脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

要約

脂質は細胞機能に重要な役割を果たしていることが知られています。ここでは、好中球細胞外トラップ形成の基礎となるメカニズムのより良い理解を得るために、HPTLC及びHPLCの両方を使用することにより、コレステロールレベルに重点を置いて、好中球の脂質組成を決定するための方法について説明します。

要約

高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）によって実行される脂質分析は、脂質の広い範囲を分析する比較的単純な、費用対効果の高い方法です。 （宿主-病原体相互作用またはホストエントリで、例えば ）脂質の機能は、細胞プロセスに重要な役割を果たしていることが報告されています。ここで、我々は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と比較してHPTLCによる一次血液由来の好中球のコレステロールレベルを中心とし、脂質組成を決定するための方法を示します。目的は、好中球細胞外トラップ（のNET）の形成における脂質/コレステロールの変化の役割を調査することでした。 NETのリリースは、ホスト内の広がりから病原体を防ぐために、ホストの防御機構として知られています。したがって、血液由来のヒト好中球は、細胞中の脂質変化を誘導するメチルβシクロデキストリン（MβCD）で処理しました。 HPTLC及びHPLCを使用して、我々は、細胞のMβCD処置は脂質につながることが示されています細胞のコレステロール含有量の大幅な削減に関連付けられている変更。免疫蛍光顕微鏡によって示されるように、同時に、好中球のMβCD処置は、ネットの形成につながりました。要約すると、ここでは、脂質の好中球の変化や網の形成を研究するための詳細な方法を提示します。

概要

脂質は、細胞の恒常性、細胞死、宿主-病原体相互作用、およびサイトカイン放出¹に重要な役割を果たしていることが示されています。時間が経つにつれて、細胞応答では、特に、ステロイドコレステロールを宿主 - 病原体相互作用または炎症中の脂質の影響に関するについて関心と知識が増加している、といくつかの出版物は、特定の脂質の中心的役割を確認します。 3-ヒドロキシ-3-メチル - 補酵素-Aレダクターゼ（HMG-CoAの還元）を遮断することによってコレステロール生合成の阻害剤として使用されるスタチン、と薬理学的治療は、インターロイキンの血清レベルを低下させることによって抗炎症剤として作用することができます6およびC反応性タンパク質^2。コレステロール及びスフィンゴ糖脂質に富む構造は^、ホスト^3、4、5へのゲートウェイとして、そのような細菌やウイルスなどのいくつかの病原体で使用することができますクラス= "外部参照"> 6。スフィンゴ脂質（ 例えば、スフィンゴミエリン）は、その病原^7を促進するために病原体によって使用されることが示されています。細胞を入力するためのマクロファージにおける、マイコバクテリアの使用コレステロールに富むドメイン。コレステロールの枯渇は、マイコバクテリアの取り込み^8を阻害します。さらに、（また、ウサギ熱としても知られる）、 野兎病菌、野兎病の原因で人畜共通感染剤⁹とマクロファージの感染は、コレステロールは、膜¹⁰から除去されたときに廃止された感染症につながりました。同様に、脂質リッチ構造を介して大腸菌による宿主細胞の浸潤は、コレステロール依存⁴であることが実証されました。また、上皮細胞のネズミチフス菌感染実験は、コレステロールを細胞¹¹への病原体の進入のために必須であることを実証しました。コレステロール枯渇inhibiteサルモネラ¹¹のD摂取。さらに、Gilk らによる最近の研究。コレステロールはコクシエラのburnetti ¹²の取り込みに重要な役割を果たしていることを実証しました。また、トゥオンら 。 25-ヒドロキシコレステロールは、リポ多糖（LPS）による食作用において重要な役割を果たしていることが見出されたマクロファージ^を刺激さ^13。マクロファージは、薬理学的コレステロール^14を枯渇させる処理した場合、食作用が低下しました。したがって、コレステロールおよび他の脂質は、彼らの枯渇は、いくつかの病原体^10、11、12からの侵入の危険性を減らすことができるため、感染症や炎症に重要な役割を果たしているようです。

