방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

요약

지질은 세포 기능에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 호중구 세포 트랩 형성의 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 얻기 위해 HPTLC 및 HPLC를 모두 사용하여, 콜레스테롤 수준에 중점을두고, 호중구의 지질 구성을 결정하는 방법을 설명합니다.

초록

고성능 박층 크로마토 그래피 (HPTLC)에 의해 수행 지질 지질 분석은 다양한 분석을 비교적 간단하고 비용 효율적인 방법이다. (호스트 병원체 상호 작용 또는 호스트 항목에서 예를 들면) 지질의 기능은 세포 과정에 중요한 역할을하는 것으로보고되고있다. 여기서, 우리는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)와 비교하여 기본 HPTLC 혈액 유래 호중구의 콜레스테롤 수준에 초점 지질 조성의 결정 방법을 도시한다. 목표는 호중구 세포 트랩 (그물)의 형성에 지질 / 콜레스테롤 변화의 역할을 알아보고자 하였다. NET 해제는 호스트 내에 병원균 확산을 방지하기 위해 호스트 방어 메커니즘으로 알려져있다. 따라서, 혈액 유래의 인간 호중구 세포 지질 변형을 유도 메틸 β - 시클로 덱스트린 (MβCD)으로 처리 하였다. HPTLC 및 HPLC를 사용하여, 우리는 세포의 MβCD 처리가 지질에 이르게하는 것으로 나타났습니다셀의 콜레스테롤 함량의 상당한 감소와 관련된 변경. 면역 형광 현미경 같이 동시에, 호중구의 MβCD 처리, 그물의 형성되었다. 요약하면, 우리가 지질 호중구의 변경 및 그물의 형성을 연구하는 구체적인 방법을 제시한다.

서문

지질은 세포의 항상성, 세포 사멸, 호스트 병원체 상호 작용 및 사이토 카인 릴리스 ^1에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 시간이 지남에 따라, 호스트 병원체 상호 작용이나 염증 지질의 영향에 대한 관심과 지식이 증가하고, 여러 출판물 세포 반응의 특정 지질의 중심 역할, 특히 스테로이드 콜레스테롤을 확인합니다. 3- 히드 록시 -3- 메틸 - 조효소-A 환원을 차단하여 콜레스테롤 생합성 억제제로 사용되는 스타틴과 약리 치료 (HMG-CoA를 환원)은 인터류킨의 혈중 농도를 낮춤으로써 같은 항염증제를 작동 할 도 6 및 C 반응성 단백질 ^2. 및 콜레스테롤 - 글리 풍부한 구조는 ^{호스트 (3), (4), (5)에} 대한 게이트웨이로서, 세균 및 바이러스와 같은 여러 병원체에 의해 사용될 수있다클래스 = "외부 참조"> 6. (예를 들어, 스 핑고 마이 엘린)가 도시되어 스핑 고리 피드는 병원성 ^7을 촉진하는 병원균에 의해 사용된다. 대 식세포에서 마이코 박테리아의 사용 세포를 입력하는 도메인을 콜레스테롤이 풍부한; 콜레스테롤의 고갈은 마이코 박테리아 흡수 ^8을 억제한다. 또한, Francisella 야토 (또한 토끼 열이라고도 함) 야토 병을 담당하는 동물 매개 제 ^(9)와 대 식세포가 감염 콜레스테롤 멤브레인 ^{(10)로부터} 고갈 될 때 폐지되었다 감염되었다. 유사하게, 지질 과다 구조를 통해 대장균에 의한 숙주 세포의 침윤 콜레스테롤 의존 ⁴ 것으로 입증되었다. 또한, 상피 세포의 살모넬라 균 감염 실험 콜레스테롤은 세포 ^(11)에 병원균 항목에 대한 필수적이라는 것을 보여 주었다. 콜레스테롤 고갈 inhibite살모넬라 ^(11)의 D 섭취. 또한, Gilk 등의 등의 최근 연구. 콜레스테롤은 Coxiella의 burnetti ^(12)의 흡수에 중요한 역할을한다는 것을 보여 주었다. 또한, 투옹 등. 25 hydroxycholesterol은 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의한 식세포 작용에 중요한 역할을한다는 것을 발견 식세포 ⁽¹³⁾ 전혈. 대 식세포는 약리학 콜레스테롤 ^(14)을 고갈 처리했을 때 식균 작용이 감소되었다. 따라서, 콜레스테롤 등의 지질은 고갈 여러 병원균 ^{10, 11, 12에서} 침략의 위험을 줄일 수 있기 때문에, 감염과 염증에 중요한 역할을 할 것으로 보인다.

