Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

Résumé

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Résumé

La détection de l' expression du gène dans différents types de cellules du cerveau , par exemple, les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes, les précurseurs d'oligodendrocytes et la microglie, peut être entravée par l'absence d'anticorps primaires ou secondaires spécifiques pour immunocoloration. Nous décrivons ici un protocole pour détecter l'expression de trois gènes différents dans la même section du cerveau en utilisant le double fluorescence par hybridation in situ avec deux sondes spécifiques de gènes , suivie par immunocoloration avec un anticorps de haute spécificité dirigée contre la protéine codée par un troisième gène. Le gène Aspartoacyclase (ASPA), les mutations de ce qui peut conduire à une maladie rare de la substance blanche humaine - la maladie de Canavan - est pensé pour être exprimé dans les oligodendrocytes et la microglie , mais pas dans les astrocytes et les neurones. Cependant, le modèle d'expression précise de ASPA dans le cerveau n'a pas encore été établie. Ce protocole nous a permis de déterminer que l'ASPA est exprimé dans un sous-ensemble des oligodendrocytes matures unee peut être généralement appliqué à une large gamme d'études de motif d'expression génique.

Introduction

Les cellules gliales, qui sont les cellules les plus abondantes dans le système nerveux central (SNC), comprennent oligodendrocytes (les cellules myélinisantes du SNC), les oligodendrocytes précurseurs (PO, aussi connu comme «cellules NG2»), les astrocytes et la microglie. Il y a un intérêt croissant dans les fonctions des cellules gliales et leur rôle potentiel dans les maladies neurologiques ^1. Par exemple, la maladie de Canavan (CD) est une maladie neurodégénérative héréditaire commençant tôt dans l' enfance avec leucodystrophie spongiforme et une perte progressive des neurones, menant à la mort habituellement avant 10 ans de ^2,3 ans. Des mutations du gène Aspartoacyclase (ASPA) qui conduisent à réduire considérablement l' activité ASPA ⁴ CD ont été identifiés. ASPA est une enzyme catalysant la désacétylation du N-acétylaspartate (NAA), une molécule fortement concentrée dans le cerveau, l' acétate de génération et d' aspartate ^5-7. Beaucoup de patients CD présentent des niveaux plus élevés de NAA en raison du manque de ASPA activité. Certaines études avancent que l' acétate NAA dérivé pourrait être une source importante d'acides gras / lipides dans le cerveau au cours du développement et CD peut résulter d' une diminution de la synthèse de la myéline au cours du développement causés par l'échec de NAA être ventilés ^3,5,6.

ASPA se retrouve principalement dans les reins, le foie et la substance blanche du cerveau, et étant donné le rôle important de la ZSPA dans le CD, l'expression cellulaire de cette enzyme dans le cerveau a été étudié par plusieurs laboratoires. En regardant l' activité enzymatique ASPA dans le cerveau, des études antérieures ont constaté que l'augmentation de l'activité ASPA au cours du développement du cerveau est parallèle au cours du temps de myélinisation ^8-10. Au niveau cellulaire, les tests pour l' activité enzymatique ainsi que l' hybridation in situ (ISH) et immunohistochimie (IHC) dans les analyses suggèrent que l' ASPA est principalement exprimé dans les oligodendrocytes dans le cerveau , mais pas dans les neurones ou des astrocytes ^11-16. Quelques études ont montré que ASPA pourrait aussiêtre exprimé dans la microglie dans le SNC ^12,14. Jusqu'à présent, les données sur l'expression ASPA dans les PO sont limitées. Selon une étude récente où transcriptomes de différents types de cellules dans le cortex cérébral de souris , y compris les neurones, les astrocytes, ops, oligodendrocytes nouvellement formés, oligodendrocytes myélinisantes, les microglies, les cellules endothéliales et péricytes ont été analysés par séquençage de l' ARN ^17, ASPA est exclusivement exprimé dans les oligodendrocytes , en particulier dans myélinisantes oligodendrocytes (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). En dépit de ces études sur modèle d'expression ASPA dans le cerveau, un certain nombre d'incertitudes demeurent.