最近、我々は脂質の変化、細胞からのコレステロールの特に枯渇は、好中球extracellulaの形成を誘導することを示すことができましたヒト血液由来の好中球¹⁵のRトラップ（のNET）。 2004年のNETの発見以来、彼らは細菌の取り込みに重要な役割を果たしていることが示され、これにより感染^16、17の広がりを妨げるでてきました。ネットは、ヒストン、プロテアーゼ、及び抗菌ペプチド¹⁶に関連付けられているDNA骨格から成ります。好中球によるのNETの放出は、病原体^18,19及びホルボールミリステートアセテート（PMA）またはスタチン^16、20などの化学物質の侵入によって誘導することができます。しかし、詳細な細胞メカニズム、特にこの過程における脂質の役割は、まだ完全には明らかではありません。脂質の分析は、このようなのNETのリリースなどの細胞プロセスとの相互作用の多種多様に関与するメカニズムのより良い理解につながることができます。 CholesteROLとスフィンゴミエリンは、彼らが、安定性を追加し、タンパク質輸送およびイベント^21のシグナル伝達に関与するタンパク質のクラスタリングを促進する細胞膜と脂質マイクロドメインの重要な構成要素です。このような環状オリゴ糖のメチルβシクロデキストリン（MβCD）などの特定の脂質、両親媒性の薬剤、の機構的役割を調べるために、細胞の脂質組成を変化させるためにインビトロ ¹⁵ 中のコレステロールを減少させるために使用することができます。ここでは、MβCDに応じて、好中球の脂質組成を分析するためにHPTLCを使用する方法を提示します。 HPLCは、好中球集団でのコレステロールのレベルを確認するために使用されました。さらに、我々は、MβCDに応答してヒト血液由来の好中球に免疫蛍光顕微鏡によってのNETの形成を視覚化する方法を記載します。

プロトコル

このプロトコルでは、末梢血の採取は、地域、人間研究倫理委員会によって承認されました。すべての被験者は、彼らの書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

密度勾配遠心分離によりヒト血液由来の好中球の単離

1. ヒト血液由来の好中球の単離
   1. 層血の〜20mLの火炎近くナトリウムジアトリゾエート/デキストラン溶液20mLへと混合せず。
   2. ブレーキなしで470×gで30分間遠心します。
   3. 単核細胞と黄色がかった血漿層を除去します。多形核細胞（PMN）相（蓄積細胞と第二相; 図1および図 2）に転送新しい50mLチューブにおよび1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で50mlにそれを埋めます。
   4. ブレーキ付き470×gで10分間遠心します。
   5. 上清を除去し、FO滅菌水5mLにペレットを再懸濁赤血球を溶解するには、r 5秒。
   6. 直ちに1×PBSと470 X gで10分間遠心分離で50mlまで満たします。
   7. 上清を取り除きます。ペレットは白でなければなりません。それはまだ赤の場合は、ステップ1.1.5および1.1.6を繰り返します。
   8. ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地1,000μLにペレットを再懸濁。光学顕微鏡下で血球計でトリパンブルー染色を用いて細胞数を数えます。
   9. 2×10 ⁶ / mLの濃度でRPMI中の細胞懸濁液を調製します。約2.5×10 ⁷個の好中球は、血液を20mLから採取することができます。
2. 脂質分析のための好中球の薬理学的治療
   1. ステップ1.1.9から5×10 ⁷個の細胞を使用します。純粋Hank'sに1.5mLの反応管に300μLの総容量中に10mMのMβCDまたは25nMのPMAの存在下または非存在下で平衡塩類溶液（HBSS）中に細胞数を調整します。
   2. でサンプルをインキュベート37°Cで2時間、5％CO ₂の反応管。
   3. ブレーキ付き470×gで10分間遠心します。
   4. 上清を除去し、HBSSの300μLで細胞ペレットを再懸濁します。
   5. ブレーキ付き470×gで10分間遠心します。
   6. 10回とアウト1mLのシリンジにサンプルを吸引することで、26-Gカニューレで均質化し、-20℃で試料を保存する（1：1）、クロロホルム/メタノール1mLで細胞ペレットを再懸濁します。
3. 免疫蛍光法によってNET定量化のための好中球の薬理学的治療
   1. カバーガラスを有するポリ-L-リジンでコーティングした48ウェルプレートを準備します。
      1. 、各ウェルに1つの8 mmのカバーガラスを置き、滅菌0.01％ポリ-L-リシンの55μLを添加し、室温（RT）で〜20分間インキュベートします。
   2. 1×PBSの200μLで二回洗浄してください。必要になるまで冷蔵庫でウェル当たり1×PBS200μLでプレートを格納します。
   3. 車efully各カバースリップの中央にウェルあたりステップ1.1.9からの細胞懸濁液（2×10 100分の^5μL）の100μLを加えます。
   4. 最終10mMのMβCDまたは最終25nMのPMAのいずれかのウェル当たり100μLを加えます。
   5. ブレーキ付き370×gで5分間遠心します。
   6. 37°Cで2時間、5％CO ₂インキュベートします。
   7. ブレーキ付き370×gで5分間遠心します。
   8. 、4％の155μLPFAで細胞を固定パラフィンプラスチックフィルムでラップし、4℃または室温で10分間、一晩保管してください。
      注：MβCDによって誘導されたNET形成に関するデータについては、ノイマンらを参照してください。 ^15。

2.脂質の単離およびヒト血液由来の好中球の分析

1. ブライ-ダイアー²²とブログデンらに基づいて、ヒト末梢血由来の好中球から脂質を単離します。 ²³
   1. ステップ1.2.6から好中球を取り出し、氷の上に置きます。
   2. 氷上で、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）と15mLのスクリューキャップガラス管に好中球（メタノールおよびクロロホルム溶液中に存在する）ピペットを1分間振盪することによってそれらを密封し、均質化します。プラスチック表面に結合する脂質を防ぐために、ガラス管を使用します。 PTFEがゴム/プラスチックからの汚染を防ぐためにキャップを使用します。
   3. メタノール2 mLを加え、クロロホルム1mLのにより1分後に続きます。 1分間再び振ります。
   4. RTで30分間50rpmでガラス管を回転させます。
   5. 7℃で10分間1952×gで溶液を遠心分離してタンパク質画分をペレット化。
   6. 注意深く後ろタンパク質含有ペレットを残し、新しい15mLのガラススクリューキャップチューブに上清をデカントします。将来の定量化のために-20℃でペレットを保管してください。
   7. クロロホルム1 mLを加え、1分間待って、二重蒸留水1mLを添加し、30秒間試料とガラススクリューキャップチューブを反転させます。
   8. 7℃で遠心分離し、10分間1952×gで、下へ、上相を捨てたが、濁った層を含みません。
   9. 必要に応じて、ステップ2.1.8を繰り返すことにより、任意のさらなる精製工程を行います。
   10. 60℃で真空濃縮のサンプルを乾燥し、必要になるまで-20℃で保管してください。
2. 半定量コレステロールを含むいくつかの脂質の量は、リン脂質、およびスフィンゴミエリンの高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）
   1. 次の4つの実行中のソリューションと染色液を準備します。
      1. 溶液1：酢酸エチル（26.6％）、1-プロパノール（26.6％）、クロロホルム（26.6％）、メタノール（26.6％）、及び塩化カリウム（9.6％）を混合します。 HPLC品質の水100mL中のKCl 0.25gを溶解することにより塩化カリウムを準備します。
      2. 溶液2：n-ヘキサン（73％）、ジエチルエーテル（23％）、及びクエン酸（2％）混合します。
      3. 溶液3：100％n-ヘキサン。
      4. によって染色液を準備硫酸銅を7.5gと蒸留水（90 ml）を混合し、次いでリン酸の10 mLを加え。
   2. 別のガラス容器の各溶液の5mmと埋めます。各チャンバー内に走行速度を高めるために、ろ紙のいずれかの種類を追加します。
   3. 実行中の溶液をプレートの上部に到達するまで、第1の連続液に20×10cmのHPTLCシリカゲル60枚のガラス板をプレインキュベートします。次いで、110℃で10分間乾かし。
      注：これらのプレートをアルミホイルで将来の使用のために保存することができ、使用前に110℃で10分間乾燥させました。
   4. クロロホルム/メタノール（1：1）の200μLのステップ2.1.10から得られた脂質ペレット溶解液を、溶解するために37℃で15分間インキュベートします。
   5. 所望のサンプル数、プラス少なくとも一つの標準のためのローディングスポットをマークするために定規と柔らかい鉛筆を使用します。マーク走行距離で約4センチ、それぞれ第1および第2走行溶液、6 cmです。
   6. サンプルをロードするには、クロロホルム/メタノール中の10μLシリンジを3回洗浄する（1：1）前各新しいサンプルをロードします。ロードできるだけ小さい面積にサンプルを集中しようとしている各サンプル滴下の10μL、。サンプルは、少なくとも二重にロードする必要があります。
   7. 溶液1（ステップ2.2.1.1）を実行して第一のチャンバ内に垂直にプレートを置きます。プレートは、均一な移動速度を達成するために、ガラスチャンバの壁に平行であることを確認してください。
   8. 溶媒ラインは、第1のマークに到達した後、プレートを取り外し、それを乾燥させ、そして第二の溶液に置き。第二および第三の走行ソリューションのための同様の手順を繰り返します。溶媒先端がプレートの上部に到達するまで1分間RTでそれを除去し、乾燥、溶液中でプレートを残します。
   9. 7秒間硫酸銅溶液中にプレートを置き。完全に乾燥したプレートを除去し、170℃で7分間、オーブンで焼きます。プレートを冷却するのを待ちます。
   10. USING薄層クロマトグラフィーとゲル解析ソフトウェア、ならびに画像処理ソフトウェアは、スキャンしてブログデンらにより以前に記載されているように分析します。 ^23。
3. コレステロールの量を定量化するための高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
   1. 5ミクロン/ 4.6ミリメートルガードカートリッジに100×4.6mmカラムを取り付け、32℃に加熱します。各試料中のコレステロールの量を定量化するために65バールで1 mL /分の流速および202 nmでのUV検出器測定で、移動相としてメタノールを使用します。
   2. ポンプの洗浄、針を洗浄、ポットを洗浄、注射器をパージし、ポンプパージを洗浄：、サンプルを分析し、次の手順を実行する前に完全HPLCマシンを洗ってください。水ですべてを洗います。最後に、5分間、5ml /分の流量でメタノールシステムパージを行います。
   3. コレステロール標準曲線を確立するために、範囲の少なくとも4つの濃度を調製0.05mg / mLから2ミリグラム/ mLのクロロホルム/メタノール中のコレステロール^{（1：1）24。}
   4. クロロホルム/メタノール500μLのステップ2.1.10から得られたサンプルを再懸濁（1：1）スクリュートップ赤PTFE /白シリコーン蓋と琥珀色の1.5mLのガラス瓶に。
   5. ステップ2.3.3で調製した標準を使用して、コレステロール濃度を定量します。
      注：少なくとも一つの標準とサンプルに続いて一つの負の制御、始まる、サンプリングプロトコルに記入。
   6. 曲線下面積として結果を発現し、任意の統計ソフトウェアを使用して適切なサンプル間で比較します。
      注：結果は、標準曲線に対して定量化することができ、総コレステロールミリリットル当たりの量、G、または細胞の数として示すことができます。標準曲線の方程式は、ステップ2.3.3で得られた値を用いて計算されるべきです。