최근에, 우리는 호중구 extracellula의 형성, 즉 지질 변화, 세포에서 콜레스테롤 특히 고갈을 보여 유도 할 수 있었다인간 혈액 유래 호중구 ¹⁵ R 트랩 (네트). 2004 년에 그물의 발견 때문에, 세균 함정 수사에 중요한 역할을하는 것으로, 따라서 감염 ^{(16), (17)의} 확산을 방해에있다. 그물 히스톤, 프로테아제, 및 항균 펩타이드 ^16와 연관된 DNA 골격 구성. 호중구 그물의 릴리스는 예컨대 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) 또는 스타틴 ^{16, 20와} 같은 병원균 ^{(18, 19)} 및 화학 물질이 침입하여 유도 될 수있다. 그러나, 자세한 세포 메커니즘과이 과정에서 지질 특히 역할은 아직 완전히 명확하지 않다. 지질의 분석은 그물의 출시로 세포 프로세스와 상호 작용의 다양한에 관여하는 메커니즘을 더 잘 이해 될 수 있습니다. CholesteROL과 스 핑고 마이 엘린은 안정성을 추가하고 단백질 인신 매매 및 이벤트 ⁽²¹⁾ 신호 전달에 관여하는 단백질의 클러스터링을 촉진 세포막과 지질 마이크로 도메인의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 환상 올리고당 메틸 β - 시클로 덱스트린 (MβCD)과 같은 특정 지질 양친되는 약물의 기전 역할을 조사하기 위해, 세포의 지질 성분을 변경하고, 시험관 ⁽¹⁵⁾ 콜레스테롤을 감소 시키는데 사용될 수있다. 여기서는 MβCD에 응답 호중구의 지질 조성 분석 HPTLC를 사용하는 방법을 제시한다. HPLC는 호중구 인구 콜레스테롤의 수준을 확인하는 데 사용되었다. 더욱이, 우리는 MβCD에 응답하여 인간 혈액 유래 호중구 면역 형광 현미경으로 그물의 형성을 시각화하는 방법을 설명한다.

프로토콜

이 프로토콜의 말초 혈액의 수집은 지역의 인간 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다. 모든 사람을 대상으로 자신의 동의서를 제공했다.