Différentes techniques peuvent être utilisées pour étudier les profils d'expression des gènes. IHC est une méthode couramment utilisée pour la détection du produit fonctionnel ( par exemple, une protéine) d'une expression génique dans des coupes de tissus. En dépit de sa grande utilité, cette technique a des limites que son application et la spécificité sont sujets to la disponibilité et la spécificité de l'anticorps est nécessaire. Par comparaison, ISH a l'avantage d'être capable de révéler l'expression d'un gène au niveau de l'ARNm. Cependant, il peut être techniquement difficile d'utiliser plusieurs sondes en même temps afin de localiser une expression de gènes à des types cellulaires spécifiques. Dans cet article, nous décrivons un protocole combinant ARN double fluorescence hybridation in situ avec fluorescence immunomarquage d'une protéine. Nous avons utilisé cet ensemble de techniques pour examiner le profil d'expression de Aspa dans le cerveau de souris. Cette méthode permet l'étude précise de l'expression génique en utilisant la microscopie confocale.

Protocole

Déclaration d'éthique:
l'élevage et la manipulation de la souris sont conformes à la réglementation UK Home Office et les lignes directrices du comité d'éthique de l'UCL, se conformer à la Loi de 1986 du son Règlement Amendement 2012 Royaume-Uni et les animaux (Scientific Procedures).

NOTE: Toutes les solutions doivent être faites avec le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) - l'eau traitée pour détruire toute RNase résiduelle. Pour le traitement DEPC, ajouter DEPC (1 ml par litre), agiter vigoureusement jusqu'à ce que tous les globules DEPC ont disparu alors autoclave pour dégrader le DEPC.

1. ARN Probe Synthesis

1. ATTENTION: Lors de la manipulation formamide, porter un équipement de protection individuelle (EPI) et utiliser une enceinte de sécurité. Préparer un tampon d'hybridation: traitée au DEPC l' eau déminéralisée avec 50% (v / v) de formamide désionisé, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, 5 mM de NaH ₂ PO _4, 5 mM de Na ₂ HPO _4, 0,01 mg / ml d'ARNt de levure, 1 x Denhardt solutisur, et 10% p / v de sulfate de dextran.
2. Choisir un clone d'ADN qui contient la séquence d'ADNc du gène d'intérêt dans un plasmide avec des promoteurs d'ARN polymerase. Pour cet exemple, utiliser un clone pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), avec T7 et SP6 promoteurs d'ARN polymérase pour Aspa (Figure 1 supplémentaire).
3. Préparer l'ADN de plasmide linéarisé comme matrice.
   1. Cultiver le clone d'ADN, extraire le plasmide avec un kit de purification de plasmide à petite échelle selon le protocole et la séquence du fabricant avec le T7 et des amorces universelles SP6.
   2. Digest 1 020 pg d'ADN de plasmide avec une enzyme de restriction qui coupe à l'extrémité 5 'du brin sens de l'ADNc. Pour cet exemple, utiliser 100 unités Sal I pour digérer le plasmide pCMV-SPORT6- Aspa. Incuber pendant 1,5 h à 37 ^o C.
   3. Exécuter une petite aliquote sur un gel d'agarose pour vérifier que le plasmide est entièrement linéarisé.
4. Purifier leplasmide linéarisées en utilisant du phénol-chloroforme.
   1. Ajouter 1/10 volume de 3 M d'acétate de sodium, d'un volume de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) - phénol équilibré et un volume de chloroforme / alcool isoamylique (IAA) (24: 1).
   2. Centrifuger à 16 000 x g pendant 1 min à température ambiante (20-25 ° C, RT) et extraire la phase aqueuse supérieure.
   3. Ajouter un volume de chloroforme / IAA, centrifugeuse à 16.000 xg pendant 1 min et extraire la phase aqueuse supérieure.
   4. Répétez l'étape 1.4.3.
   5. Ajouter 2 volumes d'éthanol et de laisser à -20 ^° C pendant 1 h ou O / N.
   6. Centrifuger à 16 000 xg à 4 ° C pendant 10 min. Jeter le surnageant.
   7. Laver le culot avec de l'éthanol à 70% froid et remettre en suspension dans approximativement 1 pg d'ADNc par 2,5 ul de TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM d'EDTA, pH 7,5).
5. Synthétiser les deux sondes, l'une marquée avec de la digoxigénine (DIG) et l'autre à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
   1. Sélectionnez l'ARN polymerase appropriée pour rendre l'anti-soisonde nse (complémentaire de l'ARNm cible). Pour cet exemple, utiliser l' ARN polymerase T7 pour faire sonde Aspa.
   2. Préparer la réaction de transcription in vitro: ajouter 1 pg de l'ADN linéarisé, 4,0 ul de 5 tampon de transcription x, 6,0 ul de 100 mM de DTT, 2,0 ul de 10 x DIG ou FITC ARN marquage mélange contenant des dNTPs, 1 inhibiteur de RNase ul, et 20 - 40 unités de l'ARN polymérase; rendre le volume final à 20 pi avec de l'eau traitée par DEPC.
   3. Incuber à 37 ^o C pendant 1,5 heure.
6. ul FONCT1 de la réaction de transcription sur un gel d'agarose à 1,0% pour vérifier que la réaction a fonctionné. Le gel doit montrer le modèle linéaire et une bande brillante de la sonde.
7. Compléter le volume à 100 pi avec un tampon d'hybridation et de stocker 10 aliquotes à -80 ° C.

2. Perfusion, Fixation et collecte de tissus

1. ATTENTION: Lors de la manipulation paraformaldéhyde (PFA), à la fois solide etaqueuse, porter PPE et utiliser une enceinte de sécurité. Préparer une solution de formaldéhyde par dissolution de 4% (p / v) de PFA dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) en utilisant la chaleur (55 ° C). Filtrer la solution de formaldéhyde avec du papier filtre.
2. Préparer une solution de saccharose par dissolution de 20% (p / v) de saccharose dans de l'eau distillée et on ajoute 0,1% (v / v) DEPC. Laissez O / N à température ambiante avec un couvercle lâche puis autoclave.
3. Terminally anesthésier une souris par injection intra-péritonéale de pentobarbital (50 mg / kg). Évaluer la profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil et l'absence de réflexe de retrait indique une anesthésie profonde.
4. Une fois que la souris est sous anesthésie profonde, faire une incision sous la cage thoracique et couper à travers la cage thoracique des deux côtés, soulevez-le pour exposer le cœur.
5. Insérer une aiguille de 25 G dans le ventricule gauche du cœur. Faire une petite incision dans l'oreillette droite du cœur.
6. Perfuser l'animal avec 20 ml de PBS, puis 40 ml de solution de formaldéhyde. Pour P30 et plussouris, utiliser un taux de 12 ml / min de perfusion, mais pour les animaux plus jeunes utilisent un taux inférieur (7-10 ml / min).
7. Disséquer le cerveau.
   1. Sever la tête de la souris avec des ciseaux chirurgicaux en faisant un postérieur de coupe des oreilles. Faire une incision médiane caudale dans la peau et travailler rostrale pour enlever la peau du crâne.
   2. A partir de la partie caudale, couper à travers le sommet du crâne le long et la ligne médiane entre les yeux avec des ciseaux Iris. Retirer le pariétal et les plaques d'os frontal en inclinant un côté d'une plaque d'ostéosynthèse à chaque fois et enclenchant hors avec des pincettes.
   3. Inclinez doucement le cerveau vers le haut de la partie antérieure avec des pincettes et couper les nerfs optiques et d'autres nerfs crâniens. Soulevez doucement le cerveau sur le crâne.
8. Placer le cerveau dans une matrice de cerveau coronale de la souris. Trancher le cerveau en 3 environ 4 mm pièces avec une lame de rasoir plume.
9. Transférer les tranches dans une solution PFA 4% et incuber O / N à 4 ° C.
10. Transfert cerveautranches d'traitée au DEPC solution à 20% de saccharose et incubent O / N à 4 ° C
11. Placez chaque tranche de cerveau dans un cryomould sec, entourer de la température de coupe optimale (OCT) à moyen et à geler sur la glace sèche. Conserver à -80 ° C.

