера, остановить реакцию после 2 - 3 ч.
  8. Промыть PBST в течение 10 мин в три раза.

7. Иммуногистохимия

  1. Подготовьте IHC блокирующий буфер: 10% (об / об) сыворотки (другого вида к первичного хозяина антител) в PBST.
  2. Инкубируйте слайды с ВВК блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре в увлажненной камере.
  3. Подготовка первичных антител: разбавить первичное антитело при соответствующем разведении в PBST с 5% сыворотки (другого вида к первичного хозяина антител). Для этого примера, используют кроличье анти-Olig2 антитело при 1/400 (об / об) разбавлении.
  4. Инкубировать в растворе первичного антитела при 4 ° CO / N.
  5. Промыть PBST в течение 10 мин в три раза.
  6. Готовят вторичное антитело: разбавить флуорофор-конъюгированные вторичные антитела при соответствующем разведении в PBST с 5% (об / об) сыворотки (другого вида к первичного хозяина антител) и 0,1% (об / об) Hoechst 33258. Для этого примера используйте ослиного антитела против кроличьего Alexa647 вторичного антитела на 1/1000 (об / об) разбавлении.
  7. Инкубировать в растворе вторичного антитела при комнатной температуре в течение 1 часа.
  8. Промыть PBST в течение 10 мин в три раза.

8. Монтажное

  1. Частично сушить слайды при комнатной температуре, а также монтировать с монтажной средой флуоресценции. Оставьте слайды высохнуть, а затем изображение в конфокальной микроскопии под 10X, 20X и 63X целей с использованием 4-х различных каналов со следующими длинами волн возбуждения: 570 нм для быстрой красный, 488 нм для FITC, 647 нм для OLIG2 immunolabelling и 350 нм для Hoechst ,

Результаты

В данной статье описывается метод двойной ISH флуоресценции с последующим immunolabelling в разделах мозга мыши. Краткое описание этого протокола показан на рисунке 1. Первым шагом было синтезировать зонды , специфичные к Aspa и MBP (основной белок миелина). Для ?...

Обсуждение

Этот протокол предусматривает процедуру шаг за шагом для двойной РНК гибридизация с последующим иммунным окрашиванием. Мы использовали этот протокол для подтверждения того, что Aspa выражается в зрелых олигодендроцитов в нескольких областях мозга.

Эта процеду...

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

Work in the authors' laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
QIAprep MiniprepQiagen27104
Deionized formamideSigmaF9037for ISH blocking buffer
Sodium chlorideSigmaS3014
Trizma BaseSigmaT1503
Hydrochloric acidVWR International20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrousSigmaS8282
Sodium phosphate dibasic dihydrateSigma30435
Yeast tRNARoche10109495001
50x Denhardt's solutionLife Technologies750018
Dextran sulfateSigmaD8906
Aspa cDNA cloneSource BioscienceIRAVp968C0654D
SalINew England BiolabsR0138
Sodium acetateSigmaS2889
Equilibrated phenolSigmaP4557
ChloroformSigma-AldrichC2432
Isoamyl alcoholAldrich496200
EthanolVWR International20821.321
T7 RNA polymerasePromegaP4074
Transcription bufferPromegaP118B
100 mM DTTPromegaP117B
UTP-DIG NTP mixRoche11277073910
RnasinPromegaN251B
ParaformaldehydeSigmaP6148
Filter paperFisher scientific005479470
SucroseSigma59378
Diethyl pyrocarbonateSigmaD5758
PentobarbitoneAnimalcare LtdBN43054
Dissecting scissorsWorld Precision Instruments15922
25 gauge needleTerumo300600
Peristaltic pumpCole-Parmer Instrument Co. LtdWZ-07522-30
Iris scissorsWeiss103227
No.2 tweezersWorld Precision Instruments500230
Coronal Brain MatrixWorld Precision InstrumentsRBMS-200C
Razor bladePersonna MedicalPERS60-0138
OCT mediumTissue tek4583
Cryostat/microtomeBright
Superfrost plus slidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Sodium citrateSigmaS4641for 65 °C wash buffer
FormamideSigma-AldrichF7503
Tween-20Sigma-AldrichP1379
CoverslipsVWR International631-0146
Coplin JarSmith Scientific Ltd2959
Blocking reagentRoche11096176001
Heat-inactivated sheep serumSigmaS2263
Hydrophobic penCosmo BioDAI-PAP-S1:500
α-FITC POD-conjugated antibodyRoche11426346910
TSA™ Plus Fluorescein SystemPerkin ElmerNEL741001KT1:1,500
α-DIG AP-conjugatedRoche11093274910
Fast red tabletsRoche11496549001
.22 µM filterMillexSLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbodyMilliporeAB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibodyLife technologiesA-315731:1,000
bisBenzimide H 33258sigmaB2883
Mounting mediumDakoS3023
Leica SP2 confocal microscopeLeica

Ссылки

  1. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  2. Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
  3. Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
  4. Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
  5. Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
  6. Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
  7. Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
  8. D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
  9. Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
  10. Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
  11. Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
  12. Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
  13. Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
  14. Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
  15. Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
  16. Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
  17. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience109

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены