有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

要約

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

要約

タバコの煙（CS）は、心血管および肺疾患の主要な危険因子です。 CSは、その全体的な毒性への個々の成分の寄与を評価するために挑戦されている7,000以上の化学物質^1を含む複雑なエアロゾルであるので。米国食品医薬品局によって定義されるような個々の成分並びに混合物の有害性プロファイルがしかし、スループットのタバコの煙の有害と潜在的に有害な成分（HPHCs）のプロファイリングを有効スクリーニングツール、高適用することにより、in vitroで確立することができます局^{（FDA）。2}

初期評価のために、インピーダンスベースの機器は、化合物の毒性のリアルタイム、ラベルフリーの評価のために使用しました。楽器の読み出しは、すべて一緒に、細胞の状態の概要を提供し、細胞接着、生存率および形態に依存しています。セル・インデックス命名無次元パラメータは、定量化のために使用されます。 DIFのセットferent染色プロトコルは、蛍光イメージングベースの調査のために開発されたとHCSプラットフォームは、各HPHCにより誘発される細胞毒性の種類により詳細な情報を得るために使用されました。

彼らは計算LD _50（<20 mm）を登録として試験15の構成要素のうち、5つだけはHCSベースの分析のために選択しました。これらは、1 aminonaphtalene、ヒ素（V）、クロム（VI）、クロトンアルデヒド及びフェノールが含まれていました。 HCSにおけるそれらの効果に基づいて、1-aminonaphtalene及びフェノールを増加ヒストンH2AXのリン酸化に基づく遺伝毒性としてクロム（VI）と一緒に、ミトコンドリア機能障害を誘発することが同定され、そしてすることができます。クロトンアルデヒドは、ストレスキナーゼ経路の活性化因子としての酸化ストレス誘導物質とヒ素と同定しました。

この研究は、インピーダンスに基づくとHCSの技術の組み合わせは、CS成分のin vitro評価のための強力なツールを提供することを示しています。

概要

毒物学的リスク評価は、歴史的に生命科学の基本的なものの、また、そのような人間には一貫性のない翻訳可能、高コストなどの欠点にリンクされている、動物モデルの使用に頼ってきました。また、「3Rに^「2（交換、縮小、および洗練）の精神で動物実験代替法を見つけるために増加努力がなされてきました。この取り組みは、過去数年間で加速しているためだけでなく、特に欧州連合のようなハイスループット技術と、だけでなく、ために動物試験の使用を制限する法律のシステム生物学のアプローチとして最近の進歩、の。

毒性傷害への応答を調節する細胞シグナル伝達経路の複雑さは、それが明らかに単一の毒性学的エンドポイントを使用すると、特定の化合物の毒性学的根拠を説明するのに十分ではないことになります。このため、相互作用のpの何百もの相互作用生物学的ネットワークに貢献roteinsについても考慮することが必要になります。これらのネットワーク上の毒物の影響を研究するために、表現型の中・高スループットスクリーニングアッセイと組み合わせたシステム毒物学アプローチは、効力を推定すると同時に、個々の毒性物質の作用機序に関する詳細な情報を提供するのに有用です。

この研究では、我々は、プロセスを取得し、特定の蛍光ベースの細胞アッセイから導出された画像データを分析することができる自動顕微鏡及び生物学的ソフトウェアアプリケーションで構成されている強力なスクリーニングツールとして、HCSを用います。これは、単一細胞または細胞下レベルで定量化する細胞内の視覚的変化を可能にし、多くのパラメータが同時に分析される^。3、例えば、DNA二本鎖切断は、ヒストンH2AXのリン酸化の抗体ベースの識別を用いて評価したと活性酸素種（ROS）は、細胞パーマを用いて定量しました。eableスーパーオキシド感受性色素。

肺上皮細胞は、タバコの煙などの吸入毒性物質に対する最初の生物学的障壁を代表しているので、我々は、米国食品医薬品局によって発行されたHPHCsの効果をプロファイリングするためのin vitroモデルとして、一次気管支上皮細胞を利用した^。4この原稿はフォローです我々はHPHCsの異なるサブセットの生物学的影響を評価した先行研究⁵に-UP。

in vitroでの細胞毒性を評価するために我々のワークフローの一環として、我々は最初に、後続のHCSに適した、私たちは、用量範囲を確立することを許可されたインピーダンスに基づくリアルタイム細胞解析（RTCA）システムを使用して、15 HPHCの選択の効力を評価しました分析（ 図1）。次に細胞毒性九マルチパラメトリックエンドポイントを用いて行った毒性HCS評価は、それぞれ2つの時点（4及び24時間）でモニター。 表1に記載したように、7活性、シトクロムCの放出及び細胞膜透過性-使用されるマーカーは、ミトコンドリア毒性、DNA損傷、ストレスキナーゼ、活性酸素種（ROS）、グルタチオン（GSH）含量、カスパーゼ3を示しました。

我々のアプローチは、用量および時間依存のサンプリングを通じてタバコの煙成分の効果の同定および特徴付けを可能にしました。最終的に、これは各HPHCのためのin vitroでの毒性学的プロファイルを生成しました。マルチオミクスアプローチはまた、HCS解析を補完するために使用することができます。これは、最終的にはまた、細胞シグナル伝達および/または転写レベルでの影響のより深い理解を提供するであろう。

プロトコル

1.収穫正常ヒト気管支上皮細胞（NHBEs）

1. 細胞培養培地を、予め温め（気管支上皮細胞成長培地補充培地）、HEPES、トリプシンおよびトリプシン中和溶液（TNS）37℃の水浴です。
2. コンフルエンスの80％に達した時に細胞を採取。
   注：以下のNHBE細胞培養播種条件培地20mlでコーティングされていないT75フラスコ中で最適なコンフルエンスを得るために使用されてもよいです。
   1. 種子1×10 3日間の培養のために⁶個^の細胞、0.5×10 4日間の培養のために⁶個^の細胞と5日間の培養のために0.25×10 ⁶細胞。細胞が栄養をリフレッシュするために培養中にあるときに2日ごとに培地に変更します。培養37℃で細胞を、5％CO _2。
3. フラスコ（複数可）からの上清を除去し、細胞を洗浄するためにHEPESを追加します（ 例えば 、75cm ²のフラスコのための3ミリリットル）。 HEPESゾルと細胞単層をカバーするために各フラスコを回転させますution。
4. HEPES溶液を除去し、トリプシン溶液を追加します（ 例えば 、75cm ²のフラスコのための3ミリリットル）。トリプシン溶液で細胞単層をカバーするために、フラスコを回転させます。
5. 37±2℃で5分間フラスコをインキュベートします。顕微鏡下で細胞の剥離を監視し、必要に応じて、より長くインキュベートし、穏やかに残っている接着細胞を解放するために、フラスコをタップします。
6. 反応を停止するTNSを追加する（ 例えば 、75cm ²のフラスコ3 ml）及び15 mlチューブに細胞懸濁液を移します。
7. 5分間、300×gで細胞懸濁液を遠心します。
8. 上清を廃棄し、均一な細胞懸濁液を得るために穏やかに混合し、新鮮な培地10mlに細胞ペレットを再懸濁します。
9. 凝集物を除去し、細胞をカウントするために100μMのセルストレーナーを介して細胞懸濁液をフィルタリングします。注：我々の研究室では、電界のマルチチャンネル細胞計数システムを正確かつ一貫viablを評価するために使用しました。E細胞の数。

2.リアルタイムセルアナライザー（RTCA）は線量測距（DRF）ベース

注：1）2）を選択した化合物をさらにHCSによって調査されるように、化合物の毒性を評価し、3）HCSのための適切な用量を選択：インピーダンスに基づく測定システムをするために使用されました。 RCTAプレート中のNHBE細胞を、各ウェルに100μlの培地中に存在する試験化合物の希釈液を25μl添加することにより、投与されています。したがって、すべての試験溶液を、5倍（5X）、所望の最終濃度で調製されます。

1. NHBE細胞を播種
   1. インピーダンス測定の回数と期間を定義するための機器をプログラムします。この研究では、データは48時間15分ごとに記録した（24時間の±2時間前および試験薬剤を細胞に投与後24時間）。
   2. 96ウェルRTCAプレートの各ウェルに予め温めておいた50μlの培地をピペットでプレートの背景を測定します。注：このステップは、技術的な要件を表し次いで、細胞ベースの計算のためのベースライン基準として使用される媒体の電気抵抗値を計算するための機器。
   3. 50μL/ウェル媒体の既に機器背景で添加したRTCAプレートの各ウェルに（7,200細胞/ウェル）を144000細胞/ ml（±5％）の濃度で細胞懸濁液を調製し、50μlの細胞懸濁液を追加測定。
   4. 細胞は（細胞の均一な分布を改善するために）RTCAクレードルにそれらを配置する前に室温で30分間付着してみましょう。インキュベーター（37℃、5％のCO _2）でRTCAクレードルでRTCAプレートをインキュベートし、投与前、次の24±2時間のデータの記録を開始。
2. HPHCsおよび陽性対照の希釈
   1. 陽性コントロール希釈
      1. スタウロスポリンストック溶液（10 mM）のDMSOで1:10に希釈し（ 表3参照）及びdの5μlを添加します培地195μlのにilutionは5倍ワーキング溶液を得ました。
   2. HPHC希釈
      1. 溶解/ 1 Mのストック溶液を生成するために、車両（ 表2）の各HPHCを希釈します。 100mMの溶液を生成するために、媒体の各HPHCストック溶液を1:10に希釈します。
      2. 5倍ワーキングソリューション（ 図2）を得るために培地+ 10％の車両を使用して、5つのステップ1:10連続希釈を行うことにより、「化合物のマスタープレート」を生成します。注：最終的には、最終的な投与量は次のようになります。0.2μM、2μM、20μM、0.2 mMの、2 mMの、20 mMの。また、このステップでは、唯一の車両に対応し、用量0を準備します。
   3. 投薬
      1. RTCA機器を一時停止し、プレートを除去するためのクレードルを開きます。
      2. プレートを取り外し、RTCAプレート温度ツールに入れてください（RTCA外実験手順の間、RTCAプレートの温度を安定させるために設計されましたインピーダンス測定に影響を与える可能性の細胞を、冷却避けるために駅）。
      3. 化合物のマスタープレート（行番号7の一番上の行と車両制御における最高用量）（ 図2）と同様の投与順序を維持する三連で細胞に「化合物のマスタープレート」から25μlの5倍溶液を加えます。既存の（100μl）を細胞培養培地を削除しないでください。
      4. 既存の培地を除去することなく、一番下の行（ハーフ右）中の細胞に25μlの5倍ポジティブコントロールソリューションを追加します。既存の細胞培養培地を除去することなく、一番下の行（ハーフ左）で細胞に25μlの培地を加えます。
      5. プレートシーラーでプレートをシール。バックRTCAクレードルでプレートを置き、それをロックします。データは、所望の露光時間を記録する再起動（ 例えば 、24時間）。注：このシーラントフィルムの使用は、ウェル間の交差汚染を含む潜在的な汚染を避けることをお勧めします。
   4. <強い>データ解析RTCAとLD ₅₀の計算
      1. テキスト（.txt）またはExcel（.XLS）ファイルとしてエクスポートした生データ。注：ファイルは、プレートレイアウト（化合物、用量およびウェル位置）に関するすべての情報が含まれています。生細胞指数値を、96ウェル形式（ミラープレートウェル分布）に編成され、記録が発生したすべての時点のために提供されます。時刻tで、96ウェルプレート中の位置iにおける値は、CIの_T（I）で表されます。
      2. 私は、私は位置に23時間50分00秒で96ウェルプレート（例えば 、セルインデックス内の各位置のために投与する前に、最新の時点の正規化の基準として特定し、CIの_{トン （ⅰ）= 23：50：00} = CI _文献 （i））を。注：投薬が行われた場合、この情報は注釈を付けなければなりません。
      3. 除算は、ウェルベースで、正規化基準によってあらゆる時点値は、投与時にすべての値を正規化します。 positioで正規化した値時刻tで、96ウェルプレート中のNiは、NCI _T（I）で表され、したがって、すべてのtについてNCI _tの（I）= CI _tの（I）/ CI _REF（i）で定義されます。
      4. 24時間の時点で曲線下面積（AUC）を計算し、陽性対照および車両の位置を含む、（96ウェルプレート内の位置ⅰ）各サンプルiについて投薬後。
         1. iは各長方形の面積を合計することによって得られる位置でAUCを取得し、2時点間にある各矩形はトン_kとトンの_リットル （T _K <トン_リットル ）で表されます。 2時点（Y =（NCIの_TK（I）+ NCIの_TL（I））の活性の平均である2時点とyの間の距離であるT _K -のx =トンの_リットルでのx * yを使用して、各矩形領域を計算/ 2）。
            注：私は、AUC（I）で表される位置のための24時間後の投与でAUC。すべての条件は、三つ組のウェルに播種されたように3つの値の中央値が​​使用されます。
      5. 次の式を使用して値を正規化：
         