밀도 구배 원심 분리에 의해 인간 혈액 유래 호중구 1 격리

1. 인간의 혈액 유래 호중구의 분리
   1. 층 ~ 불꽃 근처 혼합없이 나트륨 diatrizoate / 덱스 트란 용액의 20 mL의 혈액 상을 20㎖.
   2. 브레이크없이 470 XG에서 30 분 동안 원심 분리기.
   3. 단핵 세포와 황색 플라즈마 층을 제거한다. (;도 1 및 2 셀을 집적하여 두 번째 단계) 새로운 50ml의 튜브 및 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 50 ㎖로 채워 다형 핵 세포 (PMN)의 위상을 옮긴다.
   4. 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
   5. 상등액을 제거하고 멸균 5 ㎖ FO에 펠렛을 재현 탁R 5 초는 적혈구를 용균합니다.
   6. 즉시 470 X g에서 10 분 동안 50 ㎖의 1X PBS와 원심 분리기까지 채운다.
   7. 상층 액을 제거합니다. 펠렛은 흰색이어야한다. 여전히 빨간색이면 반복 1.1.5와 1.1.6 단계를 반복합니다.
   8. 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 매체의 1,000 μL에 펠렛을 재현 탁. 광학 현미경 하에서 혈구에 트리 판 블루 염색법을 이용하여 세포 수를 카운트.
   9. 2 × ¹⁰⁶ / ㎖의 농도로 RPMI에 세포 현탁액을 준비한다. 약 2.5 × 10 ⁷ 호중구가 혈액을 20 ㎖에서 수확 될 수있다.
2. 지질 분석을위한 호중구의 약리학적인 치료
   1. 단계 1.1.9에서 5 × 10 ⁷ 세포를 사용합니다. 1.5 mL의 반응 관에 300 μL의 총 부피의 10 mM의 MβCD 25 나노 PMA의 존재 또는 부재하에 순수한 Hank's 균형 염 용액 (HBSS) 배지에서 세포 수를 조정한다.
   2. 에서 샘플을 품어37 ° C에서 2 시간, 5 % CO _2의 반응 튜브.
   3. 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
   4. 상층 액을 제거하고 HBSS 300 μL의 세포 펠렛을 resuspend.
   5. 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
   6. 10 시간 및 종료 1 ml 주사기로 시료를 흡인함으로써, 26-G 캐 뉼러로 균질화하고, -20 ° C에서 샘플들을 저장하는 (1) 클로로포름 / 메탄올 1 mL 중 세포 펠렛을 재현 탁.
3. 면역에 의해 NET 정량 호중구의 약리학적인 치료
   1. 준비 커버 글라스로 48 웰 플레이트를 폴리 -L- 라이신이 코팅.
      1. 각 웰에 한 8 mm 유리 커버 슬립을 배치 멸균 0.01 % 폴리 -L- 라이신의 55 μL를 추가 ~ 실온 (RT)에서 20 분 배양한다.
   2. 1X PBS 200 μL로 두 번 씻으십시오. 필요한 때까지 냉장고에 잘 당 1X PBS 200 μL와 접시를 저장합니다.
   3. 차efully 각 커버 슬립의 중심에 웰당 단계 1.1.9에서 세포 현탁액 (2 × ^{100분의 5} μL) 100 μL를 추가한다.
   4. 최종 10 mM의 MβCD 또는 최종 25 나노 PMA 중 하나를 잘 당 100 μL를 추가합니다.
   5. 브레이크 (370) XG에서 5 분 동안 원심 분리기.
   6. 37 ° C에서 2 시간, 5 % CO ₂ 부화.
   7. 브레이크 (370) XG에서 5 분 동안 원심 분리기.
   8. 4 %의 155 μL PFA로 세포를 고정 파라핀 플라스틱 필름들을 포장하고, 4 ℃ 또는 실온에서 10 분 동안 밤새 보관.
      참고 : MβCD에 의해 유도 NET 형성에 데이터의 경우, 노이만 등의 알을 참조하십시오. ^15.

2. 지질 분리 및 인간의 혈액 유래 호중구 분석

1. 후 Bligh 및 다이어 ²² Brogden 외에 기초하여 인간 말초 혈 유래 호중구로부터 지질을 분리. ⁽²³⁾
   1. 단계 1.2.6에서 호중구를 타고 얼음에 배치합니다.
   2. 얼음에서 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)으로 봉합하여 15 ㎖의 스크류 캡 유리관 (메탄올, 클로로포름 용액에 존재) 호중구 피펫 1 분간 흔들어이를 균질화. 플라스틱 표면에 결합로부터 지질을 방지하기 위해, 유리 튜브를 사용한다. 사용 PTFE 고무 / 플라스틱 오염을 방지하기 위해 캡.
   3. 메탄올 2 mL를 넣고 클로로포름 1 ㎖를 1 분 후에 하였다. 1 분 동안 다시 흔든다.
   4. 유리 튜브 RT에서 30 분 동안 50 rpm으로 회전.
   5. 7 ℃에서 용액을 10 분 동안 1,952 XG 원심 분리하여 단백질 분획을 펠렛.
   6. 조심스럽게 뒤 단백질 함유 펠렛을 떠나, 새로운 15 ML 글래스 나사 캡 튜브에 뜨는을 가만히 따르다. 미래의 정량 -20 ° C에서 펠렛을 저장합니다.
   7. 클로로포름 1 mL를 넣고 1 분간 기다린 이중 증류수 1 mL를 첨가하고 30 초 동안 샘플 유리 스크류 캡 튜브를 반전.
   8. 7 ℃에서 원심 분리하고 10 분 동안 1,952 XG 및 아래, 상부 상을 폐기하지만, 흐린 층을 포함하지 않음.
   9. 필요한 경우, 단계 2.1.8을 반복하여 임의의 추가 정제 단계를 수행한다.
   10. 60 ℃에서 진공 농축기에서 샘플을 건조하고 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관.
2. 고성능 박층 크로마토 그래피 (HPTLC) 콜레스테롤, 인지질 및 스 핑고 마이 엘린을 포함한 여러 지질의 양이 반 - 정량화
   1. 다음 네 가지 실행 솔루션 및 염색 액을 준비합니다.
      1. 용액 1 : 에틸 아세테이트 (26.6 %), 1- 프로판올 (26.6 %), 클로로포름 (26.6 %), 메탄올 (26.6 %)과 염화 칼륨 (9.6 %)을 섞는다. HPLC 품질의 물 100 mL에 0.25 g의 KCl을 용해하여 KCl을 준비.
      2. 용액 2 : n- 헥산 (73 %), 디 에틸 에테르 (23 %) 시트르산 (2 %)을 섞는다.
      3. 용액을 3 : 100 % n- 헥산.
      4. 하여 염색 액을 준비황산동 7.5 g에 증류수 (90 ㎖)에 혼합 한 후 인산 10 mL를 첨가.
   2. 별도의 유리 용기 내의 각각의 용액을 5 mm로 채운다. 각 챔버의 실행 속도를 증가시키기 필터 종이의 종류를 추가합니다.
   3. 주행 용액 플레이트의 상단에 도달 할 때까지 제 1 실황 용액에 20 × 10cm HPTLC 실리카 겔 60 유리판 사전 부화. 이어서 110 ℃에서 10 분 동안 건조시킨다.
      주의 : 이러한 플레이트는 알루미늄 호일에 나중에 사용하기 위해 저장하고 사용하기 전에 110 ℃에서 10 분간 건조시킬 수있다.
   4. 1 : 1의 클로로포름 / 메탄올 200 μL 단계 2.1.10에 의한 지질 펠릿 녹인 용액을 용해하고, 37 ℃에서 15 분 동안 배양한다.
   5. 통치자와 원하는 샘플 수에 대한로드 지점을 표시하는 부드러운 연필, 플러스 적어도 하나 개의 표준을 사용합니다. 마크 주행 거리가 약 4cm 각각 제 1 및 제 2 주행 용액 용 6cm.
   6. 샘플을 로딩하기 위해, 클로로포름 / 메탄올 10 μL 주사기 3 회 반복한다 (1 : 1)에 앞서 각각의 새로운 샘플을 로딩한다. 로드 가능한 작은 영역에 샘플을 농축하려는 각각의 샘플 적가 10 μL. 샘플은 중복 적어도로드해야합니다.
   7. 용액 1 (단계 2.2.1.1)을 실행하여 상기 제 1 챔버로 수직 플레이트를 놓는다. 플레이트를 일정한 이동 속도를 달성하기 위해 유리 챔버의 벽에 평행인지 확인.
   8. 용매 라인이 제 1 마크에 도달하면, 상기 플레이트를 제거하여 건조하고, 제 2 용액에 배치. 두 번째 및 세 번째 실행 솔루션에 대한 유사한 단계를 반복; 용매를 전면 판의 상부에 도달 할 때까지, 상기 용액에두고 판을 1 분 동안 RT에서 제거하고 건조.
   9. 7 초 동안 황산동 용액 플레이트를 놓는다. 철저하게 건조, 플레이트를 제거하고, 170 ℃에서 7 분간 오븐에서 굽는다. 플레이트가 식을 때까지 기다리십시오.
   10. USING 박층 크로마토 그래피 및 겔 분석 소프트웨어뿐만 아니라, 화상 처리 소프트웨어는, 스캔 Brogden 등에 의해 전술 한 바와 같이 분석한다. ^(23).
3. 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 콜레스테롤의 양을 정량화
   1. 5㎛의 / 4.6 mm 가드 카트리지에 100 × 4.6 mm 칼럼을 연결하고 32 ℃로 가열한다. 각 샘플에서 콜레스테롤의 양을 정량하기 위해 65 바에서 1 mL / 분의 유속, 202 nm에서 UV 검출기로 측정 이동상으로서 메탄올을 사용한다.
   2. 펌프를 청소 바늘을 세척, 냄비를 세척, 주사기를 정화, 펌프 퍼지 세척 : 샘플을 분석하고 다음 단계를 수행 철저히 전에 HPLC 시스템을 씻으십시오. 물을 모두 씻어. 마지막 5 분 동안 5 ㎖ / min의 유속으로 메탄올 시스템 퍼지를 수행한다.
   3. 콜레스테롤 표준 곡선을 설정하려면 이르기까지 최소 4 개 농도를 준비0.05 mg 내지 / ㎖로 2 밀리그램 / ㎖의 클로로포름 / 메탄올 콜레스테롤 (1 : 1) ^24.
   4. 클로로포름 / 메탄올 500 μL 단계 2.1.10에서 얻어진 샘플 재현 탁 (1 : 1) 스크류 탑 레드 PTFE / 화이트 실리콘 뚜껑 호박색 1.5 ML 글래스 병이다.
   5. 단계 2.3.3에서 제조 한 표준을 사용하여 콜레스테롤 농도를 정량화.
      참고 : 샘플 다음에 적어도 표준 하나는 음성 대조군을 시작으로 샘플링 프로토콜을 입력합니다.
   6. 곡선 아래의 면적으로서 표현 결과 및 통계 소프트웨어를 사용하여 적절한 샘플 간의 비교.
      주 : 결과는 표준 곡선에 대해 정량화 될 수 있고, 총 콜레스테롤 mL의 양, g, 또는 세포의 숫자로 표시 될 수있다. 표준 곡선의 방정식은 단계 2.3.3에서 얻은 값을 사용하여 계산한다.

그물 3. 시각화 및 정량화

1. 마주그물의 ualization
   참고 : 뉴저지 네츠의 시각화는 노이만 등으로 이전에 출판 작업을 기반으로한다. ^15.
   1. 1X PBS 200 μL와 단계 1.3.8에서 3 회 고정 샘플을 씻는다.
   2. 블록 및 RT에서 45 분 동안 웰 당 PBS로 2 % BSA 100 μL, 0.2 % 트리톤 X-100으로 Permeabilize 하시려면.
   3. 일차 항체 100 ㎕를 추가 마우스 단일 클론 항 DNA 히스톤 1 항체 (2.2 Mg를 재고 희석 / ㎖ 1 : PBS는 2 % BSA 0.2 %를 함유하는 5,000 트리톤 X-100) 또는 마이 엘 로퍼 옥시 다제에 대한 다 클론 항체 (MPO; 토끼 항 MPO 1 희석 : PBS (300)는 2 % BSA 및 0.2 % 트리톤 X-100)을 함유한다. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션.
   4. 1X PBS 200 μL로 3 회 반복한다.
   5. 이차 항체의 100 μL 추가 (1 형광 표지 염소 항 마우스 : BSA-PBS - 트리톤 X-100 및 염소 항 - 토끼에 1000을 1 : 1,000 BSA-PBS - 트리톤 X-100) 1 시간에 대한 어둠 속에서 RT.
   6. 200 & #로 3 회 세척181; 1X PBS의 L.
   7. 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거하고 유리 슬라이드에 DAPI를 포함하는 설치 매체의 3 μL 내려 놓는다.
   8. HCX PL APO 40X 0.75 ~ 1.25 오일 침지 대물 ^(15)를 구비 한 공 초점 반전 계 형광 현미경을 사용하여 샘플을 조사한다.
2. 순수한 개방 핵 정량
   1. 이미지 처리 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ에) 드래그를 열고 도구 모음에 관심이 사진을 놓습니다.
   2. "플러그인", "분석"및 "셀 카운터를 클릭하십시오."
   3. 대향 창에서 "초기화"버튼을 누르고 이의 종류를 선택 (도에 표시되는 예를 들면, 비 방출 셀 황색 8 NET 개방 셀 레드 7 클릭 6B-I 및 II).
      참고 : NET 양성 세포에 대한 기준 : 긍정적으로 얼룩진 녹색 핵 + 덜 조밀 한 nucleuS (분엽 손실) 또는 핵의 원형 + 핵의 증가 된 크기 또는 오프 촬영 뚜렷한 세포의 발생 손실.
   4. 위의 기준에 모든 세포의 부착을 클릭하고 분석 소프트웨어의 데이터 시트로 계산 휴대폰 번호를 작성합니다.
   5. NET-해제 비 방출 셀 카운트 셀 번호를 사용 NET 분비 세포의 비율을 계산한다.