NETの3可視化と定量化

1. ヴィスNETのualization
   注：のNETの可視化は、ノイマンらが以前に発表された研究に基づいています。 ^15。
   1. 1×PBS200μLでステップ1.3.8からの固定された試料を3回洗浄します。
   2. ブロックし、室温で45分間、ウェルあたりPBS中の2％BSAの100μL、0.2％トリトンX-100で透過性。
   3. 一次抗体100μLを加える：マウスモノクローナル抗DNAヒストン1抗体（2.2 mg / mlと1とのストック希釈：PBSで5,000 2％BSAを含有する0.2％トリトンX-100）またはポリクローナル抗体ミエロペルオキシダーゼに対する（MPOします。ウサギ抗MPO; 1希釈：2％BSAおよび0.2％トリトンX-100）を含有するPBS中で300。 4℃で一晩インキュベートします。
   4. 1×PBSの200μLで3回洗浄します。
   5. 二次抗体100μL加える（蛍光標識ヤギ抗マウス1：BSA-PBS-トリトンX-100およびヤギ抗ウサギ1,000; 1：1,000 BSA-PBS-トリトンX-100）を1時間で暗所でRT。
   6. 200＆＃で3回洗浄181; 1×PBSのL。
   7. ピンセットを使用してカバースリップを削除し、それらをスライドガラス上にDAPIを含む封入剤の3μLに伏せて置きます。
   8. HCX PL APO 40X 0.75から1.25油浸対物レンズ¹⁵を備えた共焦点反転ベース蛍光顕微鏡を用いて試料を検査します。
2. NET放出核の定量化
   1. 画像処理ソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を開き、ドラッグしてツールバーに目的の画像をドロップします。
   2. 「プラグイン」、「分析」および「細胞カウンターをクリックします。」
   3. カウンターウィンドウ内の「初期化」ボタンを押して、カウンターの種類を選択します（ 図に表示されているように、例えば 、非剥離性細胞のために黄色で8 NET放出細胞のために赤7をクリックすると6B-IおよびII）。
      注：NET-陽性細胞のための基準：陽性に染色された緑色の核+低密度nucleuS（分葉の損失）又は核の円形+核のサイズの増加、またはオフシュートの異なる細胞外の発生損失。
   4. 上記の基準に全ての細胞付着をクリックして、解析ソフトウェアのデータシートにカウントセル番号を書きます。
   5. NET放出・非離型細胞のカウント細胞数を使用してNET放出細胞の割合を計算します。

結果

ヒト血液由来の好中球密度勾配遠心分離（ 図2）によって単離しました。好中球上の脂質変化の効果を調べるために、細胞は、細胞からのコレステロールを枯渇10mMのMβCDで処理しました。ブログデンらによって記載されているように、続いて、脂質は、ブライ-ダイアー（ 図1、左パネル）によって試料から単離しました。

ディスカッション

ここで説明する方法は、HPTLCによってコレステロール、又はHPLCのような特定の脂質を分析すると（ノイマンら¹⁵参照 ）のNETの形成に対する薬理脂質変化の効果を調べるために使用することができます。

HPTLCは、多数のサンプル中の脂質の広い範囲を分析するため、比較的費用効果がありかつ簡単な方法です。この方法は、上皮細胞における抗生?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-21070
Anti-MPOα antibody	Dako	A0398
BSA	Sigma-Aldrich	3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber	Celeromics	MF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner	Leica	DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493-1L	Dilute 1:10 in water for 1x working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed	Thermo Fisher Scientific	35503
Excel	Microsoft	2010
DNA/Histone 1 antibody	Millipore	MAB3864
ImageJ	NIH	1.8	http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscope	VWR	630-1554
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	C4555-1G
PFA	Carl Roth	0335.3	dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution
PMA	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Polymorphprep	AXIS-SHIELD	AN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	Invitrogen	P7581
RPMI1640	PAA	E 15-848
HBSS with CaCl and Mg	Sigma	H6648
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ml
Trypanblue	Invitrogen	15250-061	0.4% solution
Water	Carl Roth	3255.1	endotoxin-free
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanol	Sigma-Aldrich	33538
10 µL syringe	Hamilton	701 NR 10 µl
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	346136
Ethyl acetate	Carl Roth	7336.2
Canullla 26 G	Braun	4657683
Copper(II)sulphatepentahydrate	Merck	1027805000
Chloroform	Carl Roth	7331.1
CP ATLAS software	Lazarsoftware	2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column	Merck	152022
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster	Hitachi	HITA 892-0080-30Y	Paramaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV Detector	Hitachi	5410
HPLC Column Oven	Hitachi	5310
HPLC Auto Sampler	Hitachi	5260
HPLC Pump	Hitachi	5160
Methanol	Carl Roth	7342.1
n-Hexane	Carl Roth	7339.1
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich	30417
Potassium chloride	Merck	49,361,000
Potters	LAT Garbsen	5 ml
SDS	Carl Roth	CN30.3
HPTLC silica gel 60	Merck	105553
Vacufuge plus basic device	Eppendorf	22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom	Sigma	CLS3548
Coverslip	Thermo Fisher Scientific	1198882
Glass slide	Carl Roth	1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 mL	BD Bioscience	309659