         ここで、iは 、AUCは24時間後の投与で計算された96ウェルプレート内の位置です
         車両は 、24時間の投与後にプレート上の車両ウェルのAUC値の中央値であります
         陽性対照は 、24時間の投与後にプレート上の陽性対照ウェルのAUC値の中央値であります
         CRは、車両（0％）のための所望の中央値正規化された値であり、かつ
         SCは、陽性対照のための所望の中央値正規化した値である（-100％）
         注：このステップの終了時に、データセットは、96ウェルプレートの各位置iについて、含まれているが得られる、（対数単位）の濃度CI位置/ウェルiとその対応に含まれるサンプルに適用されます24時間後に投与AUC_normalizで正規化されたAUCED（I）。
      6. プロットとフィット（ _私は 、AUC_normalized（i）は、C）の4パラメータHill式を使用して-値。可能な場合、また、LD _50を計算します。
         
         ここで、Y = AUC_normalized、
         試験化合物の濃度ゼロでゼロ活動S ₀ =活動レベル、
         無限濃度で無限の活動S _INF =活動レベル、
         活性は最大レベルの50％に達するAC50 =濃度、
         ヒル係数のn = AC50における傾きの測定、および
         C =用量反応曲線のプロットのx軸上の値に対応する対数単位で濃度。
         注：AC50は、LD _50（細胞傷害性アッセイ）に相当します。これは、低い値は、高い効力を示す効力の尺度です。

3. HCSによって毒性作用を測定します

注：6の異なるアッセイでグループ化された毒性九マルチパラメトリックマーカーの合計は、HCSプラットフォーム（ 表1）を用いて測定されます。 RTCA細胞生存率分析（セクシ​​ョン2）に基づいて、各成分の用量範囲が定義され、3R4F参照量も含まれます。参照用量は、基準シガレット3R4Fから1スティックの煙中HPHCの存在量に相当します。

1. NHBE細胞を播種
   1. （12,000細胞/ウェル）12万細胞/ ml（±5％）で細胞懸濁液を調製し、96ウェルHCSプレートの各ウェルに100μlの細胞懸濁液を加えます。すべてのアッセイ（細胞毒性、DNA損傷、ストレスキナーゼ、ROS、GSH含量とアポトーシス）と時点（4および24時間）の評価のために十分なプレートを準備します。
   2. 細胞がウェルに付着し、その後3でインキュベートすることを可能にするために30分間室温でHCSプレートを残します7°Cおよび投与前に24±2時間、5％CO _2。
2. HCHPsおよび陽性対照の希釈
   注：HCSプレート中NHBE細胞は、各ウェル中に既に存在する培地100μlに、試験試料溶液を25μl添加することによって投与されます。したがって、すべての用量は5×所望の最終濃度で調製されます。
   1. ポジティブコントロールの希釈（ポジティブコントロールプレート）
      1. 各ポジティブコントロールのストック溶液40μlを分注し、カラム＃2（ 図4a、赤で斜線のウェル）中の（ 表 3参照）。列＃3、＃5（ 図4a、水色で網掛けのウェル）とカラム＃4の車両の40μlの（ 図4a、水色で網掛けのウェル）で車両の20μLを分注します。
      2. 、カラム＃2のウェルから12μlのを撤回コラム＃3のウェルにそれを分配し、混合する（ 図4b）、得られた各陽性対照化合物（ 図4c）のための3つの用量（D1、D2、およびD3）と車両（V）との最終連続希釈まで続けます。ポジティブコントロールプレートを生成するには、メディア（ 図4d）中の化合物の1：40希釈を準備します。
   2. HPHC希釈（化合物マスタープレート）
      注：HCSのためのHPHCsの選択された用量範囲は、表2に記載されています。
      1. 100 mMの濃度のために各HPHCストック溶液（1 M）培地中で1:10に希釈します。各HPHCのために選択された5倍の用量を得るために、10％の車両で培地を用いて希釈を行います。
3. 投薬
   1. 化合物のマスタープレート（行番号7の一番上の行と車両制御における最高用量）（ 図5）と同様の投与順序を維持する三連で細胞に化合物マスタープレートから5倍のソリューションの25μlのを追加します。電子メールを削除しないでくださいxisting（100μl）を細胞培養培地。
   2. ポジティブコントロールプレート（ 図5）と同様の投与順序を維持する一番下の行のセルにポジティブコントロールプレートから5倍溶液25μlを追加します。既存の（100μl）を細胞培養培地を削除しないでください。注：各アッセイは、特定の陽性コントロールを持っています。 表3は、所望の露光時間（4もしくは24時間）、37℃、5％CO ₂でプレートをインキュベート参照。
4. 染色
   1. すべてのアッセイのための準備
      1. 37℃での洗浄緩衝液（PBS）ソリューションを事前に温めます。
      2. 37℃での洗浄バッファーとプリ暖かいそれの89.19ミリリットルに10.81ミリリットルのホルムアルデヒド37％を追加する固定液（4％ホルムアルデヒド溶液）を準備します。
      3. 洗浄緩衝液90 mlに10倍透過化緩衝液10mlを添加することにより、透過化緩衝液を調製し、37℃で、それを事前に温め。
      4. BLOを準備37℃での洗浄バッファーとプリ暖かいそれの90ミリリットルにブロッキング緩衝液10倍の10ミリリットルを追加することで弄ぶ天使バッファ。
      5. 37℃で細胞培養培地を、予め温め。
      6. 4と24時間の露光時間に達した後にインキュベーターからHCSプレートを取り外し、各アッセイのために、次の特定のプロトコルを実行します。
   2. 細胞毒性分析
      1. 次の式に従って生細胞染色溶液の十分な体積（V）を準備します。媒体の体積（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）
      2. ベンダーの指示に従って、生細胞染色液にミトコンドリア染料を希釈します。ベンダーの指示に従って、生細胞染色液に膜透過性色素を希釈します。
      3. 「細胞毒性アッセイ」と称さプレート（複数可）の各ウェルに50μlのライブ細胞染色液を追加します。細胞培養培地を除去し、37℃、5％COで30分間インキュベートしないでください _2。
      4. 静かに培地及び染色液を吸引し、各ウェルに固定液の100μl/ウェルを追加し、その後、暗所で室温で20分間プレート（複数可）をインキュベートします。
      5. 静かに固定液を吸引し、洗浄緩衝液100μl/ウェルで一回洗浄します。
      6. 洗浄バッファーを削除し、各ウェルに100μl/ウェルの1×透過化バッファを追加し、暗所で室温で10分間インキュベートします。
      7. 吸引透過性バッファーおよび100μl/ウェルの洗浄緩衝液で2回プレートを洗浄します。
      8. 吸引除去は、バッファと、各ウェルに1×ブロッキング緩衝液100μlを加え、室温、暗所で15分間インキュベートウォッシュ。
      9. 次の式に従って一次抗体液の十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。一次抗体溶液中で250：抗チトクロムC抗体（マウス）1に希釈します。
      10. 吸引しブロッキング緩衝液Dを各ウェルに50μlの/ウェルの一次抗体液を追加し、暗所で室温で60分間インキュベートします。
      11. 次の式に従って二次抗体と原子力ソリューションの十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。二次抗体と原子力ソリューションで500：抗マウス抗体1を希釈します。二次抗体と原子力ソリューション1,000：核染料1に希釈します。
      12. 吸引し一次抗体液とプレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液の100μl/ウェルでプレートを3回洗浄します。
      13. 吸引し、洗浄緩衝液とプレート（複数可）の各ウェルに50μlの/ウェルの二次抗体と原子力ソリューションのを追加し、暗所で室温で60分間インキュベートします。
      14. 吸引し二次抗体と原子力ソリューションとプレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液の100μl/ウェルでプレートを3回洗浄します。洗浄バッファーの100μl/ウェルを追加します。今プレート（複数可）（ある）されていますHCSリーダー上で評価される準備ができて。
   3. DNA損傷アッセイ
      1. 静かに「DNA損傷」と称さプレートから培地を吸引除去します。
      2. 順番に説明したのと同じ手順を実行します。3.4.2.4 - 3.4.2.8を。この例では、唯一の媒体がステップ3.4.2.4中に除去されることに注意してください。
      3. 次の式に従って一次抗体液の十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）
      4. 抗ホスホH2AX抗体を希釈（マウス）1：一次抗体溶液中での2000。
      5. 3.4.2.10で説明したのと同じ手順を実行します。
      6. 次の式に従って二次抗体と原子力ソリューションの十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）
      7. 二次抗体と原子力ソリューションで500：抗マウス抗体1を希釈します。
      8. Nucleaを希釈R染料1：二次抗体と原子力ソリューションで千。
      9. 3.4.2.12-3.4.2.14：順序で説明したのと同じ手順を実行します。
   4. ストレスキナーゼアッセイ
      1. 静かに「ストレスキナーゼ」指定の各プレートから培地を吸引除去します。
      2. 順番に説明したのと同じ手順を実行します。3.4.2.4 - 3.4.2.8を。この例では、唯一の媒体がステップ3.4.2.4中に除去されることに注意してください。
      3. 次の式に従って一次抗体液の十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）
      4. 抗リン酸化cJun抗体を希釈（ウサギ）1：一次抗体液で200。
      5. 3.4.2.10で説明したのと同じ手順を実行します。
      6. 次の式に従って二次抗体と原子力ソリューションの十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）
      7. 二次抗体と原子力ソリューションで500：抗ウサギ抗体1を希釈します。
      8. 二次抗体と原子力ソリューション1,000：核染料1に希釈します。
      9. 3.4.2.12-3.4.2.14：順序で説明したのと同じ手順を実行します。
   5. ROSアッセイ
      1. 次の式に従って生細胞染色溶液の十分な体積（V）を準備します。媒体の体積（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。
      2. ベンダーの指示に従って生細胞染色溶液中のROS染料を希釈
      3. 原子力染料1希釈：ライブ細胞染色Solution.3.4.5.4 1,000）」をROS」指定された各ウェルプレートに50μlの生細胞染色溶液を追加します。細胞培養培地を除去し、暗所で室温で30分間インキュベートしないでください。
      4. 静かに培地及び染色液を吸引し、100μl/ウェルの培地で3回プレートを洗浄します。
      5. _ 100を追加し、培地を吸引6;各ウェルにリットル/ウェルの固定液、暗所で室温で20分間静置します。
      6. 静かに固定液を吸引し、洗浄緩衝液100μl/ウェルで3回プレートを洗浄します。
      7. 100μl/ウェルの洗浄バッファを追加します。プレート（複数可）は、準​​備ができました（しています）。
      8. 1時間以内にHCSリーダー上でプレートを評価します。
   6. GSHコンテンツアッセイ
      1. 次の式に従ってライブ細胞核染色溶液の十分な体積（V）を準備します。媒体の体積（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。
      2. 生細胞核染色Solution.3.4.6.3 1,000）：核染料（遠赤）1に希釈します。 「GSHコンテンツ「指定プレートの各ウェルにライブ細胞核染色溶液の50μLを加えます。細胞培養培地を除去し、37℃、5％CO ₂で30分間インキュベートしないでください。
      3. に従って生細胞GSH染色溶液の十分な体積（V）を準備以下の式：HBSSの容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）
      4. ベンダーの指示に従って、ライブセルGSH染色溶液にGSH染料を希釈します。
      5. ゆっくり媒体及び核染色液を吸引し、100μl/ウェルの培地でプレートを3回洗浄します。
      6. 培地を吸引し、プレート（複数可）の各ウェルに100μl/ウェルの生細胞のGSH染色溶液を追加します。
      7. 暗所で室温で10分間インキュベートします。プレート（複数可）は、準​​備ができました（しています）。
      8. 1時間以内にHCSリーダー上のプレート（複数可）を評価します。
   7. アポトーシスアッセイ
      1. 次の式に従って生細胞染色溶液の十分な体積（V）を準備します。媒体の体積（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。
      2. 生細胞染色溶液に300：カスパーゼ色素1を希釈します。
      3. 細胞培養培地を取り除き、トンの各ウェルに50μlの生細胞染色溶液を追加彼は、プレート（複数可）、「アポトーシス」と指定され、37°C、5％CO ₂で30分間インキュベートします。
      4. 次の式に従ってライブ細胞核染色溶液の十分な体積（V）を準備します。修正液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。
      5. ライブ細胞核染色溶液で千：核染料1に希釈します。
      6. 、生細胞染色溶液を除去し、プレート（複数可）の各ウェルに100μl/ウェルのライブ細胞核染色溶液を添加し、暗所で室温で30分間インキュベートします。
      7. 固定剤/核色素溶液を吸引し、洗浄プレート（複数可）を100μl/ウェルの洗浄緩衝液で3回。
      8. 100μl/ウェルの洗浄バッファを追加します。プレート（複数可）は、準​​備ができました（しています）。
      9. HCSリーダー上でプレート（複数可）を評価します。
5. データ分析HCS
   1. エクセル（.XLS）ファイルとしてエクスポートした生データ。注：生細胞の指標値は、96ウェル形式で編成され（ミラープレートウェル分布）において、所定の時点、投与後に、すべてのエンドポイントのために提供されます。
   2. 次の式を使用して値を正規化：
      
      ここで、iは 、井戸の測定された生信号値であり、
      車両は 、プレート上の車両のウェルについて測定された信号値の中央値であります
      CRは、車両（0％）のための所望の中央値正規化された値であり、かつ
      SCは、陽性対照（100）のための所望の中央値正規化された値であり、
      注：このステップの終わりには、データセットは、96ウェルプレートの各位置iについて、含まれているが得られる、濃度c _iが （対数単位）の位置/ウェルiと ​​その中に含まれるサンプルに適用し、正規化された信号のN（i）に対応します。
   3. 4パラメータHill式を使用して値- _{（I：C、N（I））}をプロットし、フィット。
      
      ここで、試験化合物の濃度ゼロでゼロ活動S ₀ =活動レベル、
      無限濃度で無限の活動S _INF =活動レベル、
      活性は最大レベルの50％に達するAC50 =濃度、
      ヒル係数のn = AC50における傾きの測定、および
      C =用量反応曲線のプロットのx軸上の値に対応する対数単位で濃度。
      注：AC50は低い値が高い効力を示す効力の尺度です。

結果

RTCA

毒性効果が検出されないときHCSエンドポイントは有益ではありませんので、表示されないこれらの化合物は、HCS（ 図3b、C、D、G、K、L、MでテストされていないRCTA中の最高濃度に細胞生存率のアップを減少させました、P）。示す化合物は、唯一の最高濃度で細胞生存率を減少させた（ 図3eは、oは ）また、HCSのために選択解除されています。最後に、計算LD _50（<20ミリモル）を持つ唯一の成分をさらにHCS解析（ 図 3a、F、H、J、N）のために選択されます。上記の基準を満たすHPHCsは次のとおりです：1-aminonaphtalene、ヒ素（V）、クロム（VI）、クロトンアルデヒドとフェノール。

HCS

品質チェック（QC）のように、ポジティブコントロールはFiのです最初に正しく実行される染色手順を保証するために分析しました。陽性対照処理細胞の代表的な写真を図6に示す。先に説明したように、データ値が車両に正規化されます。いいえ用量反応曲線はわずか3回の投与がテストされているとしてプロットされておらず、すべての3用量は、すべての時点で考慮されません。適切な応答は、4時間および24時間の両方で、各エンドポイントのために観察されるように、陽性対照の用量が選択されている（以前の実験に基づいて、データは示さず）。特定の用量で1及び2は、用量2及び3は、24時間で効果を評価するために使用される4時間で効果を評価するために使用されます。応答は、陽性対照の用量について観察されない場合、プレートは廃棄されます。すべてのエンドポイントのために、ミトコンドリア膜電位とGSH量を除いて、信号強度の増加が期待されていることに注意してください。

フェノールを除くすべての化合物は、壊死性フェノを誘導しました型、増加した細胞膜透過性（ 図7a、F、H、L）に基づきます。 1- aminonaphtalene、クロム（VI）は、クロトンアルデヒドおよびフェノールを増加ヒストンH2AXのリン酸化（ 図7E、J、N、P）に基づいて、遺伝子毒性であるとして同定されました。フェノールおよび1- aminonaphtaleneは、1 aminonaphtaleneと、増加したシトクロムcの放出（ 図7c）に導か、重度ミトコンドリア機能不全（ 図7b、O）を誘発することが見出されました。増加したカスパーゼ3/7活性の検出は、クロム露光によりアポトーシス事象の証拠を提供しました。酸化ストレス誘導（ROSまたはGSH）は、1-aminonaphtalene、クロトンアルデヒドとフェノール（ 図7d、M、Q）で処理して検出しました。転写因子cJun（ 図7gの ）のリン酸化の増加によって示されるように、最終的に、ヒ素は、細胞ストレスを誘導します。

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図1.化合物のTox-プロファイラワークフロー。a） は、ワークフローの概略は、本研究で行いました。まず、用量範囲の発見は、後続のHCSは、化合物固有の毒性プロフィール。B）試験の実験設計を特徴付けるための適切な用量を選択するために、RTCAプラットフォームを用いて行きました。 HCSのエンドポイントは、投与後4および24時間を調査したのに対し、播種後24時間は、細胞は、次の24時間にわたって投与し、インピーダンス値を継続的に監視した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2. RTCA露出プレート。化合物マスタープレートは、最初の5つのステップ1時10連続希釈を実行することによって生成されます。各化合物、ビヒクル対照（線量0）などは、その後コントロールとして培地およびスタウロスポリンと共に露光プレートに三連で添加されます。車両のコントロールが行番号7にある間シーケンスは、転送時に維持されている用量は、最高用量は行番号1であることに注意してください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3の代表RTCA細胞生存率をもたらす。a）1-aminonaphtalene、B）2-ニトロプロパン、C）アセトアミド、D）アセトン、E）アクリルアミド、F）、ヒ素（V）、G）ベンゼン、H）、クロム（VI） 、J）クロトンアルデヒド、k）はメチルエチルケトン、L）NickeL（II）において、m）ニトロベンゼン、N）フェノール、o-）キノリン、p）のトルエン。 24時間の投与後に、曲線下面積（AUC）が0から0の活動を反映する100％活性（y軸）の範囲の正規化（陽性対照およびビヒクルを含む）を各用量について計算しました。車両および陽性対照の-100。可能性、LD _50を算出したときの値は、その後、プロットし、装着4パラメータHill式を使用しました。濃度は対数スケール（X軸）上に発現されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

HCSアッセイの陽性対照化合物については、図4の希釈スキーム。ポジティブコントロールのa）の追加とVEの5倍の投与量を含むポジティブコントロールプレートを生成するために、培地中の200倍陽性対照の用量（1：40）の連続希釈プレートにhicle。ポジティブコントロールのb）の段階希釈するc）200X陽性対照の用量。 デ）希釈。各用量は露光プレートで最終レイアウトを反映するために、三連で希釈されることに注意してください）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5 HCS露出プレート。化合物マスタープレートは、最初の5つの段階希釈を行うことにより生成されます。車両制御を含む各化合物（投与量0）をポジティブコントロールと一緒に露光プレートに三連で添加されます。 、用量の順序が転送時に維持されていることに注意してください車両のコントロールが行番号7にいる間最高用量は、行番号1である。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

抗体または染料染色細胞の図6.代表的蛍光写真 a）は、 原子力のパラメータ - 原子力染料 ：ライブまたは固定された細胞内のDNAに結合する透過性染料。この染色は、核領域を標識する個々の細胞を同定するために使用されるB） 壊死 - 細胞膜透過性色素 ：細胞膜の完全性の染料ベースの検出。試薬は、細胞膜に本質的に不透過性です。壊死の間に、膜が透過性になり、色素が細胞に入ると、強い蛍光Sを生成するDNAに結合しますignal c）の アポトーシス - チトクロームC：シトクロムC放出、初期アポトーシスのよく知られた特徴での抗体ベースの検出。アポトーシスの誘導の際に、シトクロムcは、ミトコンドリアから放出され、核d）の DNA損傷に拡散- pH2AX：ヒストンH2AXのリン酸化の抗体ベースの検出、二本鎖DNA切断の周知の特徴E） ストレスキナーゼ - cJun：。のSer-73 cJunの、細胞ストレスのよく知られた特質でのリン酸化の抗体ベースの検出f）は 酸化ストレス - DHE：スーパーオキシドラジカルの染料ベースの検出。 。無料GSH分子の色素ベースの検出：mBcl -酸化型エチジウムはDNAインターカレーショングラムの際に赤い蛍光を発するながらジヒドロ自体はGSH）は、細胞質内の青色蛍光を発します。 mBclはへのGSHと反応します高度蛍光産物を生成する時間） アポトーシス - カスパーゼ3/7活性化 ：カスパーゼ3/7活性の染料ベースの検出。試薬は、DNA結合を阻害する4つのアミノ酸ペプチドで非蛍光性です。カスパーゼ3月7日活性化されると、ペプチドは、DNAに結合し、明るい、蛍光性応答を生成するために、色素を可能に切断されます。パネルBHは、陽性対照で処理した細胞を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7.代表的HCS結果。1-aminonaphtalene（AE）、ヒ素（V）（FとG）、クロム（VI）（HK）、クロトンアルデヒド（LN） ​​とフェノール（OQ）。 4時間（青線）と24時間（オレンジ色のライン）の信号は、それぞれの用量について算出し、車両活性（0％）に標準化しました。カーブフィッティングの計算には含まれていない値はグレーで表示されています。濃度は対数スケール（X軸）上に発現されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

検定	エンドポイント＃	生物学的エンドポイント	細胞内コンパートメント	出力機能
細胞毒性	1	ミトコンドリア質量6	細胞質	スポット平均面積
	2	ミトコンドリア膜電位6	細胞質	スポット平均強度
	3	シトクロムC放出 7	核	平均強度
	4	細胞膜透過性8	核	平均強度
DNA損傷	5	ホスホH2AX 9	核	平均強度
ストレスキナーゼ	6	ホスホcJun 10	核	平均強度
ROS	7	ROS 11	核	平均強度
GSHコンテンツ	8	GSH 12	細胞質	スポット平均強度
アポトーシス	9	カスパーゼ3 13	細胞質	スポット平均強度