3. Cryosectioning

1. Couper 15 um sections de tissu congelé dans un cryostat et de recueillir les sections sur des lames de microscope. Si nécessaire, mouiller les sections avec DEPC traitées PBS et les aplatir avec un pinceau fin.
2. Laisser les lames sécher pendant environ 1 heure pour faire en sorte que le tissu adhère à la lame.

4. hybridation

1. Préparer 65 ° C Tampon de lavage: 150 mM de NaCl, 15 mM de Na ₃ C ₃ H ₅ O (COO) ₃ (= 1 x citrate de sodium salin), 50% (v / v) de formamide et 0,1% (v / v) de Tween 20.
2. Préparer un tampon MABT: acide maléique 100 mM, NaCl 150 mM, 0,1% (v / v) de Tween-20, pH 7,5.
3. Diluer les deux sondes (DIG marqué et FITC-labelled) 1/1000 dans un tampon d'hybridation préchauffé à 65 ° C et bien mélanger.
4. Appliquer environ 300 pi de mélange d'hybridation sur chaque diapositive, coverslipwith (200 ^o C) des lamelles cuites au four et incuber O / N à 65 ° C dans une chambre humidifiée.
5. Transférer les lames dans une jarre Coplin contenant un tampon de lavage préchauffé. Laver les lames pendant 30 minutes deux fois à 65 ° C avec un tampon de lavage.
6. Laver les lames pendant 10 minutes trois fois avec MABT à la température ambiante.

5. Visualisation de la FITC Probe

1. Préparer un tampon de blocage ISH: MABT avec 2% de réactif de blocage et du sérum inactivé à la chaleur 10% de brebis.
2. En option: utiliser un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour de coupes de tissu sur la lame pour réduire le volume des solutions d'anticorps nécessaires.
3. Incuber les lames pendant 1 heure à température ambiante avec un tampon de blocage ISH dans une chambre humidifiée.
4. Incuber les lames O / N à 4 ° C avec une peroxydase de raifort (POD) - conjuguéd anticorps anti-FITC dilué au 1/500 (v / v) dans un tampon de blocage ISH.
5. Placer les lames dans une jarre de Coplin contenant du PBS avec 0,1% (v / v) de Tween-20 (PBST). Lavez 3 fois pendant 10 minutes dans PBST et le remplacer par du PBST frais à chaque fois.
6. Immédiatement avant utilisation, préparer le tyramide fluorescent en diluant 100 fois dans le diluant Amplification. Pour cet exemple, utilisez FITC-tyramide.
7. Ajoutez à cela les diapositives et laisser reposer pendant 10 min à température ambiante.
8. Placer les lames dans une jarre Coplin et laver 3 fois en PBST pendant 10 min.

6. Visualisation de la DIG Probe

1. Préparer 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
2. Incuber les lames avec un tampon de blocage ISH pendant 1 heure à température ambiante.
3. Incuber les lames O / N à 4 ° C avec une phosphatase alcaline (AP) conjugué à un anticorps anti-DIG dilué à 1/1 500 (v / v) dans un tampon de blocage ISH.
4. Laver avec MABT pendant 10 minutes trois fois.
5. Laver deux fois avec 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,2 pendant 5 min à température ambiante.
6. Immédiatement avant utilisation, préparer la solution Fast Red en dissolvant les comprimés dans Tris 0,1 M pH 8,2. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 pm.
7. Incuber les lames à 37 ° C avec une solution de Fast Red dans une chambre humidifiée. Comme le temps pour un développement optimal varie, vérifiez les diapositives régulièrement avec un microscope à fluorescence pour surveiller la formation de précipité. Pour cet exemple, arrêter la réaction après 2 - 3 heures.
8. Laver avec PBST pendant 10 minutes trois fois.