결과

인간 혈액 유래 호중구는 밀도 구배 원심 분리 (도 2)에 의해 단리 하였다. 호중구 지질 변화의 영향을 조사하기 위해, 세포를 세포로부터 콜레스테롤을 고갈 된 10 mM MβCD로 처리 하였다. Brogden 등에 의해 기술 된 바와 같이 계속해서, 지질, 및 후 Bligh 다이어 (도 1, 왼쪽 패널)에 의해 샘플로부터 분리 하였다. ^(23). 준?...

토론

여기에 설명 된 방법은 HPTLC 또는 HPLC에 의해 콜레스테롤과 같은 특정 지질을 분석하고, 네트의 형성에 약리 지질 변화의 영향을 조사하는데 사용될 수있다 (노이만 등. ¹⁵ 참조).

HPTLC 샘플의 다수의 지질의 광범위한 분석을 비교적 비용 효과적인 간단한 방법이다. 이 방법은 항생제 정량화 ^25, 리소좀 저장 질환 ²⁶ 지...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-21070
Anti-MPOα antibody	Dako	A0398
BSA	Sigma-Aldrich	3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber	Celeromics	MF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner	Leica	DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493-1L	Dilute 1:10 in water for 1x working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed	Thermo Fisher Scientific	35503
Excel	Microsoft	2010
DNA/Histone 1 antibody	Millipore	MAB3864
ImageJ	NIH	1.8	http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscope	VWR	630-1554
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	C4555-1G
PFA	Carl Roth	0335.3	dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution
PMA	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Polymorphprep	AXIS-SHIELD	AN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	Invitrogen	P7581
RPMI1640	PAA	E 15-848
HBSS with CaCl and Mg	Sigma	H6648
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ml
Trypanblue	Invitrogen	15250-061	0.4% solution
Water	Carl Roth	3255.1	endotoxin-free
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanol	Sigma-Aldrich	33538
10 µL syringe	Hamilton	701 NR 10 µl
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	346136
Ethyl acetate	Carl Roth	7336.2
Canullla 26 G	Braun	4657683
Copper(II)sulphatepentahydrate	Merck	1027805000
Chloroform	Carl Roth	7331.1
CP ATLAS software	Lazarsoftware	2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column	Merck	152022
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster	Hitachi	HITA 892-0080-30Y	Paramaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV Detector	Hitachi	5410
HPLC Column Oven	Hitachi	5310
HPLC Auto Sampler	Hitachi	5260
HPLC Pump	Hitachi	5160
Methanol	Carl Roth	7342.1
n-Hexane	Carl Roth	7339.1
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich	30417
Potassium chloride	Merck	49,361,000
Potters	LAT Garbsen	5 ml
SDS	Carl Roth	CN30.3
HPTLC silica gel 60	Merck	105553
Vacufuge plus basic device	Eppendorf	22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom	Sigma	CLS3548
Coverslip	Thermo Fisher Scientific	1198882
Glass slide	Carl Roth	1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 mL	BD Bioscience	309659