HCS aの表1のリストssaysおよびエンドポイント。

		車両	RTCAの用量（μM）						LD 50	HCSの用量
										細胞生存率-選択（μM）				3R4F（NM）
1-Aminonaphtalene		エタノール	2万	2,000	200	20	2	0.2	280μM	2,000	500	200	150	0.27
2-ニトロプロパン		エタノール	2万	2,000	200	20	2	0.2	> 20 mMの
アセトアミド		エタノール	2万	2,000	200	20	2	0.2	> 20 mMの
アセトン		水	2万	2,000	200	20	2	0.2	> 20 mMの
アクリルアミド		水	2万	2,000	200	20	2	0.2	> 20 mMの
ヒ素（V）		水	2万	2,000	200	20	2	0.2	160μM	200	100	50	25	0.17
ベンゼン		エタノール	2万	2,000	200	20	2	0.2	> 20 mMの
クロム（VI）		水	2万	2,000	200	20	2	0.2	20μM	100	50	20	10	0.06
クロトンアルデヒド		水	2万	2,000	200	20	2	0.2	200μM	2万	2,000	200	20	2,000
メチルエチルケトン		水	2万	2,000	200	20	2	0.2	>20 mMの
ニッケル		水	2万	2,000	200	20	2	0.2	> 20 mMの
ニトロベンゼン		エタノール	2万	2,000	200	20	2	0.2	> 20 mMの
フェノール		エタノール	2万	2,000	200	20	2	0.2	2300μM	5,000	2,000	千	500	240
キノリン		エタノール	2万	2,000	200	20	2	0.2	> 20 mMの
トルエン		水	2万	2,000	200	20	2	0.2	> 20 mMの

表2 の処理の24時間で 相対LD ₅₀ でテスト済みHPHC化合物のリスト 。HCS分析のために選択された化合物は、オレンジ色で強調表示され、試験した用量も与えられています。 3R4F線量が基準シガレット3R4Fから1スティックの煙中に存在する成分の量に相当します。

検定	化合物	貯蔵液	溶媒	用量（複数可）（μM）
細胞の生存	スタウロスポリン	10 mMの	DMSO	50
細胞毒性	バリノマイシン	10 mMの	DMSO	50	20	5
DNA損傷	パラコート	100 mMの	DMSO	500	200	50
ストレスキナーゼ	アニソマイシン	2 mMの	DMSO	10	4	1
ROS	ロテノン	200 mMの	DMSO	千	400	100
GSHコンテンツ	エタクリン酸	200 mMの	DMSO	千	400	100
アポトーシス	スタウロスポリン	40 mMの	DMSO	200	50	20

各アッセイのために使用されるポジティブコントロールと濃度の表3のリスト。

ディスカッション

動物実験の代替のための、新しい高スループットのテストアプローチの必要性が広く、過去数年にわたって議論されてきました。これは、密接に標的組織の生理機能を模倣する細胞アッセイを利用し、標準的な毒性試験のための別の方法を調査する科学者や規制当局をリードしてきました。本研究では、ヒト肺上皮細胞上の単一のCSの成分への暴露の影響を評価するために、高含有量スクリーニング（HCS）プラットホームでのリアルタイムセルアナライザー（RTCA）の合成の適用可能性を実証しました。この設定は、同様に様々な他の大気汚染物質、浮遊粒子、およびナノ粒子により誘導される細胞毒性を評価するために適用することができます。また、得られた結果は、原因生物学的ネットワークに基づいて、全ゲノムトランスクリプトミクスおよび計算方法のものと一致させることができます。以前に報告されたように、このアプローチは、分子経路のデータを確証することができましたHCSのエンドポイントとCS暴露⁵時摂動、また表現型これらの経路摂動に対処します。

フローチャートアッセイとして、リアルタイム細胞分析は、用量および曝露時間点は、下流分析¹⁴のために有利で ​​あり得る、より良い意思決定を可能にする用量および時間依存分解能における細胞生存率に関連する情報を提供します。アナライザの原理は、彼らが金の微小電極で覆われた培養ウェルの表面に付着し、スプレッドとして細胞によって生成された電気インピーダンスの変化に依存しています。インピーダンスは、細胞接着、拡散、形態および最終的に細胞生存率を監視するために使用することができる細胞指数命名無次元パラメータに変換されます。この技術は、細胞傷害性のメカニズムについての情報を提供していないものの、その感度もHCSが有益でないれる非常に低用量での形態学的細胞変化の検出を可能にする（データは示さず）。 previに基づき、OUの実験では、我々は、RTCA方法がHCSエンドポイントと比較して低用量での形態学的変化を検出することができることを指摘しています。

リアルタイム細胞分析装置との最初のスクリーニングに続いて、HCSプラットフォームは、各HPHCによって誘発される細胞毒性の種類により詳細な情報を得るために使用されました。細胞区画上の潜在的な影響の方にHPHCsをプロファイルするために許可されたHCSアッセイパネル/細胞小器官だけでなく、遺伝毒性や酸化ストレスを誘発するものを同定します。分析は、選択HPHCsはNHBE細胞で細胞毒性を誘導することにより個別のプロファイルを明らかにしました。一般的に、全ての化合物は、フェノールを除いて、試験した最高用量で壊死を誘導することが見出されました。ミトコンドリア毒性の読み出し（質量の増加とチトクロームC releaでこのHPHCのがHCSパネルも覆われていないアクティビティ遺伝毒性のためのマーカーとして癌の発症における潜在的役割H2AXの1-aminonaphtalene誘導性リン酸化と一致して、SE）と酸化ストレス（GSH枯渇）。前述のように同様に、フェノールは、ミトコンドリア機能障害を誘発し、DNA損傷並びにGSH枯渇を引き起こすことが確認されました。特にクロム（VI）中のクロム（VI）、グループI発がん物質として分類される化合物の一つであり、クロトンアルデヒドはまた、両方の遺伝毒性として同定されたが、また、アポトーシス（カスパーゼカスケードの活性化）を誘導し、クロトンアルデヒドは、ROSの生成を増加させました。最後に、ヒ素（V）は、ストレスキナーゼ経路活性化のマーカーであるcJunリン酸化を誘導することが見出されました。

本研究では、in vitroでの肺上皮細胞のモデルとしてNHBE細胞を利用しました。 HCSの設定でこれらの細胞を使用することは前例がないと遺伝毒性および酸化ストレスマーカーを含むエンドポイント、より広い範囲の調査を可能にしました。生細胞および固定細胞染色のアプローチの両方が、全体的な技術の柔軟性を示す、我々のプロトコル内で説明されました。 Fで行為は、非常に同様のプロトコルは、任意の蛍光染料または抗体を使用することによって対処することができるターゲットのより広い範囲に適用することができます。染料の一部が制限された半減期を有し、画像の取得が完了する前に蛍光シグナルが低下するように、ライブ染色プロトコルを正常に実行するためには、インキュベーション時間を尊重することが重要です。異なる細胞タイプが使用される場合、最適な色素濃度およびインキュベーション時間は異なっていてもよいように、すべての染色条件は、再評価されるべきであることを考慮することも重要です。

現在の論文では、唯一の5つの化合物は、HCSの方法論を用いてスクリーニングシナリオを記載しています。先に述べたプレートレイアウトを考えると、彼らはそれによって複数の化合物の同時スクリーニングを可能にする、プレートの選択図数も増加させることができた24のプレート（6アッセイおよび2時点）の合計2つの異なるプレートセット上で投与しましたかinves複数のエンドポイントのtigation。その前に、しかし、1は、特定のエンドポイント（GSH及びROS）は即時取得を必要とし、結果として、プレートの投与は、前版の取得を可能にするために、千鳥状に行われるべきであることを考慮に入れる必要があります。プレートを後の段階で染色手順の完了を、固定後の任意の段階でプロトコルを中断、積み重ねることができるように一方、固定細胞染色プロトコルを使用する利点を示します。このアプローチは、例えば、データの品質を損なうことなく、すべての生細胞染色プレートを完了するまでの時間をオペレータに提供します。

さらにプレートの数を減少させることによって、ワークフローを最適化するために、また、一緒に複数のエンドポイントを多重化することが可能です。たとえば、このコンテキストDNA損傷とストレスでキナーゼは、単に別の（c）に発光する蛍光色素で2二次抗体を使用して一緒に調査することができましたhannels。完全に自動化された細胞播種、化合物希釈液、投薬および染色、ならびに新しいエンドポイントの追加を含むHCSプラットフォームの継続的な開発は、さらに上皮上HPHCsおよび他の細胞型のための強力なプロファイリングツールとしてHCSプラットフォームの機能を拡張します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader	Thermo	N01-0002B
xCelligence RTCA MP	ACEA	05331625001
Screener (HCS)	Genedata	NA
CASY counter TTC	Roche	05 651 719 001
e-Plates VIEW 96	ACEA	06 472 451 001
RTCA Frame 96	ACEA	05232392001
RTCA Cardio Temperature Tool	ACEA	2801171
Plate sealer breathseal	Greiner bio-one	676051
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE)	Lonza	CC-2540	non-smoking 60-year-old Caucasian male donor
BEGM BulletKit	Lonza	CC-3170	Warm at 37 °C before use
ReagentPack Subculture Reagents kit	Lonza	CC-5034	Warm at 37 °C before use
Penicillin/Streptomycin (100x)	Corning	30-002-CI
Easy Flask filter cap 75 cm2	Thermo Scientific	12-565-349
96 well assay plate  black	Corning	3603
Hoechst 33342	Fisher Scientific	PI-62249
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)	Biostatus	DR50200
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos	Life technologies	M-7512
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos	Life technologies	M-7513
ROS Dye: Dihydroethidium	Sigma	D7008
ROS Dye: CellROX	Life technologies	C10422
ROS Dye: MitoSOX	Life technologies	M36008
GSH Dye: Monochlorobimane	Sigma	69899	Toxic
GSH Dye: Monobromobimane	Life technologies	M-1378	Toxic
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1	Life technologies	Y3603	Irritating
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1	Life technologies	T3602	Irritating
Membrane permeability Dye: TOTO-1	Life technologies	T3600	Irritating
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green	Life technologies	C10423	Irritating
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse)	Thermo	MA5-11823
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse)	Thermo	MA5-15889
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse)	Thermo	MA1-2022
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650	Abcam	ab96878
10x permeabilization buffer	Fisher	8408400
4% Formaldehyde solution	Sigma	F1635	Toxic
10x blocking buffer	Fisher	8408500
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Hanks' Balanced Salt solution	Sigma	H8264
Staurosporine	Sigma	S4400	Toxic
Valinomycin	Sigma	V0627	Toxic
Paraquat	Sigma	36541	Toxic
Anisomycin	Sigma	A9789	Toxic
Ethacrynic acid	Sigma	E4754	Toxic
1-Aminonaphthalene	Sigma	34390	Toxic
2-Nitropropane	Sigma	130265	Toxic
Acetamide	Sigma	695122	Toxic
Acetone	Sigma	650501	Toxic
Acrylamide	Sigma	A9099	Toxic
Arsenic (V)	Sigma	A6756	Toxic
Benzene	Sigma	12540	Toxic
Chromium (VI)	Sigma	216623	Toxic
Crotonaldehyde	Sigma	262668	Toxic
Methyl ethyl ketone	Sigma	34861	Toxic
Nickel	Sigma	203866	Toxic
Nitrobenzene	Sigma	48547	Toxic
Phenol	Sigma	P5566	Toxic
Quinoline	Sigma	241571	Toxic
Toluene	Sigma	34866	Toxic