7. immunohistochimie

1. Préparer un tampon de blocage IHC: 10% (v / v) de sérum (d'une espèce différente à l'hôte d'anticorps primaire) en PBST.
2. Incuber les lames avec IHC tampon de blocage pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humidifiée.
3. Préparation de l'anticorps primaire: diluer l'anticorps primaire à une dilution appropriée dans PBST avec 5% de sérum (d'une espèce différente à l'hôte d'anticorps primaire). Pour cet exemple, utiliser un anticorps de lapin anti-Olig2 à 1/400 (v / v) dilution.
4. Incuber dans la solution d'anticorps primaire à 4 ° CO / N.
5. Laver avec PBST pendant 10 minutes trois fois.
6. Préparation de l'anticorps secondaire: diluer un anticorps secondaire fluorophore conjugué à une dilution appropriée dans PBST avec 5% (v / v) de sérum (d'une espèce différente à l'hôte d'anticorps primaire) et 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Pour cet exemple , utiliser un âne anti-lapin Alexa647 anticorps secondaire à 1/1000 (v / v) dilution.
7. Incuber dans la solution d'anticorps secondaires à température ambiante pendant 1 h.
8. Laver avec PBST pendant 10 minutes trois fois.

8. Montage

1. Partiellement sécher les lames à la température ambiante, et monter avec un support de montage de fluorescence. Laissez les diapositives à sécher, puis l'image dans un microscope confocal à 10X, 20X et 63X objectifs en utilisant 4 canaux différents avec les longueurs d'onde d'excitation suivantes: 570 nm pour Fast Red, 488 nm pour FITC, 647 nm pour Olig2 immunomarquage et 350 nm pour Hoechst .

Résultats

Cet article décrit une méthode pour un ISH double fluorescence suivie par immunomarquage dans des coupes de cerveau de souris. Une brève description de ce protocole est représenté sur la figure 1. La première étape a consisté à synthétiser des sondes spécifiques à Aspa et Mbp (myéline protéine de base). Pour vérifier que les sondes ont été synthétisées, une petite aliquote de chaque réaction a été effectuée sur un gel d&#...

Discussion

Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour un ARN double hybridation in situ suivie par immunocoloration. Nous avons utilisé ce protocole pour confirmer que Aspa est exprimé dans les oligodendrocytes matures dans plusieurs régions du cerveau.

Cette procédure en plusieurs étapes a de nombreux pièges potentiels qui peuvent affecter la sensibilité et doivent être évités. Tout d'abord, toutes les solutions et tampons de stockage pour la réaction ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Miniprep	Qiagen	27104
Deionized formamide	Sigma	F9037	for ISH blocking buffer
Sodium chloride	Sigma	S3014
Trizma Base	Sigma	T1503
Hydrochloric acid	VWR International	20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt's solution	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Aspa cDNA clone	Source Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
Sodium acetate	Sigma	S2889
Equilibrated phenol	Sigma	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Isoamyl alcohol	Aldrich	496200
Ethanol	VWR International	20821.321
T7 RNA polymerase	Promega	P4074
Transcription buffer	Promega	P118B
100 mM DTT	Promega	P117B
UTP-DIG NTP mix	Roche	11277073910
Rnasin	Promega	N251B
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Filter paper	Fisher scientific	005479470
Sucrose	Sigma	59378
Diethyl pyrocarbonate	Sigma	D5758
Pentobarbitone	Animalcare Ltd	BN43054
Dissecting scissors	World Precision Instruments	15922
25 gauge needle	Terumo	300600
Peristaltic pump	Cole-Parmer Instrument Co. Ltd	WZ-07522-30
Iris scissors	Weiss	103227
No.2 tweezers	World Precision Instruments	500230
Coronal Brain Matrix	World Precision Instruments	RBMS-200C
Razor blade	Personna Medical	PERS60-0138
OCT medium	Tissue tek	4583
Cryostat/microtome	Bright
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	for 65 °C wash buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Heat-inactivated sheep serum	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
.22 µM filter	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody	Life technologies	A-31573	1:1,000
bisBenzimide H 33258	sigma	B2883
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica